Herstellung und chirurgische Anwendung von angereicherten, fotovernetzten Gelatine-Riboflavin-Hydrogelen zur Reparatur von Hornhautwunden bei Kaninchen

Zusammenfassung

Ein reproduzierbares Protokoll wird für die Herstellung, Anreicherung und Anwendung eines in situ blaulicht-kreuzvernetzbaren Gelatine-Ribollavin-Hydrogels zur Reparatur von hornhautstromaler Wunden bei Kaninchen vorgestellt, einschließlich prozeduraler Schritte für chirurgische Handhaben, partielle Tarsorrhaphie und postoperative Betreuung.

Zusammenfassung

Dieser Artikel präsentiert ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung eines in situ vernetzbaren Gelatine-Hydrogels zur Reparatur von hornhautstromalen Wunden bei Kaninchen. Der Hydrogel-Vorläufer besteht aus Gelatine mit 5 % (w/v) und Riboflavinphosphat mit 0,01 % (w/v), das unter sterilen und lichtgeschützten Bedingungen hergestellt, steril gefiltert und vor der Anwendung erwärmt wird, um eine injizierbare Viskosität zu erreichen. Die optionale Einbindung von humanem Amnionmembranextrakt oder kaninchenautologem Serum wird detailliert beschrieben. Die Gelation auf Abruf wird auf der Augenoberfläche mit blauem Licht bei λ = 420–480 nm für insgesamt 2 Minuten ausgelöst. Die In-vivo-Methode umfasst eine reproduzierbare vordere stromale Keratektomie (Trephindurchmesser 6,5 mm; Tiefe ca. 187 μm), gefolgt von Hydrogelfüllung, leichter Aktivierung und einer partiellen lateralen Tarsorrhaphie zur Stabilisierung der Behandlung, zur Förderung der Wundheilung und zur Standardisierung der postoperativen Versorgung. Repräsentative in-vitro-Ergebnisse zeigen gelartiges viskoelastisches Verhalten mit Scherverdünnung und schneller Erholung sowie eine hohe optische Transmissivität (> 90 %) über 500 nm, was auf die Eignung für den Hornhautgebrauch hinweist. In vivo unterstützen hydrogelbasierte Behandlungen einen progressiven Epithelverschluss, eine gute Augentoleranz (niedrige Draize-Werte nach 3 und 7 Tagen) sowie einen zeitabhängigen Verlust sichtbaren Hydrogels, der mit biologischem Abbau und Gewebeersatz vereinbar ist. Kritische Schritte und Pausenpunkte werden hervorgehoben, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen, darunter Temperaturregelung während Auflösung und Filtration, Lichtschutz und Lampenpositionierung während der Vernetzung. Das Protokoll ermöglicht nahtfreie, präzise platzierte, lichtaktivierte Hydrogel-Stabilisierung, die mit der Zugabe mehrerer bioaktiver Nahrungsergänzungsmittel kompatibel ist. Es bietet eine praktische Grundlage für die präklinische Bewertung der nächsten Generation ophthalmischer Biomaterialien und erleichtert die Übertragung von photovernetzbaren Hydrogeltherapien zur Reparatur von Hornhautwunden.

Einleitung

Die Hornhaut ist eine transparente, avaskuläre Struktur, die etwa zwei Drittel der Brechungskraft des Auges ausmacht, was ihre strukturelle und funktionelle Integrität für das Sehvermögen unerlässlich macht¹. Aufgrund ihrer direkten Exposition gegenüber der Außenwelt ist die Hornhaut sehr anfällig für Traumata, Infektionen, chemische Schäden und postoperative Komplikationen ^2,3. Das Versäumnis, die Epithelintegrität schnell und effektiv wiederherzustellen, kann zu anhaltenden Epitheldefekten (PEDs) und chronischen Hornhautgeschwüren führen, was letztlich zu Stromalschmelzen, Perforation, Narbenbildung und irreversiblem Sehverlust^führt. Konventionelle Therapien – einschließlich Gleitmittel, antibiotische Prophylaxe und autologe serumhaltige Augentropfen – bieten oft nur einen teilweisen Nutzen und fördern die Stromalreparatur bei mittelschweren bis schweren Defekten ^6,7,8 nicht ausreichend.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben sich biomaterialbasierte Therapien als vielversprechende Alternativen etabliert, da sie die Wunde schützen, die Epithelreparatur unterstützen und Stromalgewebe wiederherstellen ^können. Hydrogele sind besonders attraktiv wegen ihrer Biokompatibilität, optischen Transparenz, abstimmbaren mechanischen Verhaltens und der Fähigkeit, therapeutische Wirkstoffe einzubinden. Sowohl natürliche als auch synthetische Hydrogele, darunter Gelatine 15,16,17, Kollagen^18,19, Chitosan^20,21, Polyethylenglykol (PEG)^22,23 und Hyaluronsäure^18,24, haben ein Potenzial zur Förderung der Hornhautwundheilung nachgewiesen. Unter diesen sind gelatinebasierte Hydrogele besonders wertvoll aufgrund ihrer kollagenbasierten Zusammensetzung und der intrinsischen Zelladhäsionsmotive.

