Standardisierter Workflow für High-Content-Imaging und Datenverarbeitung

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für standardisierte High-Content-Bildgebung und Datenverarbeitung von mit Propidiumiodid (PI)/Hoechst 33342 gefärbten Zellen vor, um mittels automatisierter Bildaufnahme- und Analyseworkflows reproduzierbare Analysen der Zellviabilität durchzuführen.

Zusammenfassung

Um die Herausforderungen geringer Reproduzierbarkeit aufgrund operationeller Variationen bei der wissenschaftlichen Bildgebung sowie der Komplexität bei der Analyse einer großen Anzahl von Proben mit herkömmlichen Methoden zu bewältigen, stellen wir einen Protokollablauf zur Färbung von HT22-Zellen mit PI und Hoechst 33342 sowie zur anschließenden Bildaufnahme und Datenanalyse mittels des High-Content Imaging Systems vor. Dieser Arbeitsablauf zielt darauf ab, robuste Parameter für die Bildaufnahme einzurichten und strenge Qualitätskontrollstandards zu definieren. Er veranschaulicht die Bildaufnahmeeinstellungen des Geräts und den Workflow für drei verschiedene, vom Gerät bereitgestellte Bildverarbeitungsmethoden: Multi-Wavelength Cell Scoring (Multi), Live-Dead (Live) und Custom Module Editor (CME). Die Methoden zur Bildverarbeitung werden miteinander verglichen und gegenüber der traditionellen Methode, ImageJ, validiert, um ihre Wirksamkeit sicherzustellen. Die Studie fasst letztendlich einen Workflow zusammen, der das High-Content Imaging System zur Bestimmung der Zellviabilität unter Verwendung der Doppelfärbung mit PI und Hoechst nutzt. Durch die Standardisierung des gesamten Workflows von Bildaufnahme bis Datenverarbeitung verbessert die Studie die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit wissenschaftlicher Bildgebungsverfahren erheblich und leistet damit eine solide methodische Grundlage für den datenbasierten Vergleich zwischen verschiedenen Laboren und trägt so zum Fortschritt der wissenschaftlichen Forschung bei.

Einleitung

Das Hochdurchsatzmikroskopie-System dient als entscheidendes Werkzeug in der modernen wissenschaftlichen Forschung und ermöglicht die schnelle Bildgebung sowie die mehrparametrige Beurteilung verletzter oder unverletzter Zellen^1,2,3. Es spielt eine unabdingbare Rolle in zahlreichen Disziplinen. Im Bereich der Lebenswissenschaften unterstützt es Forscher dabei, die mikroskopische Welt von Zellen und Geweben zu erforschen^4,5. Beispielsweise ermöglicht die präzise Detektion fluoreszenzmarkierter Moleküle und Strukturen innerhalb von Zellen eine klare Visualisierung feiner zellulärer Strukturen und dynamischer Veränderungen⁶. In der Neurowissenschaftsforschung kann es eine dreidimensionale Bildgebung von Neuronen durchführen, was zur Analyse komplexer Verbindungen und Signalübertragungsmechanismen neuronaler Netzwerke beiträgt und wichtige Hinweise für das Verständnis von Gehirnfunktionen sowie der Pathogenese neurologischer Erkrankungen liefert^7,8,9.

Trotz der erheblichen Vorteile der Hochdurchsatz-Mikroskopie-Technologie bestehen mehrere Probleme hinsichtlich ihres Bildgebungsprozesses. In der Probenvorbereitung besteht ein hohes Maß an Subjektivität. Bei der biologischen Probenvorbereitung fehlen bei Verfahren wie der Zellbehandlung und Färbung relevante Standards. Hinsichtlich der Bildgebungsparameter ergeben sich erhebliche Unterschiede in Belichtungszeiten und der Auswahl von Mikrotiterplatten zwischen verschiedenen Laboren und Modellen von Hochdurchsatz-Mikroskopen. In der Datenverarbeitungsphase fehlt eine Standardisierung – von der Rauschunterdrückung und Kontrastanpassung der Rohbilder bis hin zur Identifizierung von Parametern und Bestimmung der Zielmerkmale. Diese Probleme führen direkt zu Verzerrungen in den mikroskopischen Bildergebnissen und verursachen eine Reproduzierbarkeitskrise.

