Protokoll zur Verfolgung und automatisierten Verhaltensquantifizierung bei Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

Dieses Protokoll nutzt die Posenschätzung durch Python, um Schlüsselkörperpunkte in paarigen Drosophila zu verfolgen und ermöglicht so die automatisierte Quantifizierung subtiler sozialer Verhaltensweisen, insbesondere bei sozialer Interaktion, sowie von Heatmaps und Lokomotorbahnen.

Zusammenfassung

Um ein Open-Source-Analysetool zu entwickeln, das die Einschränkungen traditioneller centroidbasierter Tracking-Methoden überwindet, präsentieren wir ein Protokoll zur genauen Analyse sozialer Interaktionen in frei handelnden Drosophila-Paaren . Konkret ist dieses Protokoll vom High-Resolution Network (HRNet)-Rahmen inspiriert, um gleichzeitig fünf anatomische Schlüsselpunkte – Kopf, Thorax, Bauch sowie linke und rechte Flügelspitzen – zu verfolgen, mit dem Ziel, hochauflösende Koordinatendaten für eine anschließende quantitative Analyse sozialer Verhaltensweisen zu generieren. Dieses Protokoll bietet einen vollständigen Workflow auf Basis von Python und einer von uns entwickelten grafischen Benutzeroberfläche (GUI), einschließlich Datensatzaufbau, Modelltraining und automatisierter Koordinatenextraktion sowie integrierten Modulen zur Erstellung räumlicher Belegungs-Heatmaps, Bewegungsbahnen und sozialen Interaktionsverhältnissen bei Fliegen. Um dieses Framework zu validieren, wurde es mit zwei weit verbreiteten Stämmen getestet, w1118 und Canton-S (CS). Unsere Ergebnisse zeigten die Stabilität der Schlüsselpunktdetektion und zeigten genotypspezifische Unterschiede in räumlicher Nutzung und Lokomotivstruktur. Diese Methodik bietet eine skalierbare Grundlage für quantitative Ethologie und automatisierte Analyse sozialer Interaktionen in Drosophila, reduziert den manuellen Annotationsaufwand und verbessert die Reproduzierbarkeit.

Einleitung

Drosophila melanogaster ist ein weit verbreitetes Modellorganismus mit leistungsstarken genetischen Werkzeugen und gut kartierten neuronalen Schaltkreisen, die eine mechanistische Zerlegung des Verhaltens^{ermöglichen 1}. Sie weist ein breites Spektrum sozialer Verhaltensweisen auf, darunter Balz und Aggression, sowie eine starke Lernfähigkeit 2,3,4,5,6,7,8. Jede besteht aus unterschiedlichen motorischen Elementen, die von einem kompakten, aber äußerst gut organisierten Nervensystem gesteuert werden. Wichtig ist, dass eine präzise Messung der Körperhaltung unerlässlich ist, um die neurologischen Grundlagen der Aktionsauswahl zu verstehen, da viele dieser Verhaltensweisen feinkörnige Haltungsmotive enthalten, die kontextuelle und innere Zustandsinformationen kodieren ^9,10.

Trotz der Notwendigkeit einer Einzelfliegenauflösung zur Erfassung individueller Unterschiede verlassen sich viele hochdurchsatzbasierte Verhaltenstests in Drosophila weiterhin auf Gruppenindizes¹¹. Hochdurchsatz-Verhaltenstests umfassen T-Maze-Tests für soziale Präferenz^12,13, soziale Abstandstests, die die Entfernung zwischen Fliegen quantifizieren, oder Aggregations-/Vermeidungsparadigmen unter sensorischer Stimulation¹⁴, die Populationstrends effizient erfassen können. Sie beinhalten jedoch von Natur aus das Durchschnitt zwischen Individuen, wodurch Heterogenität in Actionszenen und die zeitliche Struktur sozialer Austausche verschleiern wird. Im Laufe der Jahre haben Versuche, zur Identifikation pro Flug zu gehen, auf funktional eingeschränkte Methoden angewiesen, wie regelbasierte Ereigniserkennung mit kinematischen Schwellenwerten, Hintergrundsubtraktion mit Schwerpunktverfolgung und manuelle Videoannotation 15,16,17,18. Daher werden diskrete Verhaltensweisen wie Ausfallen, Tappen oder Flügeldrohungen oft ignoriert oder falsch beschriftet, was eine erhebliche manuelle Korrektur erfordert. Solche Einschränkungen haben mechanistische Studien eingeschränkt, die eine präzise zeitliche Ausrichtung zwischen neuronaler Aktivität und individuellen Aktionen erfordern.

