Isolierung, Reinigung und Charakterisierung funktioneller Mitochondrien, die aus dem Mausskelettmuskel für mitochondriale Transplantationen abgeleitet wurden

Zusammenfassung

Ein standardisiertes Protokoll, das Trypsinverdauung und Differenzzentrifugation kombiniert, wurde für die Isolierung, Reinigung und funktionelle Charakterisierung von Mitochondrien aus Mausskelettmuskeln sowie zur Bewertung ihrer Anwendung bei mitochondrialen Transplantationen eingerichtet.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind essentielle Organellen, die den Energiestoffwechsel, die Signalübertragung und die zelluläre Homöostase in eukaryotischen Zellen regulieren. Mitochondriale Dysfunktion trägt zur Pathogenese zahlreicher Krankheiten bei und hat die Entwicklung der mitochondrialen Transplantation als regenerative therapeutische Strategie begünstigt. Die erfolgreiche Anwendung der mitochondrialen Transplantation hängt von der Verfügbarkeit hochgereinigter und funktionell intakter Mitochondrien ab. Skelettmuskulatur ist aufgrund seines hohen mitochondrialen Gehalts, seiner metabolischen Aktivität und seiner Zugänglichkeit eine geeignete Spenderquelle. Diese Studie etablierte ein standardisiertes, reproduzierbares Protokoll zur Isolierung, Reinigung und Charakterisierung funktioneller Mitochondrien aus Mausskelettmuskeln und bewertete deren Einsatz bei mitochondrialen Transplantationen. Das Verfahren bestand aus zwei Hauptphasen. Zunächst wurden Mitochondrien aus dem Skelettmuskel von C57BL/6-Mäusen mittels Trypsinverdauung isoliert, gefolgt von einer Differentialzentrifugation. Zweitens wurden die isolierten Mitochondrien charakterisiert, um Reinheit, Ultrastruktur und funktionelle Aktivität zu bewerten. Die reine Mitochondrien wurde mittels Quantifizierung von Bicinchoninsäure (BCA) und Western-Blot-Analyse bewertet. Die ultrastrukturelle Integrität wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Die funktionelle Aktivität wurde mittels JC-1 und mitochondrialer fluoreszenter Markierung zusammen mit Messungen des Sauerstoffverbrauchs, der ATP-Produktionskapazität und des Atemkontrollverhältnisses mit einem hochauflösenden Respirometriesystem bewertet. Die isolierten Mitochondrien wiesen erhaltenes Membranpotenzial, intakte Ultrastruktur und stabile Atemaktivität auf, was auf Eignung für nachgelagerte funktionelle Studien und mitochondriale Transplantationen hinweist.

Einleitung

Mitochondrien sind die Hauptstellen der Adenosintriphosphatproduktion (ATP) und spielen zentrale Rollen bei der Apoptose, der Kalziumhomöostase und dem Stoffwechsel reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Die funktionelle Integrität der Mitochondrien ist daher entscheidend für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase und die Bestimmung des Zellschicksals ^1,2. Mitochondriale Dysfunktion, einschließlich mitochondrialer DNA-(mtDNA)-Mutationen und Elektronentransportketten-(ETC)-Anomalien, führt zu beeinträchtigtem Energiestoffwechsel, oxidativem Stress und dysregulierter Apoptose ^3,4. Diese Auffälligkeiten stehen im Zusammenhang mit einer Vielzahl von Krankheiten, darunter vererbte mitochondriale Erkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen ^5,6. Konventionelle therapeutische Strategien für mitochondriale Dysfunktion, wie Antioxidantien und metabolische Kofaktoren, bieten im Allgemeinen eine begrenzte Wirksamkeit, da sie Symptome lindern, ohne die mitochondriale Funktion direkt wiederherzustellen ^7,8. Folglich hat sich die mitochondriale Transplantation als vielversprechender therapeutischer Ansatz in der regenerativen Medizin etabliert. Diese Strategie beinhaltet die Abgabe intakter exogener Mitochondrien in beschädigte oder dysfunktionale Zellen, um die mitochondriale Aktivität und den zellulären Energiestoffwechsel^{wiederherzustellen.} Frühere Studien haben gezeigt, dass exogene Mitochondrien von Empfängerzellen internalisiert und in das endogene mitochondriale Netzwerk integriert werden können, was zu einer verbesserten bioenergetischen Funktion und einer verbesserten Zellüberlebensfähigkeit^führt.