Protokoll

Dieses Protokoll verwendet eine kommerzielle Zelllinie (HT22, ATCC) und beinhaltet keine menschlichen Versuchspersonen oder primäre menschliche Gewebe. Es wurden keine Tiere in dieser Studie verwendet.

1. Standardisierte Probenvorbereitung

1. Vorbereitung der HT22-Zellen
   1. Wenn die Konfluenz der HT22-Zellen 80 %^10,11 erreicht, wird das alte Medium verworfen. Die Zellen werden mit 0,25 %iger Trypsinlösung gelöst, wobei 1–2 min bei Raumtemperatur inkubiert wird.
   2. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) in dreifacher Menge im Vergleich zur 0,25 %igen Trypsinlösung hinzufügen, um die Ablösung zu stoppen. Die Zellsuspension in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen überführen.
   3. Zentrifugation bei 175 × g für 3 min bei Raumtemperatur, anschließend das Überstand verwerfen. Die Zellen in vollständigem DMEM resuspendieren, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
   4. Die Zellen mit einer Zellzählkammer zählen. 5.000 Zellen pro Vertiefung in 100 µL vollständigem Medium in eine 96-Loch-Platte aussäen¹².
   5. Die Platte 24 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren. Gruppierung der Proben, Applikation der Substanzen und Färbung entsprechend dem experimentellen Design in der 96-Loch-Platte durchführen.
      ​HINWEIS: Eine mit dem Bildgebungssystem kompatible 96-Loch-Platte verwenden. Eine Platte mit geeigneter Bodendicke und Geometrie gemäß den Herstellerangaben auswählen. Bei Ansprüchen an eine höhere Bildqualität werden Platten mit Glasboden (130–170 µm Bodendicke) empfohlen^13,14,15,16.
2. Färbeprotokoll
   1. Sicherstellen, dass die Zellen eine einzelne, gut dispergierte Monoschicht bilden und die Konfluenz 70 % nicht überschreitet, um Überlappungen der Zellen zu minimieren (Abbildung 1B).
   2. Die Proben gemäß den experimentellen Anforderungen gruppieren und nach der Behandlung mit der Färbung fortfahren. Die Arbeitslösungen der Farbstoffe mit einer Endkonzentration von 6,684 µg/mL für PI und 10 µg/mL für Hoechst 33342^17,18 herstellen.
   3. Das alte Medium aus der 96-Loch-Platte entfernen und jede Vertiefung zweimal mit jeweils 100 µL PBS waschen. Die Farbstoff-Arbeitslösung hinzufügen und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln zur Färbung inkubieren.
   4. Jede Vertiefung zweimal mit jeweils 100 µL PBS waschen, anschließend DMEM hinzufügen.
      HINWEIS: Abhängig vom experimentellen Design können sich die Parameter für die Probenaufbringung und Färbung unterscheiden.