Eine revolutionäre Lösung ist dank der jüngsten Entwicklungen in der Computer-Vision und der maschinellen Lern-basierten Posenschätzung nun verfügbar. Open-Source-Frameworks wie DeepLabCut¹⁹ und SLEAP²⁰ ermöglichen markerlose Erkennung von Körperteilen, skalierbare Klassifizierung diskreter Aktionen und die Bewahrung individueller Identität auch bei engen Interaktionen. Diese Merkmale überwinden die Nachteile früherer gruppenbasierter und regelbasierter Ansätze und ermöglichen eine wiederholbare Quantifizierung komplexer sozialer Verhaltensweisen.

Individuelle Interaktionen bei Drosophila zeichnen sich durch einzigartige motorische Merkmale aus, die auf den Verlauf sozialer Interaktionen hinweisen. Aggression umfasst beispielsweise typische Verhaltensweisen wie Ausfallen, Flügeldrohungen und Grappling, die alle die wachsenden Konfliktstadien^21,22 darstellen. Balz wird ähnlich durch Orientierung, einseitige Flügelausdehnung mit Gesangsproduktion, Klopfen und Versuch der Kopulation definiert, die zusammen die temporale Abfolge der Paarungsinteraktionen bilden²³. Die Erfassung dieser Motive hängt von der genauen Erkennung der Körperhaltung und Gelenkbewegungen^{ab 24,25}. In der Praxis erfordert die Stichprobennahme eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung über längere Aufzeichnungszeiten, um sicherzustellen, dass subtile motorische Muster präzise erkannt und mit neuronaler Aktivität abgestimmt werden können^25,26.

Hier präsentieren wir ein Open-Source-basiertes, visionsbasiertes Framework zur automatisierten Identifikation von fünf anatomischen Schlüsselpunkten – Kopf, Thorax, Bauch, linke und rechte Flügelspitzen²⁷. Das System umfasst einen vollständigen Workflow für den Datensatzaufbau, das Modelltraining und die Koordinatenextraktion und liefert hochauflösende Zeitreihendaten, die sich für eine anpassbare Verhaltensklassifikation eignen. Durch die Automatisierung manueller Annotationsprozesse und die Standardisierung analytischer Arbeitsabläufe ermöglicht unsere Methode eine feinskalierte quantitative Analyse sozialer Interaktionsverhaltensweisen, was Effizienz und Reproduzierbarkeit erhöht und gleichzeitig den Analyseaufwand und Zeit- und Arbeitsaufwand erheblich reduziert.

Um die Zuverlässigkeit des Systems zu validieren, wandten wir es auf zwei häufig verwendete Laborstämme, w1118 und Canton-S (CS), an und beobachteten eine stabile Key-Point-Detektion über verschiedene Frames hinweg sowie genotypspezifische Unterschiede in räumlicher Besetzung, Flugbahnmerkmale und sozialen Interaktionsindikatoren basierend auf Kopfentfernung und Orientierungswinkel. Forscher können die Eignung dieses Protokolls anhand der erforderlichen raumzeitlichen Auflösung (≥30 fps, ≤0,5 mm/Pixel) und den Videoaufzeichnungsbedingungen (Beleuchtung und Kontrast) beurteilen. Die Pixelgröße kann direkt aus den Kameraeinstellungen bestimmt werden. Eine Fruchtfliege mit gemessener Körperlänge kann zur Kalibrierung innerhalb des Bildsichtfelds platziert werden. Dieses Protokoll eignet sich besonders für folgende Szenarien: die Notwendigkeit, zwei frei interagierende Drosophila gleichzeitig zu verfolgen und ihre individuellen Identitäten zu unterscheiden; Fokus auf feine Haltungen (z. B. Kopfwinkel und -entfernung) statt nur auf Schwerpunktpositionen; eine Aufzeichnungsdauer von mehr als 10 Minuten, wenn manuelle Annotation nicht möglich ist; dies erfordert eine temporale Ausrichtung auf Millisekundenebene zwischen Verhaltensereignissen und neuronaler Aktivität (z. B. Kalziumbildgebung oder Elektrophysiologie) in nachfolgenden Analysen.

Protokoll

1. Fliegenvorbereitung

1. Die Fliegen werden etwa 3–4 Tage alt unter kurzer CO₂-Anästhesie gesammelt und geschlechtsgeprüft, bevor die Experimente durchgeführt werden.
   HINWEIS: Die Dauer der Anästhesie und der CO₂-Durchfluss können je nach Spezifikation und Druck des in jedem Labor verwendeten Kohlendioxidzylinders variieren. Die Fliegen sollten während der Anästhesie kontinuierlich überwacht werden, und die CO₂-Exposition sollte nur aufrechterhalten werden, bis die Fliegen vollständig betäubt sind und eine vollständige Bewegungsstillstellung zeigen.
2. Jede Fliege einzeln in ein 50-ml-Falcon-Rohr mit einem Standardmedium aus Maismehl, Agar, Glukose und Hefe zu legen.
3. Fliegen halten Sie bei 25 °C in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus bis zur Nutzung.