Skelettmuskulatur gilt als geeigneter Spender für die mitochondriale Isolation aufgrund ihres hohen mitochondrialen Gehalts, ihrer metabolischen Aktivität und ihrer Zugänglichkeit 14,15,16. Die mitochondriale Transplantation erfordert mehrere wichtige Schritte, darunter mitochondriale Isolierung, Reinigung, funktionelle Charakterisierung und effiziente Abgabe in die Empfängerzellen. Dennoch bleibt unter den bisher berichteten Protokollen erhebliche methodische Variabilität, insbesondere bei Verfahren zur Gewebehomogenisierung, enzymatischer Verdauung, Temperaturkontrolle und Reinigung. Solche Variabilitäten können mitochondriale Erträge, Reinheit und funktionelle Integrität beeinflussen und somit die experimentelle Reproduzierbarkeit einschränken.

Um methodische Konsistenz und Reproduzierbarkeit zu verbessern, präsentiert diese Studie ein standardisiertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung funktioneller Mitochondrien aus Mausskelettmuskeln mittels Trypsin-Verdauung und Differentialzentrifugation. Die isolierten Mitochondrien wurden auf Reinheit, ultrastrukturelle Integrität und funktionelle Aktivität mittels Proteinquantifizierung von Bicinchinainsäure (BCA), Western-Blotting, Transmissionselektronenmikroskopie, fluoreszenzbasierten Membranpotentialtests und hochauflösender Respirometrie bewertet. Darüber hinaus wurde die Aufnahme isolierter Mitochondrien durch Empfängerzellen bewertet, um deren Eignung für mitochondriale Transplantationsanwendungen zu bewerten. Dieses Protokoll bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Gewinnung funktioneller, skelettmuskulatur-abgeleiteter Mitochondrien für nachgelagerte experimentelle Studien.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in einer speziellen pathogenfreien (SPF) Einrichtung durchgeführt und vom Animal Ethics and Use Committee des Third Affiliated Hospital of Air Force Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer: IACUC-2024kq-065).

Männliche C57BL/6 Mäuse (6-8 Wochen alt, 18-20 g) wurden vom Laboratory Animal Center der Air Force Medical University gekauft (Produktionslizenz: SCXK (Shaanxi) 2024-002). Die Mäuse wurden in einzeln belüfteten Käfigen (IVCs) unter positivem Druck und sauberen Bedingungen untergebracht, mit einer Temperatur von 20–26 °C, relativer Luftfeuchtigkeit von 40 % bis 70 %, einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus und mindestens 15 Luftwechseln pro Stunde. Sterilisierte Ernährung, Trinkwasser und Umweltbereicherung wurden bereitgestellt.

Die im Protokoll verwendeten Reagenzien, Chemikalien und experimentellen Instrumente sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Tieropfer und Gewebeentnahme