Photocrosslinkable Hydrogele bieten einen zusätzlichen Vorteil, da sie eine Bedarfsverfestigung direkt auf der Augenoberfläche ermöglichen, was eine präzise Platzierung und verbesserte mechanische Stabilität ohne Nähte ermöglicht. Riboflavin-vermittelte Vernetzung, ursprünglich für die Behandlung mit Keratokonus entwickelt, wurde kürzlich aufgrund ihrer hervorragenden Biokompatibilität, ophthalmischer Sicherheit und der Fähigkeit, reaktive Sauerstoffspezies zu erzeugen, die Crossvernetzung unter sichtbarem oder UV-Licht induzieren, für die Hydrogel-Photopolymerisation angepasst. Blaues Licht (≈445 nm) ist besonders vorteilhaft für Hornhautanwendungen, da es effiziente Vernetzung ermöglicht und UV-assoziierte Risiken^{vermeidet 27,28,29}.

Dieser Artikel stellt die Herstellung, Anreicherung und chirurgische Anwendung eines photocrosslinkablen Hydrogels vor, das aus 5 % (w/v) Gelatine und 0,01 % (w/v) Riboflavinphosphat (RFP) besteht. Ein detailliertes Protokoll für die In-vitro-Hydrogelpräparation ist vorgesehen, einschließlich optionaler Einbindung von humanem Amnionmembranextrakt (HAMe) oder autologem Serum (AS) sowie in vivo Anwendung in ein Kaninchenstromalkeratektomie-Modell. HAMe ist dafür bekannt, entzündungshemmende, antifibrotische und proregenerative Wirkungen auf die ^{Augenoberfläche zu haben, während} autologes Serum tränenartige Konzentrationen von Vitamin A, EGF, Fibronectin und anderen für die epitheliale Regeneration wesentlichen Faktoren^liefert. Zusammen unterstützen diese Elemente die Re-Epithelialisierung, reduzieren Entzündungen und verhindern potenziell den Stromabbau ^39,40.

Obwohl der beschriebene Ansatz kontrollierte Photopolymerisation und anpassbare Bioaktivität ermöglicht, ist seine Anwendbarkeit derzeit auf oberflächliche und mittlere stromale Defekte beschränkt und erfordert eine Sichtlinienexposition gegenüber blauem Licht, was die Nutzung in undurchsichtigen oder tief infiltrierten Geweben einschränken kann. Durch die Integration von Hydrogel-Präparation und -Anreicherung, ophthalmologischer Behandlung und postoperativer Versorgung, einschließlich partieller lateraler Tarsorrhaphy, bietet dieses Papier einen reproduzierbaren Ansatz, der die Hornhautreparatur unterstützt, die Übertragung lichtaktivierter Hydrogel-Technologien in die klinische Praxis erleichtert und zur Entwicklung standardisierter Plattformen für hornhautregenerative Forschung beiträgt.

Protokoll

Menschliche Plazenta wurden von Spendern mit informierter Zustimmung entnommen, gemäß der Erklärung von Helsinki und mit Zustimmung des Ethikausschusses des Universitätskrankenhauses von Cruces (Genehmigungsnummer CEIC E15/03). Alle Tierversuche wurden vom Ethikkomitee für Tierforschung der Universität des Baskenlandes (UPV/EHU) genehmigt (Genehmigungsnummer CEEA M20/2023/038) und entsprachen der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Alle Verfahren wurden in der UPV/EHU-Tieranlage (SGIker) durchgeführt, wobei die sterile Technik während der gesamten Zeit (Klasse-II-Biosicherheitsschrank beim Umgang mit biologischen Produkten) beibehalten wurde.