2. Arenabau

1. Bereite zwei 3 mm transparente Acrylplatten und eine 3 mm Polyethylenplatte vor.
2. Schneiden Sie vier kreisförmige Kammern (jeweils 35 mm Durchmesser) in die Mitte der Polyethylenplatte.
3. Verwenden Sie Clips, um eine Acrylplatte mit der Polyethylenplatte zu verbinden und so die Kammerbasis zu bilden; Behalte die zweite Acrylplatte als abnehmbare Abdeckung.

Abbildung 1: Schaltplan der Verhaltensarena und der Bildaufbau. (A) Der Bau einer maßgeschneiderten Beobachtungskammer ist im Diagramm dargestellt. Die Kammer besteht aus drei Hauptschichten: einer 3 mm transparenten Acrylbasisplatte; eine 3-mm-Polyethylenplatte mit vier kreisförmigen Aussparungen mit 35 mm Durchmesser, die als einzelne Kammerbrunnen dienen; und eine zweite Acrylplatte, die als abnehmbare Abdeckung dient. (B) Eine 90°-Adapterklemme wird verwendet, um die Kamera vertikal an einem 40 cm langen optischen Mast zu montieren. Für die Top-Down-Bildgebung ist die Kamera direkt über der mehrschichtigen Beobachtungsarena positioniert, wobei ihre optische Achse senkrecht zur Kammeroberfläche steht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Bildaufbau

1. Bauen Sie zwei 20-cm-Optikstangen und einen 40-cm-Mast mit 90°-Adapterklemmen zusammen.
2. Stellen Sie die Kamera (1280 × 1024 Pixel) vertikal am 40-cm-Mast an, senkrecht zur Arenaoberfläche ausgerichtet, und stellen Sie die Bildrate auf 150 fps ein.
3. Stellen Sie die Arena auf ein 25 cm × 25 cm dimmbares, taglichtweißes LED-Panel, das mit einer Diffusionsfolie bedeckt ist.
4. Stellen Sie die Beleuchtung auf etwa 1500 Lux an der Arenaoberfläche ein.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Flügelkanten in der Binärvorschau sichtbar bleiben. Vermeiden Sie >2000 Lux, um hitzebedingte Artefakte zu vermeiden, da Fliegen aufgrund thermischer Belastung durch die Lichtquelle ihre natürliche Fortbewegung oder Verteilung verändern können.

4. Aufzeichnungsverfahren

1. Platziere 3 cm Schaumstoffpads unter jede Ecke der Arena, um sie zu stabilisieren.
2. Fliegenpaare unter CO₂-Anästhesie in die Kammern übertragen; Versiegeln Sie mit der oberen Acrylplatte.
3. Lass die Fliegen 40 Minuten vor der Aufnahme akklimatisieren.
4. Starte die Videoaufnahme mit MIAS.exe²⁷: Drücke Q, um zu beginnen, und C, um zu stoppen.
   HINWEIS: Dies führt zu kontinuierlichen Videoaufnahmen frei interagierender Fliegenpaare unter standardisierten Bedingungen.

5. Definieren Sie das Panel für soziale Aktivitäten

1. Führe das Preprocessing-Skript aus: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   HINWEIS: Alle Coding-Skripte sind in Supplementary File 1 bereitgestellt.
2. Annotieren Sie den Kammerbereich und weisen Sie Metadaten in Form von Genotype_age (Tage) × 1 (Anzahl der Kammern) zu. (z. B. CS_3 × 1)
3. Stellen Sie den Detektionsschwellenregler so lange an, bis die Flügel im Binärbild nahezu unsichtbar sind, um optimale Hintergrundsubtraktion und Flügelsichtbarkeit zu gewährleisten.

