凝胶中蛋白质的染色

在之前一个名为“蛋白质电泳分离”的视频中，我们演示了如何利用凝胶电泳分离复杂的蛋白质混合物。在本视频中，我们将向您展示四种不同的凝胶染色方法，用于观察蛋白质在凝胶中的位置。大家好，我是来自UVP的Sean Gallagher，目前在KEG研究生院的蛋白质组学中心工作。

今天我将向您展示在电泳分离后用于蛋白质可视化的一系列技术，包括考马斯亮蓝染色、SYPRO Orange 和 SYPRO Ruby。首先让我们从考马斯亮蓝开始。

通过考马斯亮蓝染色在凝胶中检测蛋白质条带依赖于染料的非特异性结合。在此方法中，使用的是考马斯亮蓝G-250。该方法中，聚丙烯酰胺凝胶中分离的蛋白质使用高纯度水进行洗涤。

然后使用水性考马斯亮蓝染色法检测蛋白质的位置。检测限为每条蛋白质条带0.3至1微克。开始时，使用已通过电泳分离蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶。

缓慢振荡条件下，将聚丙烯酰胺凝胶置于盛有 300 毫升高纯水的塑料容器中，静置 5 分钟。弃去液体，第三次洗涤后重复此步骤两次。

倒出水，并加入考马斯亮蓝染色液覆盖凝胶，在缓慢振荡条件下染色1小时。染色1小时后，倒出染色液。用约200毫升水短暂漂洗凝胶，持续30分钟。此时，凝胶可保存在水中，以备后续成像使用。

此时也可将凝胶干燥，以保存永久的凝胶记录。操作时，将凝胶置于两张沃特曼3 mm滤纸上，并用塑料膜覆盖顶部。然后在约80摄氏度的常规凝胶干燥仪中干燥一至两个小时。

另一种蛋白质染色方法是银染法，接下来我们将演示该方法。尽管考马斯亮蓝染色法更简便、快速，但银染法的灵敏度显著更高，其检测限可达0.3纳克BSA。通过银染法在凝胶中检测蛋白质条带依赖于银与蛋白质中多种化学基团的结合。

以下实验方案基于 in Vitrogen 公司的 Silver Quest 银染试剂盒。该方案源自快速染色方案，耗时约 30 分钟，属于多种适用于质谱分析的基于试剂盒的银染化学方法之一。本实验中，我们将在开始银染前使用 in Vitrogen 预制的迷你胶。

务必始终佩戴手套，以避免指纹污染。将凝胶放入可微波加热的托盘中，加入100毫升试剂级水。短暂冲洗后倒去水分。

接下来，加入100毫升固定液，固定液由40%乙醇、10%乙酸溶于高纯水中配制而成，并微波处理30秒。微波处理可通过加速结合与染色过程，缩短所需的孵育步骤。此时，将凝胶置于摇床中，缓慢振荡5分钟。

五分钟后，倒出固定液，加入 100 毫升 30% 乙醇洗涤凝胶，微波处理 30 秒，然后将凝胶置于摇床振荡五分钟。五分钟后，倒出乙醇。现在加入 100 毫升敏化试剂，微波处理 30 秒，然后置于摇床振荡两分钟。

两分钟后，倒出敏化试剂。加入100毫升试剂级水，微波加热30秒，然后置于摇床震荡2分钟。倒出液体，重复一次，共完成两个洗涤循环。

现在加入 100 毫升染色液，微波加热 30 秒，然后缓慢振荡 5 分钟。5 分钟后，倒掉染色液。加入 100 毫升试剂级水，跳过微波处理步骤，直接置于摇床振荡 20 至 60 秒。

弃去水溶液，立即加入 100 毫升显影液，显影至蛋白条带可见。在背景保持清晰的前提下，此过程大约需要 5 到 10 分钟。此时，向显影液中加入 10 毫升终止液，以终止显影，获得最佳结果。

应尽快拍摄凝胶图像，因为颜色强度可能会发生轻微变化，并出现非特异性背景信号的增加。随着时间推移，您所观察的凝胶中会残留蛋白质。电转膜后，应将凝胶干燥以保留永久记录，或将其存放在可密封的塑料袋中。接下来，我们将演示一种对凝胶进行荧光染色的方法。

荧光染料相较于传统蛋白质染色方法具有一系列优势。我们将在此介绍的环丙橙蛋白质凝胶染色法，每条带可检测到一至两纳克的蛋白质。该方法比考马斯亮蓝染色更灵敏，且灵敏度与多种银染技术相当。

荧光染色操作简便，所需人工操作时间少于常规银染方法，且整个过程在1小时之内即可完成。染色后的蛋白质可通过标准的300纳米紫外透射仪或激光扫描仪进行观察。本实验中，我们将再次使用 invitrogen 预制小型凝胶，以制备并利用SDS-PAGE分离蛋白质。

但使用运行缓冲液中0.05%的SDS，而不是通常的0.1%SDS，以降低背景荧光。开始染色步骤时，将环丙沙星橙色荧光染色液倒入一个小的塑料培养皿中，用于一至两个标准尺寸的迷你凝胶。使用约50毫升染色液。

需要注意的是，染色用的培养皿在使用前应彻底清洗并充分冲洗干净，因为任何残留的洗涤剂都会干扰染色过程。现在，将凝胶放入染色液中，并用铝箔覆盖容器，以保护染料免受强光照射。

在室温下轻轻振荡凝胶40至60分钟。弃去染色液，然后用7.5%乙酸溶液冲洗凝胶，时间少于1分钟，使用约100毫升乙酸溶液以去除凝胶表面多余的染料；通过在0.1% Tween 20中孵育过夜，使蛋白质条带显色，随后进行成像和拍照。将荧光标记的凝胶直接放置在标准的300纳米透射光源或蓝光透射光源上。

接下来，我们将介绍一种替代性的荧光染色方法，该方法使用 Cipro ruby 荧光染料。Cipro ruby 染色法最初专为二维凝胶电泳设计，但已被证实是标准一维 SDS 凝胶电泳中最灵敏的蛋白质凝胶染色方法。首先，将凝胶转移至一个大小合适的洁净聚丙烯或聚氯乙烯容器中。

将凝胶置于适量未稀释的 Cipro Ruby 蛋白凝胶染色液中，在转速为 50 RPM 的旋转摇床中持续轻柔振荡孵育。用盖子盖住凝胶，孵育至少三小时。将凝胶转移至洁净的染色皿中，用含 10% 甲醇、7% 乙酸的溶液洗涤一次，回收染色液后将凝胶重新放回摇床上继续振荡 30 分钟。

为了降低背景荧光并提高灵敏度，凝胶现已准备好进行观察和拍照。感谢您观看今天的实验方案。我们向您展示了一系列不同的蛋白质电泳后可视化方法。

有些方法非常灵敏，例如荧光染色和银染，而另一些则是常规方法，例如考马斯亮蓝染色。需要牢记的是，试剂纯度至关重要。使用超纯水也非常关键，此外每一步操作的时间控制也同样重要。

为了获得可重复的实验结果，您需要对此给予密切关注。以上就是全部内容，祝您接下来的实验顺利成功。