1. Hydrogel-Synthese

1. Gelatine-Riboflavin-Vorläuferlösungen (5 % und 10 % w/v)
   HINWEIS: Arbeiten Sie bei schwachem Licht oder verwenden Sie bernsteinfarbene Flaschen oder in Alufolie eingewickelte Flaschen, um die Lösung vor Lichteinwirkung zu schützen. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Flusshaube aus, wenn das Hydrogel für biologische Zwecke gedacht ist.
   1. Wägen Sie die erforderlichen Mengen an Gelatine und Riboflavinphosphat (RFP): Für 10 ml mit 5 % (w/v) + 0,01 % (w/v) RFP-Vorläufer, 500 mg Gelatine und 1 mg RFP. Für 30 ml mit 10 % (w/v) + 0,02 % (w/v) RFP-Bestand wiegen Sie 3 g Gelatine und 6 mg RFP.
   2. Gib die Gelatine und RFP dem entsprechenden Volumen deionisierten Wassers (≈90 % des Endvolumens) zu. Rühre vorsichtig um, bis das Pulver vollständig verteilt ist.
   3. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 7,0 ein, fügen Sie die Basis tropfweise hinzu und überwachen Sie den pH-Wert. Zeichnen Sie das verwendete NaOH-Volumen und das endgültig angepasste Volumen auf. Nach der pH-Anpassung bringen Sie die Lösungen mit deionisiertem Wasser auf ihr Endvolumen.
   4. Lösen und homogenisieren Sie die Lösung bei 80 °C unter magnetischem Rühren bei 200 U/min für 30 Minuten.
      HINWEIS: Heiße Lösungen (>70–80 °C) mit hitzebeständigen Handschuhen handhaben.
   5. Lassen Sie die Lösungen auf 30–40 °C abkühlen und filtern Sie sie durch 0,22 μm Polyethersulfon (PES) hydrophile Membranfilter in sterile Bernsteinflaschen.
      HINWEIS: Erwärmen Sie viskose Lösungen vorsichtig (≈ 40–50 °C), falls erforderlich; vermeiden Sie Überhitzung.
   6. Beschriften Sie die Flaschen mit Zusammensetzung, Datum und Initialen des Bedieners. Bewahren Sie die gefilterten Hydrogellösungen bis zur Verwendung bei 4 °C auf und achten Sie darauf, dass die Lagerzeit ab dem Zeitpunkt der Zubereitung nicht mehr als 2 Wochen dauert.
2. Ergänzte Gelatine-Hydrogele (Endvolumen: 10 mL)
   1. Bereiten Sie autologes Serum (AS) oder humanes Amnionmembranextrakt (HAMe) nach den in den Abschnitten 4 und 5 beschriebenen Verfahren vor. Halten Sie die Extrakte steril und gekühlt bis zur Verwendung.
   2. Für jede 10 ml angereichertes Hydrogel mischen Sie 5 ml des 10 % (w/v) Gelatine- + 0,02%-RFP-Lagers und 5 ml des entsprechenden biologischen Extrakts (AS oder HAMe).
      HINWEIS: Erwärmen Sie viskose Lösungen vorsichtig (≈ 40–50 °C), falls erforderlich; vermeiden Sie Überhitzung.
   3. Filtern Sie die warme Lösung durch einen 0,22 μm PES-hydrophilen Membranfilter in sterile bernsteinfarbene Flaschen.
   4. Etikettieren und lagern Sie die Hydrogele bei 4 °C bis zur Verwendung. Stellen Sie sicher, dass die Lagerzeit nicht mehr als 2 Wochen ab der Zubereitung liegt.
      HINWEIS: Entsorgen Sie alle Abfälle gemäß institutionellen Biosicherheitsvorschriften.