1. Setzen Sie die Maus in eine luftdichte Euthanasiekammer und euthanadieren Sie durch schrittweise Kohlendioxidinhalation (CO₂), 30–70% Kammervolumen pro Minute.
2. Bestätigen Sie den Tod durch Stillstand der spontanen Atmung und des Herzschlags, Verlust der Pupillenreflexe und keine Reaktion auf mechanische Stimulation.
3. Tauchen Sie die eingeschläfelten C57BL/6-Mäuse für 5 Minuten in 75 % Ethanol zur Desinfektion.
   HINWEIS: Um alkoholbedingte Gewebefixierung und Zellschäden zu vermeiden, sollte die Eintauchzeit auf 10 Minuten begrenzt werden. Verwenden Sie während des gesamten Protokolls frisches Gewebe, da das Einfrieren die Lebensfähigkeit und funktionelle Integrität der Mitochondrien beeinträchtigt.
4. Setzen Sie die Maus in eine sterile Petrischale innerhalb einer laminaren Flusshaube mit dem Abdomen nach oben, um die Bauch- und Hintergliedmaßenregionen vollständig freizulegen.
5. Heben Sie die Haut des Unterbauchs in der Nähe des Genitalbereichs mit einer Pinzette an und machen Sie einen kleinen Schnitt. Führen Sie eine stumpfe Dissektion durch, um die Haut vom darunterliegenden Gewebe zu trennen. Verlängern Sie den Schnitt oberhalb entlang der Mittellinie zum Knöchel und seitlich zu beiden Hintergliedmaßen, um die Hintergliedmaßenmuskelgruppen vollständig freizulegen.
6. Identifizieren Sie den Quadriceps femoris-Musculus an der vorderen Seite des Oberschenkels und trennen Sie den Muskel sorgfältig entlang der Richtung der Muskelfasern mittels stumpfer Dissektion. Trennen Sie das distale Patellarband und die proximale Sehne, um das Muskelgewebe vollständig zu isolieren.
   HINWEIS: Waschen Sie das Gewebe dreimal in vorgekühltem, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % Penicillin-Streptomycin und verwenden Sie bei jeder Wäsche eine frische Petrischale, um die Kontamination zu minimieren.
7. Geben Sie das isolierte Muskelgewebe sofort in vorgekühltes PBS und spülen Sie gründlich, um Haare und Blut von der Gewebeoberfläche zu entfernen.
8. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Feuchtigkeit aus dem Gewebe mit steriler Mullbinde. Teilen Sie das Gewebe in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf und wiegen Sie die Proben. Verwenden Sie etwa 100 mg Gewebe pro Probe, um eine Konsistenz zwischen den Präparationen zu gewährleisten.

2. Gewebekleinerung und Homogenisierung

1. Setzen Sie das Mikrozentrifugenrohr mit dem Gewebe aus Schritt 1.8 auf Eis. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sterilen Schere in kleine Fragmente von etwa 1–2 mm^{und 3} Zoll.
2. Fügen Sie 8 Bände vorgekühltes 0,25%iges Trypsin hinzu und verdauen Sie die Gewebefragmente 15 Minuten lang auf Eis.
   HINWEIS: Berechnen Sie das erforderliche Trypsinvolumen entsprechend der Gewebemasse (1 mg ≈ 1 μL). Zum Beispiel fügen Sie 640 μL 0,25 % Trypsin zu 80 mg Gewebe hinzu.
3. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 1.000 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Überlagerungsmittel und behalte das Gewebepellet zurück. Suspendieren Sie das Pellet erneut in einem 1 ml vorgekühlten mitochondrialen Isolationspuffer, der D-Mannitol (215 mM), Saccharose (75 mM), HEPES (20 mM), EGTA (1 mM) und fettsäurefreies Rinderserumalbumin (0,5 % w/v) enthält.
4. Übertragen Sie die Suspension auf einen Glashomogenisator, der auf Eis gehalten wird. Homogenisiere das Gewebe mit 10–12 sanften Auf-und-Ab-Bewegungen, bis die Suspension trüb wird.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, den Glasstößel seitlich am Boden des Homogenisators zu drehen, da übermäßige mechanische Kraft die mitochondrialen Membranen schädigen und die Mitochondrienfunktion beeinträchtigen kann.

3. Differenzielle Zentrifugation

1. Das Homogenat in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr übertragen und bei 1.000 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
2. Übertragen Sie den Supernatant in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr und zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 5 Minuten bei 4 °C, um das rohe mitochondriale Pellet zu erhalten.
   HINWEIS: Sammeln Sie das Supernatant vorsichtig mit einer 1-ml-Spritze auf, wobei Sie Störungen des Pellets und der Restgewebereste vermeiden.

