Eine digitale mikrofluidische Elektroporationsplattform für CRISPR-Genom-Editierung mit geringem Input und mRNA-Transfektion in Suspensions-T-Zellen und 3D-Zellmodellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die miniaturisierte CRISPR–Cas9-Genom-Editierung des TCRα/β-Rezeptors in primären menschlichen T-Zellen mittels 'DMF-Ection', einer digitalen Mikrofluidik-(DMF)-Elektroporationsplattform. Die Methode ermöglicht parallele, niedrige Eingabe-Genbearbeitung mit hoher Lebensfähigkeit und ist zudem anpassungsfähig für die mRNA-Abgabe in mehrzellige 3D-Sphäroide.

Zusammenfassung

Die digitale Mikrofluidik-(DMF)-Elektroporation ermöglicht eine präzise, geringvolumige genetische Manipulation von Säugetierzellen, wobei der zelluläre Input bis zu 100-fach minimiert und die Lebensfähigkeit erhalten bleibt. Diese Studie präsentiert einen hochdurchsatzbasierten DMF-basierten Transfektions-Workflow für CRISPR-vermittelte Knockout des TRAC-Lokus in primären menschlichen Suspensions-T-Zellen und für die mRNA-Transfektion dreidimensionaler HEK293T Sphäroide. Mit räumlich abgelagerten CRISPR-Leit-RNAs und der On-Cartridge-Ribonukleoprotein-(RNP)-Assemblierung wurde eine effiziente TRAC-Störung sowohl in CD4⁺- als auch CD8⁺-T-Zellpopulationen mit nur 10.000 Zellen pro Bedingung erreicht, wobei die Post-Editing-Viabilitäten über 85 % betrugen. Biophysikalische Charakterisierung mittels strömungsinduzierter und Taylor-Dispersionsanalysen zeigte, dass Polymeradditive Cas9–sgRNA-Komplexe unter Elektroporationspufferbedingungen stabilisieren und reproduzierbare Bearbeitung bei Submikrolitervolumen unterstützen. Der Arbeitsablauf wurde weiter für 3D-Anwendungen angepasst, indem EGFP-mRNA in intakte HEK293T Sphäroide eingetragen wurde, was zu einer robusten und räumlich gleichmäßigen Fluoreszenz führte, ohne das Wachstum oder die Morphologie der Sphäroiden zu beeinträchtigen. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die DMF-Elektroporation eine effiziente Genombearbeitung und mRNA-Lieferung sowohl über Suspensions-Immunzellen als auch über mehrzellige Sphäroide ermöglicht. Diese Plattform bietet eine skalierbare und niedrige Eingabelösung für Anwendungen in der CAR-T-Zelltherapie, funktioneller Genomik und fortschrittlichen 3D-Zellmodellen.

Einleitung

Gen-Editierung in primären menschlichen Zellen wird sowohl für die therapeutische Entwicklung als auch für die Grundlagenforschung zunehmend zentral, einschließlich Anwendungen in der Immuntechnik, der Modellierung seltener Krankheiten und der funktionellen Genomik¹. Obwohl die Elektroporation eine hocheffiziente Genomeditierung ermöglicht, benötigen konventionelle Cuvette-basierte Systeme typischerweise bis zu Millionen von Zellen pro Bedingung, was deren Nutzung für patientenabgeleitete Proben und seltene Immunpopulationen einschränkt². Darüber hinaus sind diese Systeme aufgrund von Einschränkungen bei Durchsatz, Automatisierung und Reagenzienverbrauch^schlecht für großflächige Screenings geeignet.

Die mikrofluidische Elektroporation hat sich als vielversprechender Ansatz für die Genombearbeitung mit geringem Input^{erwiesen 4}. Die meisten bestehenden Plattformen basieren jedoch auf kontinuierlichen Strömungsarchitekturen, die komplexe Flüssigkeitshandhabung, begrenzte Flexibilität beim Reagenzienmischen und relativ hohe Anforderungen pro Bedingung erfordern. Im Gegensatz dazu ermöglicht die digitale Mikrofluidik (DMF) die aktive Manipulation diskreter Nanoliter-Tröpfchen auf einem planaren Elektrodenarray, was eine präzise Steuerung der Reaktionszusammensetzung, des Timings und der räumlichen Lokalisierung ermöglicht. Dieses Plug-and-Play-Tropfenformat eignet sich hervorragend für Workflows mit geringem Volumen und hoher Durchsatzleistung, bei der die Erhaltung von Primärzellen und Reagenzien unerlässlich ist⁵.