6. Datensatzvorbereitung

1. Erstellen Sie einen neuen Dataset-Ordner, indem Sie Folgendes ausführen:
   python tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (Frame Sampling Interval)
   HINWEIS: Der Parameter des Frame-Sampling-Intervalls ("10") wurde aus einem zuvor veröffentlichten Protokoll²⁷ übernommen. Niedrigere Werte erhöhen die Stichprobendichte und die Rechenlast, während höhere Werte den Rechenbedarf verringern und je nach verfügbarer Hardwareleistung und experimentellen Anforderungen angepasst werden können.
2. Richte den Videopfad und den Datensatzpfad in 'tools/SoAL_DatasetUtils.py' ein
3. Manuelle Beschriftungsoberfläche starten:
   >python tools/SoAL_LabelUI.py DATASETNAME
   1. Frame-Navigation: Drücken Sie die Leertaste oder die Z-Taste, um zum nächsten bzw. vorherigen Frame zu navigieren. Alternativ kannst du den Timeline-Schieberegler zur Navigation verwenden.
   2. Schlüsselpunktbezeichnung: Klicken Sie auf die korrekte Position einer Fliege in jedem Bild (in einer bestimmten Reihenfolge: Kopf, Thorax, Bauch, linker Flügel und rechter Flügel), um die 5 Schlüsselpunkte zu markieren.
   3. Tastenauswahl: Drücken Sie die Zahlentasten, um einen Schlüsselpunkt auszuwählen (gekennzeichnet durch einen weißen Kreis). Der nächste Klick weist dem ausgewählten Schlüsselpunkt eine neue Nummer zu.
   4. Speichern: Schließen Sie das Fenster oder drücken Sie die D-Taste, um die Annotationsergebnisse zu speichern.
      HINWEIS: Ein vollständiges Trainingsset-Archiv besteht aus zwei Komponenten: einem Bildverzeichnis und einer annotation.json-Datei.

7. Modelltraining

1. Unterteilen Sie den Datensatz in Trainings- und Validierungssätze:
   Python-Tools/SoAL_DatasetGen.py DATENSATZNAMEN-Unterscheidung
   Zwei neue Ordner werden in 'dataset/' erstellt.
2. Konfigurieren Sie Trainingsparameter in hrnet/fly_w32.yaml:
   Rotationsfaktor: 15°
   Skalierungsfaktor: 0,35
   Helligkeitsfaktor: 0,25
   Chargengröße: 24
   Epochen: 200
3. Führen Sie das Trainingsprogramm durch:
   python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Trainingssätze beenden, wenn die durchschnittliche Präzision (AP) stagniert; das beste Modell (AP > 90 %) behalten.
4. Modell validieren mit:
   python hrnet/tools/test.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Ergebnis: Robustes HRNet-basiertes Modell zur Mehrfach-Fliegen-Schlüsselpunkterkennung.

8. Führe das Erkennungsprogramm aus

1. Kopiere neue Videodateien in das Videoverzeichnis.
2. Annotieren Sie Metadaten wie in Schritt 5 gezeigt.
3. Führe das Erkennungsprogramm aus: Python SoAL_KptDetect.py alle
4. Untersuchen Sie die Erkennungsergebnisse:
   Python Tools/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path (.cvs/xslx)
   Ergebnis: Zweidimensionale Koordinaten von fünf anatomischen Orientierungspunkten pro Flug über Rahmen.

9. Verhaltensquantifizierung

1. Starten Sie eine eigenständige GUI-Anwendung zur Analyse (Supplementary File 2) und importieren Sie Koordinatendateien in die Benutzeroberfläche.
2. Erstelle räumliche Belegungs-Heatmaps (Wahrscheinlichkeitsdichte der Arena-Positionen).
3. Rekonstruiere Lokomotorbahnen aus Koordinatenzeitreihen.
4. Erstellen Sie Daten zur sozialen Interaktion, einschließlich Kopfentfernung, Orientierung und abgeleitetem sozialem Zustand.
   Ergebnis: Standardisierte Visualisierung genotypspezifischer räumlicher Nutzung und Bewegungsdynamik.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Arenageometrie, Beleuchtungskonfiguration und Kameraplatzierung, die zur Aufzeichnung natürlicher sozialer Interaktionen in Drosophila verwendet werden. Das Setup gewährleistet eine einheitliche Beleuchtung und stabile Bildgebungsbedingungen, die für die Posenschätzung und Koordinatenextraktion geeignet sind.

Die automatisierte Posenschätzung wurde auf alle aufgenommenen Videos angewendet, um zweidim...

Diskussion

Unsere Studie zeigt, dass maschinell-lernende Posenschätzung eine skalierbare, zuverlässige Methode zur Messung feiner sozialer Interaktionen bei Drosophila bietet. Es überwindet die Einschränkungen der centroidbasierten Ansätze^{15, 16, 17, 18}, indem es fünf anatomische Schlüsselpunkte in frei wechselwirkenden Paaren verfolgt und so die Erfassung von Wi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	BioFroxx	8211GR500
camera(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Kohlendioxid	Messer	124-38-9
D(+)-Glukose wasserfrei	BioFroxx	1179GR500
Drosophila Schmale Vials (Falcon Röhrchen)	Biolgix	51-0500
Ethanol	Chron Chemicals	64-17-5
LED-Panel	/	/	kundenspezifisch
Methylparaben	Sigma	99-76-3
Polyethylenplatte	/	/	kundenspezifisch
Python	/	Version 3.6
Saccharose	DaMao	57-50-1
Transparente Acrylplatten	/	/	kundenspezifisch
Hefe	Angel	100004237033