4. Mitochondriale Reinigung und Lagerung

1. Suspendieren Sie das rohe mitochondriale Pellet vorsichtig in einem vorgekühlten Waschpuffer, der Saccharose (250 mM), HEPES (10 mM, pH 7,4), EGTA (1 mM) und Rinderserumalbumin (0,15 % w/v) enthält. Zentrifugiere die Suspension bei 1.000 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
2. Übergeben Sie den Supernatant in ein frisches Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um das gereinigte mitochondriale Pellet zu erhalten.
   HINWEIS: Verwenden Sie sofort, wann immer möglich, frisch isolierte Mitochondrien. Eine Kurzzeitlagerung bei 4 °C oder eine Langzeitlagerung bei −80 °C im mitochondrialen Speicherpuffer mit Saccharose (0,25 m), Tris-MOPS (10 mM, pH 7,4) und EGTA (0,1 mM) ist machbar. Das Einfrieren kann jedoch die enzymatische Aktivität der mitochondrien und die Atemfunktion beeinträchtigen. Verwenden Sie gefrorene Proben hauptsächlich für die Proteinanalyse.

5. Mitochondriale und zytosolische Proteinextraktion und BCA-Quantifizierung

1. Mitochondriale Proteinextraktion
   1. Das gereinigte mitochondriale Pellet wird in 50 μL RIPA-Lysepuffer pro 100 mg Startgewebe wieder suspendiert und die Suspension 15 Minuten lang auf Eis inkubiert.
   2. Zentrifugieren Sie das Lysat bei etwa 14.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C. Übertrage den Supernatant in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr, um die mitochondriale Proteinfraktion zu erhalten.
2. Zytosolische Proteinextraktion
   1. Zentrifugieren Sie den zytosolischen Supernatanten, der in Schritt 4.2 gewonnen wurde, bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C. Verwerfen Sie das Supernatant und behalten Sie das Pellet als angereicherte zytosolische Fraktion.
   2. Setzen Sie das zytosolische Pellet in 50 μL RIPA-Lysepuffer wieder auf und verarbeiten Sie die Probe wie in den Schritten 5.1.1-5.1.2 beschrieben.
      HINWEIS: Bereiten Sie den Lysepuffer frisch mit Proteaseinhibitoren vor und führen Sie alle Verfahren auf Eis durch, um den Proteinabbau zu minimieren. Die in diesem Schritt verwendeten Mitochondrien können entweder frisch oder gefroren sein.
3. BCA-Proteinquantifizierung
   1. Bereite die BCA-Arbeitslösung vor, indem du Reagenz A und Reagenz B im Verhältnis 50:1 (v/v) mischst. Fügen Sie jedem Brunnen einer 96-Well-Platte 200 μL Arbeitslösung hinzu.
      HINWEIS: Bereiten Sie die BCA-Arbeitslösung unmittelbar vor der Verwendung vor und verwenden Sie sie innerhalb von 1 Stunde bei Raumtemperatur.
   2. Verdünnen Sie die Rinderserum-Albumin-(BSA)-Lagerlösung (2 mg/mL) auf 0,5 mg/mL und lassen Sie die Lösung bis zur Anwendung auf Eis liegen.
   3. Bereiten Sie die Standardkurve vor, indem Sie 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 oder 0 μL BSA-Lösung zu separaten Bohrlöchern hinzufügen. Stellen Sie das Endvolumen mit NaCl-Lösung auf 20 μL ein.
   4. Geben Sie 4 μL mitochondriales Protein und 16 μL NaCl-Lösung zu einem Satz von Bohrlöchern. Fügen Sie 4 μL zytosolisches Protein und 16 μL NaCl-Lösung zu einer weiteren Wellengruppe hinzu.
   5. Geben Sie jedem Brunnen 200 μL BCA-Arbeitslösung zu und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C im Dunkeln für 30 Minuten. Messen Sie die Absorption bei 562 nm mit einem Mikroplattenleser.
   6. Konstruiere eine Protein-Standardkurve mit einem Korrelationskoeffizienten (R²) ≥ 0,999. Berechnen Sie Proteinkonzentrationen (μg/μL), indem Sie Absorptionswerte aus der Standardkurve interpolieren.