Jüngste Arbeiten haben die Machbarkeit einer DMF-basierten intrazellulären Abgabe unter Verwendung von Tri-Tropfen-Elektroporationsarchitekturen gezeigt, die lokale, stromarme elektrische Felder erzeugen, um eine effiziente RNP- und mRNA-Abgabe zu gewährleisten und gleichzeitig thermische und elektrochemische Belastung ^6,7,8 zu minimieren. Auf dieser Grundlage aufbauend wurde eine DMF-Elektroporationsplattform der nächsten Generation entwickelt, genannt 'DMF-Ection', mit 48 unabhängig adressierbaren Reaktionsstellen, vollständiger Automatisierungskompatibilität und skalierbarer Patronenfertigung⁽Abbildung 1). Die DMF-Kartusche besteht aus einer unteren PCB-Platte und einer Kunststoffoberplatte, die durch eine Dichtung getrennt sind und über Ausrichtungsschnappsen in einer einzigen korrekten Ausrichtung zusammengesetzt sind (Abbildung 1A). Das 48-Plex-Layout ist in acht identische Familien organisiert (Abbildung 1A–H), von denen jede sechs unabhängig adressierbare Elektroporationsstellen enthält und bis zu 48 parallele Bearbeitungsbedingungen pro Cartridge unterstützt (Abbildung 1B). Führungs-RNA-Bibliotheken werden vor der Montage der Kartusche mit einem Akustikspender auf die Substratoberfläche aufgebracht. Die Positionsgenauigkeit der Ablagerung wurde an allen 48 Standorten bestätigt, wobei sich die Abwurfpositionen innerhalb einer submillimeterlangen Abweichung vom Elektrodenmittelpunkt (Abbildung 1C) gruppierten (Abbildung 1C), was eine zuverlässige RNP-Montage auf der Kartusche unterstützte. Nach dem Laden werden Zellen und Flüssigkeitselektrodentropfen auf der Kartusche aktiviert, um die Tri-Tropfen-Elektroporationsgeometrie zu bilden (Abbildung 1D). Nach der Elektroporation werden die Zellen in Kulturplatten zur Rückgewinnung und nachgeschalteten Analyse entladen, einschließlich Durchflusszytometrie, Sequenzierung und Mikroskopie (Abbildung 1E). Dieses System ermöglicht eine hocheffiziente Genom-Editierung mit bis zu 100-fach weniger Zellen als Standard-Cuvette-basierte Methoden und erweitert den Zugang zur Genomtechnik in Anwendungen mit geringem Input und hoher Durchsatz erheblich.

Diese Studie bewertet die Leistung der Plattform, indem sie mehrere biomolekulare Ladungen liefert, darunter mRNA- und CRISPR–Cas9-Ribonukleoproteinkomplexe (RNP), wodurch eine effiziente Transfektion und Gendisruption erreicht werden. Neben primären T-Zellen bietet DMF-Ection einen verallgemeinerbaren Rahmen zur Abgabe von Nukleinsäuren in komplexe mehrzellige Strukturen. Dreidimensionale (3D) Sphäroide und Organoid-Typ-Modelle stellen aufgrund ihrer Architektur und Fragilität erhebliche Barrieren für das Eindringen von Reagenzien dar, und konventionelle Elektroporationsmethoden stören oft die Morphologie oder erzeugen heterogene Abgabe. Um zu beurteilen, ob die gleichen miniaturisierten Elektroporationsprinzipien wie bei der T-Zell-Bearbeitung auch auf strukturierte Gewebe angewendet werden, wurde der DMF-Workflow auf 3D-HEK293T Sphäroiden angewandt. Diese Experimente zeigten, dass DMF-basierte Elektrobenetzung intakte Sphäroide innerhalb von Tri-Tropfen-Geometrien sanft positionieren und eine einheitliche mRNA-Abgabe unterstützen kann, während Struktur und Wachstum erhalten bleiben. Obwohl diese Ergebnisse außerhalb des hier beschriebenen primären T-Zell-Protokolls liegen, verdeutlichen sie die breitere Anwendbarkeit programmierbarer DMF-Elektroporation für aufkommende 3D-zelluläre Systeme, die für die Wirkstoffforschung und Krankheitsmodellierung relevant sind.