2. Bildgebende Spezifikationen und Parametereinstellungen

1. Standards für Bildgebungsparameter
   ​HINWEIS: Diese Studie veranschaulicht lediglich den Widefield-Bildgebungsworkflow für das Gerät nach PI- und Hoechst-33342-Färbung.
   1. Schalten Sie das Gerät ein und starten Sie anschließend den Computer. Öffnen Sie die mit dem Gerät bereitgestellte Analyse-Software.
   2. Laden Sie die 96-Loch-Platte in das Gerät. Wählen Sie das Sichtfeld mit den Proben für die Bildaufnahme.
   3. Stellen Sie unter „Objective and Camera settings“ die Vergrößerung auf „20XPh1SPlanFluorELWDADM“ (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), die Kamerabinning auf „2“ und den Erfassungsmodus auf „Widefield“.
   4. Wählen Sie im Plattenmodus die entsprechenden Parameter der 96-Loch-Platte aus und passen Sie die Plattenparameter gemäß den Produktdaten zur Probengröße an.
   5. Wählen Sie unter „Site Option“ typischerweise 9 Felder pro Loch für eine dichte Bildaufnahme. Wählen Sie in den Autofokus-Optionen Lasergestütztes Fokussieren aktivieren.
   6. Passen Sie die Parameter des laserbasierten Autofokus unter „Autofocus“ basierend auf der gemittelten Bodendicke der Platte an, die an mindestens drei Probenlöchern gemessen wurde. Passen Sie entsprechend die Bodendicke, maximale Variation der Bodendicke, maximale Variation benachbarter Löcher, maximale intralokuläre Variation und maximale Plattenvariation an.
   7. Stellen Sie unter „Wavelengths“ die Anzahl der Wellenlängen auf 3 ein. Wählen Sie für die erste Beleuchtung DAPI. Aktivieren Sie unter „Shading Correction“ die Option „Auto Correction for FL“ (Abbildung 2B).
   8. Nachdem das Bild gefunden wurde, stellen Sie die anfängliche Belichtungszeit (ms) auf 20–30 ein. Beobachten Sie die aufgenommenen Bilder und passen Sie die Belichtung kontinuierlich an, um eine moderate Fluoreszenzintensität ohne Überbelichtung zu erreichen, und stellen Sie die Bit-Tiefe auf 16 (Abbildung 2A).
   9. Wählen Sie zur Fokuseinstellung Laser mit z-Versatz. Falls der Fokus nicht klar ist, aktivieren Sie „Use Z stack“, klicken Sie auf „Calculate Offset“ und wählen Sie einen geeigneten Fokusabstand. Aktivieren Sie Digital Confocal (info) und stellen Sie die Anpassungsparameter für Schärfe erhöhen und Rauschen reduzieren auf 0,200 ein.
      HINWEIS: Falls die Belichtung oder Bildschärfe nicht zufriedenstellend ist, passen Sie die Belichtung an und berechnen Sie die Offset-Parameter erneut.
   10. Wählen Sie für die zweite Beleuchtung Cy3. Übernehmen Sie dieselben Einstellungen wie in den Schritten 2.1.7–2.1.9.
   11. Wählen Sie für die dritte Beleuchtung TL 25. Übernehmen Sie dieselben Einstellungen wie in den Schritten 2.1.7–2.1.9.
       HINWEIS: Stellen Sie die Schattierungskorrektur je nach Kanal ein. Für TL 25 ist Auto Correction for TL zu wählen. In „Wavelengths“ muss der TL-Kanal für die Zellpositionierung und die Beobachtung der Morphologie eingestellt werden.
   12. Benennen Sie im Reiter „Run“ die Platte gemäß der Namenskonvention: Plattenname-Zelltyp-Versuchs-ID-Datum-Objektivvergrößerung-Bildgebungstyp. Bestätigen Sie die bildgebungsrelevanten Parameter unter „Description“.
   13. Klicken Sie auf „Acquire Plate“, um die Bildaufnahme zu starten. Schalten Sie nach Beendigung der Aufnahme nacheinander Software, Gerät und Computer aus.
       ​HINWEIS: Danach darf der Computer nur noch für den Bildexport, die Datenverarbeitung und die Ergebnisanalyse geöffnet werden.
2. Betriebsstandards und Anforderungen an die Bildgebung
   1. Zentrieren Sie das Sichtfeld auf das Loch, um Randeffekte zu vermeiden (Abbildung 1A). Verwenden Sie während der Einrichtung der Bildgebungsparameter die positive Kontrolle mit der höchsten Fluoreszenzintensität als Referenz. Wählen Sie beim Fokussieren zusätzlich ein Sichtfeld mit einer einzelnen Zellschicht, das sauber und frei von Verunreinigungen ist.
   2. Steuern Sie für die Kamera die Pixelwerte streng unterhalb von 60000 (Maximalwert ist 65535), um Sättigung zu verhindern, die einen dauerhaften Informationsverlust verursachen kann. Falls gesättigte helle Flecken oder Bereiche auftreten, verkürzen Sie die Belichtungszeit. Gleichzeitig sollte die Belichtungszeit nicht zu niedrig gehalten werden, da sonst das Rauschen das Bild dominieren wird.
   3. Bei schwachen Fluoreszenzsignalen sollte vorrangig die Belichtungszeit leicht erhöht werden, anstatt Parameter zwangsweise anzuheben, um irreversible Schäden durch Photobleaching zu vermeiden.
      HINWEIS: Für die Hellfeld-Bildgebung können diese Prinzipien angemessen gelockert werden, doch bleibt der Schwerpunkt weiterhin auf Signalintegrität und Probenschutz.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Randkonturen der Probe klar unterscheidbar sind, und überprüfen Sie, dass innere Feinstrukturen (wie Granula, Fasern, Organellen) deutliche Textur aufweisen, nicht unscharf sind, und dass das Streulicht im Hintergrund gleichmäßig verteilt ist, ohne lokale helle Stellen oder unscharfe Halo-Effekte. Vermeiden Sie strikt Über- und Unterfokussierung.
   5. Stellen Sie sicher, dass normale, positive, negative und experimentelle Gruppen vorhanden sind, und dass jede Behandlungsgruppe mindestens 3 parallele Löcher umfasst. Es wird empfohlen, die parallelen Löcher vertikal anzuordnen.