6. Reinheitsbewertung von skelettmuskulatur-abgeleiteten Mitochondrien

1. Verdünnen Sie mitochondriale und zytosolische Proteinproben auf eine Endkonzentration von 1,5 μg/μL. Bereiten Sie 20 μL Reaktionsgemische vor, die 30 μg Protein und 4 × Ladepuffer enthalten. Stelle das verbleibende Volumen mit NaCl-Lösung ein. Kochen Sie die Proben 10 Minuten lang und lagern Sie sie bis zur Anwendung bei −80 °C.
2. Trenne Proteinproben mit 4%-20% Gradienten-Fertiggelen. Führen Sie eine Elektrophorese bei 140-150 V für 50 Minuten durch.
3. Aktiviere die PVDF-Membran (0,22 μm) in Methanol für 1 Minute. Proteine werden mit dem Schnelltransferpuffer bei 400 mA für 30 Minuten übertragen.
4. Entferne die PVDF-Membran aus dem Transfer-Sandwich und wasche sie 5 Minuten in TBST. Decken Sie die Membran mit 5 % Magermilch bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang ab und schütteln Sie sie sanft.
5. Verdünne primäre Antikörper (COX IV, Cytochrom C, β-Aktin) 1:1.000 im Antikörperverdünnungspuffer. Inkubieren Sie die Membran über Nacht mit primären Antikörpern bei 4 °C.
6. Wasche die Membran dreimal mit TBST für 10 Minuten pro Wasch.
7. Inkubieren Sie die Membran mit einem sekundären Antikörper, der 1:10.000 bei Raumtemperatur 1 Stunde verdünnt ist.
8. Wasche die Membran dreimal mit TBST für jeweils 10 Minuten. Entwickeln Sie den Fleck und nehmen Sie die Bilder auf.

7. MitoTracker-Färbung von von Skelettmuskeln abgeleiteten Mitochondrien

1. Verdünnen Sie die Färbungsverarbeitungslösung unmittelbar vor der Anwendung auf eine Endkonzentration von 200 nM in vorerwärmtem Medium.
2. Das mitochondriale Pellet in 100 μL der Arbeitslösung wieder suspendieren und 20 Minuten lang bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
3. Fügen Sie nach der Inkubation fünf Bände vorgekühlten Speicherpuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstandsstoff mit dem ungebundenen Farbstoff.
4. Übertragen Sie einen Aliquot der gefleckten mitochondrialen Suspension auf einen Glasträger und decken Sie die Probe mit einem Deckzettel ab.
5. Aufnahme von Fluoreszenzbildern mit einem laserabtastenden konfokalen Mikroskop mit geeigneten Anregungs- und Emissionseinstellungen zur Erkennung roter fluoreszierender mitochondrialer Farbstoffe.

8. Beurteilung des mitochondrialen Membranpotenzials mittels JC-1-Färbung

1. CCCP (Carbonylcyanid m-Chlorophenylhydrazon) Behandlungsgruppe
   1. Behandeln Sie die mitochondriale Suspension mit CCCP bei einer Endkonzentration von 10 μM und inkubieren Sie 20 Minuten lang, um das Potential der mitochondrialen Membran zu dissipieren.
   2. Inkubieren Sie die CCCP-behandelte mitochondriale Suspension mit 250 μL JC-1-Färbelösung bei 37 °C für 20 Minuten mit sanfter Bewegung.
2. JC-1 Behandlungsgruppe
   1. Das mitochondriale Pellet in 100 μL JC-1-Arbeitslösung wieder suspendieren und 20 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, geschützt vor Licht.
   2. Bereiten Sie einen 1× JC-1 Färbepuffer vor, indem Sie die 5× Fondlösung mit destilliertem Wasser im Verhältnis 2:8 (v/v) verdünnen und den Puffer auf Eis halten.
   3. Entferne die Färbelösung und wasche das mitochondriale Pellet zweimal mit vorgekühltem 1× JC-1 Färbepuffer.
   4. Suspendieren Sie die gefärbten Mitochondrien in PBS und bilden Sie sie mit einem laserabtastenden konfokalen Mikroskop ab. Verwenden Sie geeignete Anregungs- und Emissionseinstellungen zur Detektion von grünen fluoreszierenden JC-1-Monomeren und roten fluoreszierenden JC-1-Aggregaten.