Protokoll

Die primären menschlichen T-Zellen, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden von kommerziellen Lieferanten unter der Zustimmung des informierten Spenders und in Übereinstimmung mit den geltenden institutionellen, ethischen und regulatorischen Richtlinien bezogen. Der gesamte Umgang mit menschlichen biologischen Materialien erfolgte gemäß institutionellen Biosicherheitsprotokollen. Forscher, die dieses Protokoll umsetzen, sind dafür verantwortlich, sicherzustellen, dass ihre Verwendung primärer menschlicher Zellen den Anforderungen des lokalen institutionellen Überprüfungsausschusses (IRB) oder des Ethikausschusses, den anwendbaren Biosicherheitsvorschriften und allen relevanten nationalen oder regionalen Gesetzen zur Verwendung menschlichen biologischen Materials entspricht. Mit dem in dieser Studie verwendeten Zellmaterial waren keine patientenidentifizierbaren Informationen verknüpft.

1. Präparation und Aktivierung primärer menschlicher T-Zellen

1. Taue kryokonservierte primäre menschliche CD3⁺-T-Zellen schnell in einem 37 °C Wasserbad. Die Zellen werden in vorgewärmtes basales T-Zellmedium übertragen und 10 Minuten lang bei 180 × g zentrifugiert. Verwerfen Sie das Supernatant und lassen Sie das Pellet in frischem Medium wieder aufhängen.
2. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und -lebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler.
3. Resuspendieren Sie die Zellen bei 1 × 10^{6 Zellen} /mL in einem T-Zell-Kulturmedium, ergänzt mit einem löslichen tetramerischen Antikörper CD3/CD28 T-Zell-Aktivatorstimulus (gemäß Herstelleranweisung) und 200 IU/mL IL-2. Zellen 72 Stunden lang bei 37 °C inkubieren, 5 % CO₂.
   HINWEIS: Halten Sie die Zelldichte während der Aktivierung zwischen 0,5–2 × 10⁶ Zellen/mL. Aktivierung in U-unteren 96-Well-Platten führen Sie durch, um den Kontakt zwischen Zelle und Aktivator sowie die Aktivierungseffizienz zu optimieren.