2. Hydrogel-Anwendung in vitro

1. Bereiten Sie die Hydrogel-Formulierungen wie in Abschnitt 1 beschrieben vor und halten Sie sie vor der Anwendung bei 32 °C, um eine ausreichende Viskosität zu gewährleisten.
2. Mit steriler Technik pipettieren Sie das erforderliche Hydrogelvolumen in den Zielbrunnen, die Form, das Gericht oder das Substrat (Abbildung 1A).
3. Positionieren Sie die LED-C-Aushärtungslampe 2 cm über der Hydrogeloberfläche. Initiieren Sie die In-situ-Vernetzung , indem das Hydrogel dem blauen Licht ausgesetzt wird (λ = 420–480 nm) und einer Lichtleistung von 850–1000 mW/cm^² für eine Gesamtdauer von 2 Minuten. Die Beleuchtung wird als sechs Pulse à 20 s abgegeben, wobei zwischen den Impulsen 5–10 Sekunden pausiert werden, um lokale Erwärmung zu verhindern (Abbildung 1B).
4. Überprüfen Sie die vollständige Gelierung visuell und durch vorsichtiges Berühren der Oberfläche mit einem sterilen Instrument, um die Bildung eines festen, manipulierbaren Hydrogels sicherzustellen (Abbildung 1C, D).
5. Verwenden Sie das gekreuzte Hydrogel sofort oder lagern Sie bei 4 °C unter sterilen Bedingungen, die für die nachgelagerte Anwendung geeignet sind.
   HINWEIS: Halten Sie während des gesamten Eingriffs die aseptische Technik aufrecht. Vermeiden Sie eine direkte Exposition von Haut oder Augen gegenüber Blaulichtstrahlung.

3. Beschaffung der menschlichen Amnionmembran (HAM)

HINWEIS: Verwenden Sie nur Plazentas von seronegativen Spendern, die eine informierte Zustimmung gegeben haben und institutionelle sowie ethische Anforderungen erfüllen.

1. Anspruchsberechtigung und Zustimmung des Spenders
   1. Bestätigen Sie, dass jeder Spender auf HIV Typ 1 und 2, Hepatitis B und C sowie Syphilis getestet wurde und negativ getestet wurde.
   2. Holen Sie vor der Operation eine schriftliche informierte Zustimmung von jedem Spender ein.
   3. Erreichen Sie menschliche Plazenta unmittelbar nach elektiven Kaiserschnitten gesunder Spender.
2. Sammlung und Erstbearbeitung
   1. Sammeln Sie jede Plazenta unmittelbar nach der Geburt in einem sterilen Edelstahlbehälter.
   2. Im Operationssaal wird die Plazenta ausgiebig mit steriler Kochsalzlösung gespült, um Blutgerinnsel zu entfernen. Identifizieren Sie das Amnion – die innerste transparente Membran, die die Amnionhöhle auskleidet – und trennen Sie es vorsichtig vom Chorion, indem Sie mit steriler Zange sanft zur Plazentakante hin abziehen.
      HINWEIS: Behandle die Membranen vorsichtig, um Risse zu vermeiden.
   3. Nach vollständiger Trennung werden sterile Nitrocellulose-Filterstücke an der stromalen Oberfläche des HAM befestigt, um die Manipulation zu erleichtern und die Teilung zu standardisieren. Unterteilen Sie den HAM in drei definierte Bereiche (Abbildung 2A,B): distale Amnion: 10 cm breiter Schnitt, medialer Amnion: 10 cm breiter Schnitt, proximale Amnion: Querschnitt, der bis zum Platz reicht.
3. Verkehr
   1. Geben Sie jedes HAM-Fragment in eine sterile Flasche und tauchen Sie es in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ein, ergänzt mit 1,25 μg/mL Amphotericin B, 50 μg/mL Penicillin-Streptomycin und 50 μg/mL Neomycin.
   2. Kennzeichnen Sie jede Flasche klar mit Spendercode, Datum und Herkunftsregion (distal, medial oder proximal).
   3. Die Proben werden sofort unter sauberen und aseptischen Kühlbedingungen (4 °C) ins Labor transportiert.
      HINWEIS: Transportieren Sie die Membranen in versiegelten, dreifach verpackten Verpackungen, die den UN 3373 (Biologische Substanz, Kategorie B) entsprechen, gemäß den institutionellen Biosicherheitsvorschriften für menschliches Gewebe.
4. Laborverarbeitung
   HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II unter sterilen Bedingungen durch.
   1. Schneiden Sie jedes distale, mediale und proximale HAM-Fragment mit einer sterilen Schere in Quadrate von 4,0–4,5 × 4,0–4,5 cm.
   2. Tauchen Sie die Fragmente in das bereits erwähnte antibiotikumhaltige DMEM ein und bürsten Sie vorsichtig mit sterilen Klammern, um Blutrückstände zu entfernen. Waschen Sie sie in DMEM mit 50 μg/mL Penicillin-Streptomycin für 2 x 5 Minuten.
   3. Waschen in DMEM ohne Antibiotika für 2 x 5 Minuten.
   4. Waschen Sie diese ausgewählten Fragmente in steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   5. Jedes Fragment wird in ein 5-mL steriles Rohr ohne Kulturmedium übertragen. Die Proben werden direkt bei –80 °C eingefroren, bis es weiterverwendet wird.