9. Ultrastrukturelle Analyse isolierter Skelettmuskelmitochondrien mittels Transmissionselektronenmikroskopie

1. Beziehen Sie frisch isolierte Mitochondrien in 2,5 % Glutaraldehyd, hergestellt in 0,2 m Phosphatpuffer (pH 7,4), und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 °C.
2. Waschen Sie die Proben mit 0,1 m phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel (PBS, pH 7,4) und fixieren Sie die Proben für 1 % bei Raumtemperatur für 1 Stunde in 1 % Osmiumtetroxid.
3. Dehydrieren Sie die Proben durch eine graduierte Ethanolserie, gefolgt von Infiltration, Einbettung und Polymerisation in Epoxidharz.
4. Schneiden Sie die eingebetteten Proben mit einer Dicke von 50–70 nm mit einem Ultramikrotom.
5. Die Schnitte doppelt mit Uranylacetat und Bleicitrat färben. Beobachten und bilden Sie die Proben mit einem Transmissionselektronenmikroskop ab.

10. Zelluläre Aufnahme von von Skelettmuskeln abgeleiteten Mitochondrien

1. Kultur NCTC-Klon 929 (L929; RRID: CVCL_0462) Zellen, die von einem kommerziellen Anbieter in einem vollständigen Medium mit MEM Alpha gewonnen werden, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin.
2. Wenn die Zellen 80–90 % Zusammenfluss erreichen, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS. Fügen Sie Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie, bis die Zellen sich ablösen.
3. Fügen Sie vollständiges Medium hinzu, um die Verdauung zu beenden, und erzeugen Sie durch sanftes Pipettern eine Einzelzell-Suspension. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.000 × g für 5 Minuten und entsorgen Sie das Übersetzungsmittel.
4. Die Zellkugel in frischem vollständigem Medium neu suspendieren und die Zellen in neuen Kulturschalen mit entsprechender Dichte aussäen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % CO₂ enthält.
5. Samen führen Sie die Zellen 5 (P5) in 35 mm Glasbodenschalen ein und kultivieren Sie die Zellen über Nacht.
6. Kennzeichnen Sie isolierte Mitochondrien mit einem mitochondrienspezifischen roten fluoreszierenden Farbstoff bei 37 °C im Dunkeln für 20 Minuten und waschen Sie die Mitochondrien mit PBS, um ungebundene Farbe zu entfernen.
7. Fügen Sie den Zellen rote, fluoreszierend farbstoffmarkierte Mitochondrien (20 μg mitochondriales Protein pro Schüssel) hinzu und inkubieren Sie 24 Stunden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂.
8. Färben Sie die Zellen 30 Minuten lang mit einer fluoreszierenden Aktinsonde, um das Aktin-Zytoskelett und die Gegenfärbungskerne mit einem fluoreszierenden Kernfarbstoff sichtbar zu machen.
   HINWEIS: Kontrollieren Sie die Serumkonzentration während der Co-Inkubation sorgfältig, da übermäßiges Serum die Aufnahmeeffizienz der Mitochondrien verringern kann. Die in diesem Schritt verwendeten Mitochondrien sind frisch.