2. Vorbereitung von Leit-RNA-Punkten auf dem DMF-Substrat (akustisches Dispenser-Spotting)

1. Replizierte lyophilisierte sgRNA in nukleasefreiem Wasser auf eine Lagerkonzentration von 100 μM. In einem separaten Röhrchen bereiten Sie einen 100 mg/mL Vorrat Poly-L-Glutaminsäure (PGA, Natriumsalz, MW 15.000–50.000 Da) in nukleasefreiem Wasser vor. Kombinieren Sie sgRNA- und PGA-Bestand mit einem Volumenverhältnis von 5:4 (sgRNA: PGA), was eine endgültige sgRNA-Konzentration von 55,6 pmol/μL und eine endgültige PGA-Konzentration von 44,4 mg/mL in nukleasefreiem Wasser ergibt. Vortex kurzzeitig und Zentrifugieren bei 1.000 × g für 30 Sekunden, Aliquot in Einmalmengen und ungenutzte Aliquots bei −80 °C bis zu 6 Monate lagern.
   HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
2. Fügen Sie die Guide-PGA-Mischung auf eine akustische Quellplatte mit niedrigem Dead-Volume in Brunnen hinzu, die dem gewünschten Reaktionsstellenlayout entsprechen.
3. Übertragen Sie 40 nL (entspricht 2,2 pmol sgRNA) der Guide-PGA-Mischung in jede Ziel-Spotting-Region des DMF-Substrats mit einem kalibrierten Akustikspender.
   HINWEIS: Bei 55,6 pmol/μL liefert 40 nL 2,2 pmol sgRNA pro Stelle (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Getrocknete Führungen werden beim Tropfenzusammenführen auf der Kartusche wieder zusammengesetzt; Eine vollständige Wiederherstellung wird durch eine konstante Bearbeitungseffizienz über alle Seiten hinweg bestätigt.
4. In einem biologischen Sicherheitsschrank lassen Sie die gefleckten Tröpfchen vollständig bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen, bis keine sichtbare Flüssigkeit mehr übrig bleibt (ca. 5 Minuten).
   HINWEIS: Verwenden Sie keinen erzwungenen Luftstrom oder Hitze, da dies die Führungs-RNA lösen oder abbauen kann.
5. Setze die DMF-Kartusche zusammen.
   1. In einem biologischen Sicherheitsschrank richtet man die obere Platte über dem gepunkteten Substrat aus, indem man die asymmetrischen Kunststoff-Snap-Merkmale von der oberen Platte mit den Kerben an der unteren Platte abgleicht. Üben Sie gleichmäßigen, gleichmäßigen Druck entlang der kurzen Kanten aus, bis ein deutlicher mechanischer Schnapp spürbar ist, um das vollständige Eingreifen der Verriegelungsfunktionen zu bestätigen.
      HINWEIS: Die Patrone ist mit einer einzigen korrekten Ausrichtung konstruiert; Falsche Montage führt nicht zu dem Snap. Halten Sie die Substrate jederzeit an den Rändern, um Verunreinigungen oder Schäden an funktionalen Oberflächen zu vermeiden und zu vermeiden, dass die Substrate gegeneinander rutschen, da dies die Oberflächenbeschichtungen zerkratzen könnte.
   2. Checkpoint: Bestätigen Sie die korrekte Montage durch den mechanischen Druckknopf.
      HINWEIS: Es gibt keinen elektrischen Vorlaufindikator für die Beschichtungsintegrität; etwaige funktionale Ausfälle, die durch eine fehlerhafte Montage entstehen, werden automatisch erkannt und im nachträglichen Qualitätskontrollbericht gemeldet.
      Pausepunkt: Bewahren unbenutzte montierte Kartuschen in einer versiegelten Verpackung mit Trockenmittel (Siliziumgelpäckchen) bei Raumtemperatur bis zu 48 Stunden auf.

3. Zellvorbereitung

1. Bereiten Sie vor jeder Anwendung 1 ml Complete Transfction Buffer frisch vor, indem Sie einen DMF-kompatiblen Elektroporationspuffer mit dem bereitgestellten biokompatiblen nicht-ionischen Tensid im Verhältnis 20:1 (v/v) kombinieren (Elektroporationspuffer: Tensid), was eine Endkonzentration von 0,05 % (v/v) ergibt. Sanft verrühren und auf Eis legen.
   HINWEIS: Der hier verwendete DMF-kompatible Transffektionspuffer ist ein isotoner Puffer mit niedriger Leitfähigkeit (Leitfähigkeit: 3,5 mS/cm, Osmolalität: 305 mOsm/L). Forscher, die alternative Puffer verwenden, sollten die Kompatibilität mit der DMF-Aktivierung und der Zellviabilität überprüfen. Das biokompatible nicht-ionische Tensid dient dazu, Tröpfchenstiftungen zu reduzieren; wird das bereitgestellte Tensid nicht verwendet, ein geeigneter Ersatz.
2. Waschen Sie aktivierte T-Zellen einmal mit Transfektionspuffer (ohne Tensid). Zentrifugiere mit 180 × g für 5 Minuten, aspiriere das Supernatant und suspendiere das Zellpellet in einem vollständigen Transfektionspuffer (mit Tensid) bei 1,0 × 10^{7 Zellen} /mL in einem Gesamtvolumen von 100 μL pro Kartusche. Bleib auf Eis.
3. Unmittelbar vor dem Laden auf die Kartusche wird Cas9-Nuklease direkt zu den 100 μL T-Zell-Suspension gegeben und durch sanftes Pipettern gemischt; Bleib auf Eis.
   HINWEIS: Für primäre T-Zellen wird Cas9 mit 42 pmol pro 100 μL Patronenvolumen (0,42 pmol/μL) geladen. Jede Elektroporationsstelle verarbeitet etwa 1 μL Zellsuspension und liefert 0,42 pmol Cas9 pro Edit. Optimieren Sie diese Dosierung, wenn Sie sich an andere Immunzelltypen anpassen (siehe Tabelle 1).