4. Herstellung von humanem Amnionmembranextrakt (HAMe)

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter aseptischen und kalten Bedingungen durch, um den Proteinabbau und die Kontamination zu minimieren.

1. Holen Sie die Röhren mit menschlichen Amnionmembranfragmenten (HAM) heraus, die bei −80 °C gelagert sind. Tauchen Sie die Röhren für 5 Minuten in flüssigen Stickstoff ein, um das Gewebe zu verhärten.
2. Geben Sie jedes gefrorene Fragment in einen vorgekühlten Mörser (−80 °C) und zerkleinern Sie ihn gründlich mit einem Stößel, bis ein weiches, homogenes Pulver entsteht.
3. Wiegen Sie die pulverisierte Probe sofort auf einer Waageplatte, um das Auftauen zu minimieren. Geben Sie das gewogene Pulver in ein 5-mL-Rohr und suspendieren Sie es in 3 mL PBS, ergänzt mit einem 5 μL/mg Proteaseinhibitor-Cocktail.
   HINWEIS: Lassen Sie während der Verarbeitung alle Schläuche auf Eis, um die Proteinintegrität zu erhalten.
4. Sonikieren Sie jede Probe 20 Minuten lang bei 90 % Amplitude mit dem Sonikator und der 1,5 mm Durchmesser-Sonde und wenden Sie 15 s Ein/15 S Aus-Zyklen an, um Überhitzung zu verhindern.
5. Zentrifugieren Sie die Lysate bei 3.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C. Sammeln Sie das Überlagerungsmittel vorsichtig auf, ohne das Pellet zu stören.
6. Filtern Sie das Überstandsmittel unter sterilen Bedingungen durch einen 0,22 μm PES-hydrophilen Membranfilter. Verwenden Sie das gefilterte HAMe in 0,2 mL Mikroröhren. Lagern Sie die Aliquots bei −80 °C bis zur weiteren Verwendung.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lagerdauer 6 Monate ab dem Zeitpunkt der Vorbereitung nicht überschreitet.

5. Extraktion des blutbasierten autologen Serums aus Kaninchen

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren für In-vivo-Assays bei neuseeländischen Weißkaninchen (≈2 kg) unter Genehmigung des Animal Research Ethics Committee der jeweiligen Institution und in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien durch.

1. Betäuben Sie das Kaninchen lokal mit Lidocain (topisch oder subkutan) an der Venenpunktionsstelle.
2. Nehmen Sie Blut aus der zentralen Ohrarterie in 4,5 ml Blutabholröhrchen mit einem Polymer-Gel-Separator ab (Abbildung 3A, B). Lassen Sie das Blut 2 Stunden lang bei RT ohne Bewegung gerinnen (Abbildung 3C).
3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1.000 × g für 15 Minuten bei RT. Sammeln Sie das Supernatant (Serum), das das kaninchenautologe Serum (AS) bildet (Abbildung 3D).
4. Filtern Sie das Serum durch einen 0,22 μm PES-hydrophilen Membranfilter. Aliquot in sterile 0,2 mL-Röhren und lagern Sie es bei −80 °C bis zur Nutzung.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lagerdauer 6 Monate ab dem Zeitpunkt der Vorbereitung nicht überschreitet.

6. In vivo chirurgischer Eingriff

HINWEIS: Führen Sie alle experimentellen Verfahren gemäß dem Ethikkomitee für Tierforschung der jeweiligen Institution durch und halten Sie die Grundsätze der Helsinkier Erklärung sowie der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung ein.