11. Messung der mitochondrialen Atemfunktion mittels hochauflösender Respirometrie

1. Instrumentenvorbereitung
   1. Reinigen Sie die Atemkammern, Elektrodenkompartimente und Stopfen.
   2. Setzen Sie in jede Kammer eine magnetische Rührstange und überprüfen Sie die Integrität der Sauerstoffelektrodenmembran.
2. Instrumentenkalibrierung
   1. Fügen Sie 2,1 ml mitochondrialen Atmungspuffer (MiR05, pH 7,10) in jede Atemkammer ein und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
   2. Gleichgewicht des hochauflösenden Respirometriesystems bei 37 °C für 30 Minuten und tägliche Luftkalibrierung nach der Stabilisierung der Sauerstoffbasislinie durchführen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie das Einleiten von Luftblasen in die Atemkammer, da sie die Signale der Sauerstoffelektroden stören und die Datenqualität beeinträchtigen. Die in diesem Schritt verwendeten Mitochondrien sind frisch.
3. Probenbelastung und Gleichgewicht
   1. Fügen Sie frisch isolierte Mitochondrien mit etwa 30 μg Protein in die Atemkammer ein und versiegeln Sie die Kammer.
   2. Gleiche die Kammer für 5–8 Minuten aus und messe den basalen Sauerstoffverbrauch.
      HINWEIS: Halten Sie Mitochondrien auf Eis und führen Sie Atmungsmessungen unmittelbar nach der Isolierung durch, um die Aktivität zu erhalten.
4. SUIT-Protokoll
   1. Fügen Sie nacheinander 5 μL Pyruvat (2 M), 10 μL Glutamat (2 M) und 10 μL Malat (400 mM) hinzu. Stabilisiere die Reaktion für 5 Minuten und nimm die Atmung des CI-Lecks auf.
   2. Fügen Sie 10 μL ADP (500 mM) hinzu, um oxidative Phosphorylierung zu induzieren und die CI-OXPHOS-Atmung zu dokumentieren. Fügen Sie 10 μL Magnesiumchlorid (0,3 m) hinzu.
   3. Fügen Sie 20 μL Succinat (1 M) hinzu und registrieren Sie die CI+CII OXPHOS-Atmung nach der Stabilisierung.
   4. Fügen Sie 2 μL ATP-Synthaseinhibitor hinzu (0,01 mM) und nehmen Sie die Protonenleckatmung auf.
   5. Fügen Sie CCCP (1 mM) schrittweise in drei 2-μL-Additionen im 2-Minuten-Intervall hinzu, bis der Sauerstoffverbrauch ein Plateau erreicht. Maximale Kapazität des Elektronentransfersystems aufzeichnen.
   6. Fügen Sie 1 μL Rotenon (1 mM) hinzu, um die Aktivität des Komplex-I zu hemmen.
   7. Fügen Sie 1 μL Antimycin A (5 mM) hinzu, um die Aktivität des Komplexes III zu hemmen und den Rest-Sauerstoffverbrauch zu erfassen.
   8. Fügen Sie 5 μL Ascorbat (800 mM) und 5 μL N,N,N',N'-Tetramethyl-p-Phenylendiamin (200 mM) hinzu. Erfassen Sie maximale komplexe IV-Atemaktivität nach der Stabilisierung.
      HINWEIS: Aliquot alle Reagenzien vor dem Einfrieren, um wiederholte Einfrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. Fügen Sie CCCP schrittweise hinzu, da eine übermäßige Entkopplung die mitochondriale Atmung hemmt.
5. Datenanalyse
   1. Erfassen Sie mitochondriale Atmungsparameter, einschließlich CI Leak, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII Leak, CI+CII ET, CII ET und CIV mithilfe der Datenanalysesoftware.
   2. Berechnen Sie das Atemkontrollverhältnis (RCR; Atmung Zustand 3/Zustand 4 Beatmung) und ATP-Produktionskapazität. Behalten Sie alle Werte bis zu drei signifikanten Ziffern für die statistische Analyse bei. Die für die Datenanalyse verwendete Software war Oroboros Datlab 8 (Oroboros Instruments).

Ergebnisse

Ein schematischer Überblick über den Workflow der mitochondrialen Isolierung und Reinigung ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle Verfahren wurden bei 4 °C durchgeführt, um die mitochondriale Integrität und funktionelle Aktivität zu erhalten. Frisch isoliertes Skelettmuskelgewebe wurde mit Trypsin zerkleinert und verdaut, um die Gewebedissoziation zu erleichtern, und anschließend in isotonem Isolationspuffer mit einem Glashomogenisator homogenisiert. Anschließ...

Diskussion

Die mitochondriale Transplantation ist eine aufkommende Strategie in der Zelltherapie und regenerativen Medizin, die die physiologische Funktion von Zellen mit beeinträchtigtem Energiestoffwechsel durch die Abgabe funktionell intakter Mitochondrien wiederherstellt. Neben der Regulierung des zellulären Energiestoffwechsels kann diese Technik wichtige biologische Prozesse wie Apoptose und oxidativen Stress modulieren und so neuartige therapeutische Möglichkeiten für eine Vielzahl