Komponente	Endgültige Konzentration pro Bearbeitung
Cas9	0,42 pmol in ~1 μL Tropfen
sgRNA	2,1 pmol (aus 40 nL Spot)
PGA	44,4 mg/mL Fond in Spotting-Mischung
Tensid	0,05 % (v/v)
Zelleingabe	~10.000 Zellen

Tabelle 1: Zusammenfassende Tabelle der Endkonzentrationen in jedem Transfektionstropfen.

4. Transfektion auf der DMF-Eckionsplattform

1. Mit einer Mehrkanal-Pipette wird 10 μL des T-Zellen/Cas9-Gemisch in jeden der 8 Zellen-Ladeports und 10 μL vollständigen Transfektionspuffer in die 16 Flüssigkeitselektroden-Ladeports (wie in Abbildung 1 dargestellt) gegeben.
2. Stellen Sie die Spannung auf 500 V, die Pulsdauer auf 3 ms und die Anzahl der Impulse auf 2 ein. Initiieren Sie die Elektroporationssequenz gemäß den Plattformanweisungen.
   1. Checkpoint: Überprüfen Sie den QC-Bericht nach dem Durchlauf unmittelbar. Sporadische Versagen (<10 % der Standorte) erfordern keine Intervention. Wenn die Fehler systematisch sind, ersetzen Sie die Kartusche durch die mitgelieferte Qualitätskontrolle, führen Sie die System-Gesundheitsprüfung durch (~2 Min) und wenden Sie sich an den technischen Support, falls die Probleme bestehen.

5. Entlastung und Wiederherstellung bearbeiteter T-Zellen

1. Mit einem Flüssigkeitsbehandler werden elektroporierte Zellen von jeder Reaktionsstelle in eine 96-Well-U-Bodenplatte mit 150 μL vorgewärmtem basalem T-Zellmedium mit 200 IU/mL IL-2 übertragen.
2. Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂, um den Proteinwechsel und Veränderungen der Oberflächenrezeptorexpression zu ermöglichen.