1. Präoperative Vorbereitung
   HINWEIS: Verwenden Sie Neuseeländische Weißkaninchen (≈2 kg) als Tiermodell.
   1. Vor der Operation wird eine Vollnarkose mittels intramuskulärer Injektion in den Oberschenkel der Tiere verabreicht: Ketamin mit 1 mL/kg (50 mg/mL) und Xylazin mit 0,3 mL/kg (20 mg/mL). Bestätigen Sie das Fehlen des Hornhaut- und Fußreflexes, bevor Sie fortfahren.
   2. Setzen Sie das Tier in eine laterale Dekubitusposition auf eine sterile chirurgische Plattform und desinfizieren Sie den periokularen Bereich mit Povidon-Jod-Lösung. Setzen Sie ein Augenlidspekulum auf das operative Auge, um während des Eingriffs eine kontinuierliche Exposition der Augenoberfläche zu gewährleisten.
2. Anteriore stromale Keratektomie
   1. Zentriere ein 6,5 mm großes Vakuumtrephine auf der Hornhaut des Kaninchens (Abbildung 4A). Saugen Sie an, um das Gerät zu stabilisieren, und drehen Sie das Trephin um drei Viertelwindungen, wodurch eine ungefähre Stromaltiefe von 187 μm erreicht wird.
   2. Führen Sie eine anteriore stromale Keratektomie im trephisierten Bereich mit einer Halbmondklinge durch, wobei die epithelialen und vorderen Stromalschichten entfernt werden, bis ein glattes Wundbett erreicht ist (Abbildung 4B).
3. In vivo Hydrogel-Anwendung
   1. Füllen Sie den Hornhautdefekt mit 50 μL der entsprechenden Hydrogel-Formulierung, vorgeheizt auf 32 °C, um eine optimale Viskosität zu gewährleisten (Abbildung 4C).
   2. Initiieren Sie die In-situ-Vernetzung , indem Sie die Hornhautoberfläche für 2 Minuten mit blauem Licht (λ= 420–480 nm) beleuchten. Geben Sie sechs 20-s-Impulse mit 5–10 Sekunden Pausen zwischen den Impulsen ab, um die lokale Erwärmung zu begrenzen (Abbildung 4D).
4. Seitliche partielle Tarsorrhaphy
   1. Identifizieren Sie das nasale Drittel der oberen und unteren Augenlidränder, um mediale Exposition für Beobachtung und Behandlung zu ermöglichen.
   2. Setzen Sie die erste Naht an (verwenden Sie je nach benötigter Lidlänge und Stabilität 1–2 Nähte) (Abbildung 4E).
      1. Greifen Sie mit der Pinzette den seitlichen oberen Rand des Augenlids. Führen Sie die Nadel durch die graue Linie / Augenlidrand von der Hautseite zur Bindehautseite, wobei Sie einen vollständigen Biss nehmen, aber wenn möglich tiefes Eindringen in die Tarsalplatte vermeiden.
      2. Führen Sie die Nadel durch den entsprechenden Punkt des unteren Augenlidrandes von der bindehautigen Seite zur Hautseite, um die Lidränder zu verstoppen.
      3. Binden Sie die Naht mit einem festen Chirurgenknoten und zwei quadratischen Knoten, wobei der Knoten auf der Hautoberfläche leicht an der Außenseite des Augenlidrandes liegt, statt direkt darüber.
      4. Setzen Sie eine zweite Naht etwa 3–4 mm medial zur ersten, wenn zusätzliche Stabilität erforderlich ist, und verwenden Sie die gleiche volldicke U-förmige Naht oder eine einfache unterbrochene Naht.
      5. Nähte werden auf 3–4 mm zugeschnitten, um Reizungen zu verringern, sodass genügend Länge für spätere Entfernung bleibt.
      6. Überprüfen Sie, dass die Augenlid-Apposition die behandelte Hornhaut schützt und gleichzeitig Zugang zur medialen und temporalen Bindehaut/Hornhaut zur Inspektion und Behandlung mit Augentropfen ermöglicht. Stellen Sie sicher, dass das Tarsorrhaphy nicht zu eng ist und die Augenlider des Tieres nicht ischämisch sind (Abbildung 4F).
5. Postoperative Überwachung und Pflege
   1. Buprenorphin mit 0,05 mg/kg mittels subkutaner Injektion vor der Keratektomie und alle 12 Stunden für 72 Stunden verabreichen, um eine Schmerzlinderung zu ermöglichen.