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	Mitochondrial Characterization
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	Reduce photobleaching of fluorescent dyes
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	Protein concentration assay
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	Beta-actin antibody was used to detect the purity of isolated mitochondria
BSA	Sigma	A6003	During isolation, it binds free fatty acids to protect mitochondrial activity.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	4 °C Centrifugation
CCCP	Solarbio	C6700	to uncouple mitochondrial oxidative phosphorylation and induce maximal proton leakage
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	Immunofluorescence Staining Observation
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	Mitochondrial Characterization
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	For nuclear counterstaining
D-mannitol	Solarbio	IM00402	maintain osmotic balance and prevent mitochondrial swelling during isolation
EGTA	Sigma	E4378	Commonly used in mitochondrial isolation buffers to protect mitochondrial function by specifically binding Ca2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	Culture of L929 cells
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	Used to grasp, hold and lift tissues
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	Used for tissue homogenization and isolation of mitochondria
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	It rapidly fixes and stabilizes cellular ultrastructure by cross-linking proteins, preventing autolysis to preserve the natural morphology of organelles.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	Provides a stable pH environment.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	Culture of L929 cells
JC-1	Solarbio	M8650	Detecting changes in the membrane potential of purified mitochondria.
L929 cell line	Procell	CL-0137	For mitochondrial endocytosis assay
Lead citrate	Sigma	15326	to stain ultrathin sections for fine subcellular structure observation.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	Culture of L929 cells
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	As a component of the transfer buffer, it is used to remove SDS and facilitate the transfer of proteins from the gel to the solid-phase membrane.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	Measure the absorbance of JC-1-stained mitochondria
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	Detection of Mitochondrial Membrane Potential in Skeletal Muscle
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	Kits for Extraction Based on Differential Centrifugation
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	For mitochondrial preservation
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	Mitochondrial Characterization
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	AS a buffer in solution preparation
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 targets Mouse IgG (H+L) in Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 targets to Rabbit IgG (H+L) in ELISA and Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	It is mainly used as a blocking agent to reduce background signal by occupying non-specific binding sites on the membrane.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	Determine mitochondrial respiratory function and oxygen metabolism.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	or postfixation to preserve lipids and enhance membrane contrast in TEM samples.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	Clean Muscle Tissue
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	Culture of L929 cells
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	Label cytoskeletal F-actin for fluorescence microscopic imaging
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Millipore (Merck)	IPVH00010	Western blotting
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	For protein separation by SDS-PAGE electrophoresis
Precast gradient polyacrylamide gel (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	Used for SDS-PAGE separation of mitochondrial and cellular total proteins
Protease inhibitor	Shaanxi Zhonghui Hecai Biomedical Technology	PL032	Inhibits the activity of endogenous and exogenous proteases, preventing the degradation of target proteins during sample processing.
RIPA lysis buffer	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PL001-2A	Used for total protein extraction of animal and cellular tissues
Sodium Chloride Injection (0.9%)	Xi’an Jingshuang Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd.	Approval No. H61020014	Cell/tissue experimental buffering, rinsing and osmotic pressure maintenance
Sterile gloves	Jiangsu Yangzi Lide Medical Devices Co., Ltd.	YMZ000-1	Isolate contamination and protect operators and experimental samples
Sucrose	Sucrose	S818048	Provides osmotic support and maintains mitochondrial morphology and functional integrity.
TBST	NCM Biotech	WB20500	Washing to reduce background, serving as a diluent for antibodies and blocking solutions, while protecting the stability of antigen-antibody binding by maintaining a stable pH and ionic environment.
Tissue Homogenate Assay Kit(contains Adenosine diphosphate (ADP),Succinate,Rotenone,Antimycin A,Oligomycin,Pyruvate,Malate, Glutamate,Ascorbate,N,N,N'N'- tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD))	Beijing Huawei Zhongyi Technology Co., Ltd.	023012	Detection of mitochondrial OCR in tissue homogenate adapted for Oroboros O2k respirometer
Tissue scissors	RWD Life Science Co., Ltd.	S12003-09	For cutting and dissecting soft tissues, separating organs and fascia in animal dissection
Transmission electron microscope	HITACHI	HT7800	Analyze the ultrastructural morphology of mitochondria
Trypsin	Plant Chem Medicine	PC-90001	Organ pre-digestion
Universal Antibody Diluent	NCM Biotech	WB100D	Antibody Diluent