6. Flowzytometrieanalyse des TRAC-Knockouts

1. Transfert der Zellen auf eine sterile 96-Well-konische Bodenplatte, um den Zellverlust zwischen den Washes zu reduzieren. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2 % FBS, 2 mM EDTA) durch Zentrifugation bei 400 × g für 5 Minuten und Entfernen des Überlagerungsmittels durch vorsichtiges Invertieren der konischen Bodenplatte. Die Zellen bleiben in der Platte pelletiert.
2. Bereiten Sie eine Oberflächenfärbungs-Mastermischung mit Anti-CD4-, Anti-CD8- und Anti-TCRα/β-Antikörpern in einem Flow Cytometry Buffer in herstellerempfohlenen Konzentrationen vor. Fügen Sie pro Brunnen 25 μL des Master-Gemisch hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten bei 4 °C, geschützt vor Licht. Waschen Sie zweimal mit 1× PBS (ohne FBS) durch Zentrifugation bei 400 × g für 5 Minuten. Cellen in 100 μL 1× PBS mit einem Viabilitätsfarbstoff bei 1:1.000 (v/v) neu suspendieren und 10 Minuten bei lichtgeschützter Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Kegelförmige Bodenplatten sind effektiv beim Pelletieren von Zellen; Überprüfen Sie, ob die Zellen in allen Schritten gut aufgehängt sind.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Flowzytometriepuffer und suspendieren Sie sie in 150–200 μL pro Probe zur Aufnahme.
4. Konfigurieren Sie das Zytometer mit geeigneten Laserleitungen und Filtersätzen für die verwendeten Fluorochrome (z. B. 488 nm Anregung für Wirksamkeitsfarbstoff; 405 nm oder 488 nm für Oberflächenmarker, je nach Anwendung). Stellen Sie die Spannungen mit Single-Stain-Kompensationskontrollen und einer unverfärbten Probe ein. Sammeln Sie mindestens 5.000 Live-Singlet-Events pro Probe. Gatet sequentiell auf: Streu-Singlets → lebenden Zellen (Viability-Farbstoff-negativ) → CD4⁺ oder CD8⁺ → TCRα/β-Expression.
   HINWEIS: Unter Standardbedingungen können die insgesamt erfassten Live-Ereignisse zwischen 5.000 und über 10.000 pro Probe liegen, nachdem die Zellen beim Waschen und Färben verloren haben, vorausgesetzt, die Zellen hatten Zeit zur Vermehrung.
5. Bestimmung der TRAC-Genstörung durch Messung der Häufigkeit von TCRα/β-negativen Zellen in den CD4⁺- und CD8⁺-Populationen. Berichte die Knockout-Effizienz als Prozentsatz der TCRα/β-negativen Zellen relativ zum Live-Singlet-Gate für jede Teilmenge.

Ergebnisse

Erwartete Ergebnisse
Die Elektroporation von 10.000 aktivierten T-Zellen pro Bedingung führt typischerweise zu >85 % TRAC-Knockout-Effizienz mit >95 % Lebensfähigkeit 72 Stunden nach der Transfektion. Die Durchflusszytometrie zeigt einen deutlichen Verlust der TCRα/β-Färbung im TRAC-Zielzustand im Vergleich zu nicht-zielenden sgRNA-Kontrollen (NTC) und Kontrollen, die keinem elektrischen Feld ausgesetzt sind. Sofern nicht anders angegeben, steht n für unabhän...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen miniaturisierten digitalen mikrofluidischen Elektroporations-Workflow, der eine effiziente intrazelluläre Abgabe in primäre menschliche T-Zellen mit nanolitergroßen Tröpfchen ermöglicht. Ein zentraler Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, die CRISPR–Cas9-Genom-Editierung mit nur 10.000 Zellen pro Reaktion durchzuführen, was den Materialbedarf im Vergleich zur herkömmlichen Elektroporation deutlich reduziert. Die tropfenbasierte Architektur unterstü...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentierung
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid-Protokoll
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid-Protokoll
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentierung
DMEM Media	Gibco	10564011	Media-Supplement- Spheroid-Kultur
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfektion
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentierung
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluoreszierendes Mikroskop	ThermoFisher		Instrumentierung
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media-Supplement- Spheroid-Kultur
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentierung
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Zellen	ATCC		Spheroid-Protokoll
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T-Zell-Medien-Supplement
Human Primary Pan CD3+ T Zellen	All Cells		Peripheres Blut, kryokonserviert, pan CD3+ Helfer-T-Zellen, negativ selektiert
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T-Zell-Aktivierungsmedium
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T-Zell-Aktivierungsmedium
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentierung
INTEGRA ASSIST PLUS Pipettierroboter	Integra	4505, 4-Positionen Porträt Deck (PN 4521),	Instrumentierung
nicht zielgerichtete synthetische Leit-RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)	Gibco	15140122	Media-Supplement- Spheroid-Kultur
Poly-L-Glutaminsäure (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Verwenden Sie bei 100 mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuklease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid-Protokoll
Surfactant F	DropGenie		Transfektion- verwenden Sie 1:20 in DMF kompatiblem Puffer, um das vollständige Transfektionspuffer herzustellen
TRAC synthetische Leit-RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot	Gibco	25-300-062	Spheroid-Protokoll