   2. Geben Sie bis zum vollständigen Schließen der Wunde zweimal täglich 3 mg/ml Tobramycin-Augentropfen, um eine Infektion zu verhindern.
   3. Tragen Sie viermal täglich einen Tropfen 0,2 % Hyaluronsäure (HA) künstliche Tränen auf alle Augen, einschließlich Kontrollen, auf, um die Hornhauthydrate zu erhalten.
   4. Untersuchen Sie das Tarsorrhaphy mindestens zweimal täglich auf Anzeichen von Nahtlockerung, Infektion, lokaler Gewebenekrose oder übermäßiger Spannung. Halten Sie das Tier unter Beobachtung auf normales Verhalten, Fressen und Anzeichen von Augenbeschwerden.
   5. Um 72 Stunden nach dem Eingriff wird der Nahtknoten durchtrennt und jede Naht vorsichtig mit einer Zange gezogen, wobei darauf geachtet wird, dass keine Verunreinigungen über die Bindehautoberfläche ziehen.
   6. Untersuchen Sie die Augenlidränder auf eine ordnungsgemäße Heilung und die Hornhautoberfläche auf die Integrität des Epithels. Setzen Sie die Augenbehandlung bei Bedarf fort, bis ein vollständiger Epithelverschluss erreicht ist.
   7. Überwachen und dokumentieren Sie die Augenheilung und klinische Symptome von Tag 3 bis Tag 7, wobei Epithelverschluss, Opazität und Neovaskularisation mittels Spaltlampenmikroskopie und Fluoresceinfärbung bewertet werden.
      HINWEIS: Wenn Anzeichen von Ischämie, Wunddehiszenz oder starker Reizung auftreten, entfernen Sie die Naht(en) sofort und behandeln Sie entsprechend.
6. Draize akute Augenreizung
   1. Halten Sie das Kaninchen vorsichtig mit einem Handtuch oder einer Decke fest. Untersuchen Sie zuerst die Iris und die Bindehauthaut unter weißem Licht.
   2. Punkte gemäß der Draize-Skala auf Bindehautrötung, Chemose (Ödem) und Ausfluss (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2).
   3. Alle sechs Draize-Parameter im Datenblatt notieren. Den okularen Irritationsindex (OII) als Summe der Komponentenwerte berechnen; OII reicht von 0 bis 110, wobei höhere Werte auf eine stärkere Reizung hinweisen.
   4. Jedes Auge nach Kay–Calandra-Kategorien basierend auf dem OII klassifizieren; die Kategorie im Datensatz dokumentieren.
7. Fotografische Dokumentation der Wundheilung
   1. Fluoresceinlösung (5 μL) wird in den unteren konjunktivalen Sack eingefügt.
   2. Beleuchten Sie das Auge mit blauem Licht und bewerten Sie die Hornhautopazität (Dichte und Fläche) sowie das Ausmaß der Fluoresceinfärbung.
   3. Stellen Sie die Kamera manuell eingestellt, den optischen Zoom deaktiviert und positionieren Sie sie etwa 3 cm vom Auge entfernt, um alle Bilder mit identischen Parametern über die Sitzungen hinweg aufzunehmen. Aufnahmen Sie nach der Fluorescein-Instillation mit und ohne blaues Licht, um Epitheldefekte zu markieren. Nehmen Sie Bilder am Tag 0 (vor der Tarsorrhaphy) und täglich ab Tag 3 (nach Entfernung der Tarsorrhaphy) bis zum vollständigen Epithelverschluss auf.
   4. Analysieren Sie die Bilder mit der ImageJ-Software und quantifizieren Sie die Fläche der fluoresceingefärbten Regionen.
      HINWEIS: Eine fotografische Dokumentation an den Tagen 1 und 2 ist aufgrund der partiellen Tarsorrhapie in der Regel nicht machbar. Geben Sie an, dass Bilder von den Tagen 1 und 2 im Datensatz fehlen, und melden Sie eventuelle unerwünschte Ereignisse (z. B. zufällige Hornhautabschürfungen).
8. Euthanasie und Gewebesammlung
   1. Am 21. Tag (nach der Untersuchungsphase beider Augen) wird die Tiere tief mit Ketamin (2 ml/kg) und Xylazin (0,6 ml/kg) intramuskulär verabreicht.
   2. Euthanasierung durch intravenöse Injektion von 10 ml gesättigtem Kaliumchlorid (KCl) in die marginale Ohrvene.
   3. Bestätigen Sie den Tod durch Einsetzen der Totenstarre und fehlende vitale Reflexe, bevor Sie mit der Gewebeentnahme fortfahren.

Ergebnisse

Hydrogel-Synthese und -charakterisierung
Das Hydrogel wurde synthetisiert und in vitro evaluiert, um seine rheologischen und optischen Eigenschaften vor und nach der Photovernetzung zu bestimmen. Die Scherrheologie wurde verwendet, um die Viskoelastizität, den Fluss und das Flussverhalten zu charakterisieren. Frequenzsweeps zeigten, dass G′ über alle getesteten Frequenzen höher als G" blieb, was auf festenähnliches Verhalten hinweist (Abb...

Diskussion

Das vorliegende Protokoll bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Vorbereitung, das Laden und die Anwendung eines photovernetzbaren Gelatine-Riboflavin-Hydrogels für die Heilung von Hornhautwunden. Mehrere In-vitro-Schritte sind entscheidend für die Erreichung einer einheitlichen Gelqualität und verdienen Betonung, da sie die häufigsten Variabilitätsquellen sind. Erstens sorgt das Halten der Vorläuferlösung bei 80 °C während des Rührens für eine vollständige Auflösun...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Amphotericin B	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15290018	Endkonzentration: 1,25 μg/mL
Autologous serum, rabbit (AS)	Prepared in-house	-	Zubereitet aus Vollblut; gefiltert durch 0,22 μm PES
Blue LED curing lamp	Woodpecker Medical Instrument Co	LED.C model	Wellenlänge: λ=420–480 nm; Abstand: 1–2 cm; Lichtleistung: 850-1000 mW/cm2
Buprenorphine (Buprecare)	Ecuphar	578950	Dosis: 0,05 mg/kg, subkutane Injektion alle 12 h für 72 h
Camera	Panasonic	LUMIX TZ35	Kamera mit Leica-Optik ausgestattet
Cimarec Digital Stirring Hotplate	Thermo Fisher Scientific	SP131320-33	220-240 V, Max. Temperatur: 540 °C
Crescent microsurgical blade	BVI Medical	373807	-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	11966025	-
Eppendorf tubes (0.2 mL)	Merck KGaA	30124707	Für HAMe-Vorbereitung kalt gehalten; Aliquotierung
Eppendorf tubes (5 mL)	Merck KGaA	30119606	Für HAMe-Vorbereitung kalt gehalten; Aliquotierung
Fluorescein solution	Novartis	Colorcusi Fluotest	2% Fluorescein-Lösung, 5 µl Augentropfen
Gibco Neomycin	Merck KGaA	N1142	Endkonzentration: 50 μg/mL
Gelatin powder	Sigma Aldrich	G1890	Bei 80 °C aufgelöst; pH auf 7,0 eingestellt
Hyaluronic acid artificial tears (0.2%)	Chem.-pharm. Fabrik GmbH	Hylo-Tear	-
ImageJ image processing software	National Institute of Mental Health	-	Entwickelt von Wayne Rasband am Research Services Branch
Ketamine (Ketolar)	Pfizer	631028.1
Lidocaine	Vet One	NDC 13985-222-04	Topisch oder subkutane Injektion
Penicillin–Streptomycin	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15140-122	Endkonzentration: 50 μg/mL
PES syringe filters, 0.22 μm0.22μm (Millex)	Merck KGaA	SLGP033RS	-
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P4417-100TAB	-
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	P8340	Zugabe von 5 μL pro mg Gewebe
Povidone-iodine solution	Meda pharma	7167204	Präoperative Desinfektion
Riboflavin phosphate (RFP)	Sigma Aldrich	R0630000	Konzentrationen: 0,01% w/v (Endkonzentration); 0,02% w/v (Stammlösung)
Sonicator	Bandelein electronic	Sonoplus GM mini20	-
Sonicator probe	Bandelein electronic	MS 1.5	1,5 mm Durchmesser, 63 mm Länge.
Tarsorrhaphy sutures (non-absorbable)	Alcon	8065308001	1–2 Nähte nach Bedarf
Tobramycin ophthalmic solution (3 mg/mL)	Novartis	Tobrex	Dosierung: zweimal täglich bis zum Verschluss
Hessburg-Barron trephine, 6.5 mm diameter	Jedmed	21-8265	-
Vacutainer blood collection tubes with polymer gel separator	BD (Becton, Dickinson and Company)	367704	-
Xylazine solution	Laboratorios Calier SA	Xylagesic	Dosis: 5 mg/kg intramuskuläre Injektion