3. Bildverarbeitung und -analyse

HINWEIS: Dieses Dokument beschreibt drei Bildverarbeitungsmethoden, die von der Begleitsoftware des Geräts bereitgestellt werden und alle für das in dieser Studie verwendete Färbeprotokoll geeignet sind. Obwohl diese Methoden das gleiche zugrundeliegende Erkennungsprinzip teilen, unterscheiden sie sich in den spezifischen Verarbeitungstechniken und den Arten der Datenergebnisse. Der gleiche Arbeitsablauf für die Bildverarbeitung war wie folgt: Datei öffnen → Ursprungsbild mit der entsprechenden Verarbeitungsmethode laden → geeignete Kanalparameter festlegen → Maske generieren → Messdatentyp in „Measure“ einstellen → Analyse ausführen → Ergebnisse beobachten → Daten exportieren.

1. Öffnen Sie die mit dem Gerät mitgelieferte Analysesoftware → Platte überprüfen → Platte auswählen.
2. Wählen Sie in der Datumsansicht die Anordnung der Vertiefungen und wählen Sie ein Sichtfeld aus der positiven Gruppe als Referenz.
3. Wählen Sie unter „Run Analysis“ das entsprechende Verarbeitungsprogramm aus und legen Sie die Parameter für die Bildverarbeitung fest oder exportieren Sie das Bild.
4. Nachdem die Parameter eingestellt und gespeichert wurden, wählen Sie „Run on all wells“/„Run on selections“/„Run on displayed site“ entsprechend dem Parameter-Einstellungsobjekt.
5. Nachdem der Computer die Daten verarbeitet hat, wählen Sie im Reiter „Measurements“ das entsprechende Datenverarbeitungsprogramm unter „Analysis“ aus und wählen Sie verschiedene Messergebnisse unter „Measurement“ aus, um die Daten zu überprüfen.
6. Klicken Sie auf „Open Log“, um mit dem Export der Daten zu beginnen. Legen Sie die folgenden Details in den Parametereinstellungen für die drei Methoden der Bildverarbeitung fest:
   1. Bildverarbeitungsmethode eins: Multikanalige Zellbewertung
      1. Wählen Sie das Programm „Multi-Wavelength Cell Scoring“ aus und konfigurieren Sie die Einstellungen. Legen Sie die Anzahl der Wellenlängen fest. Wählen Sie Standard für den Algorithmus.
      2. Legen Sie die Erkennungsparameter für alle Kerne basierend auf den PI-Färbungsergebnissen fest. Das Standard-W1-Quellbild ist der DAPI-Kanal.
      3. Legen Sie die ungefähre minimale Breite auf 8–10 µm und die ungefähre maximale Breite auf 30–35 µm fest, basierend auf der Größe der zu erkennenden Einzelobjekte.
      4. Legen Sie die Intensität über dem lokalen Hintergrund auf 2.000–10.000 Graustufen fest. Verwenden Sie die Vorschau, um die Einstellungen zu testen und basierend auf den Erkennungsergebnissen anzupassen.
      5. Legen Sie die W2-Parameter basierend auf den Färbungsergebnissen mit Hoechst 33342 fest. Benennen Sie diesen Kanal. Das W2-Quellbild ist Cy3.
      6. Wählen Sie im Bereich „Stained area“ den durch diesen Kanal gefärbten Bereich als Kern aus. Verwenden Sie für nachfolgende Einstellungen die gleichen Einstellungen wie in den Schritten 3.6.1.3–3.6.1.4. Unter „Configure Summary Log“ oder „Configure Data Log (Cells)“ wählen Sie die entsprechende Parameterkonfiguration basierend auf den gewünschten Ergebnisparametern aus.
         HINWEIS: Üblicherweise wird „Configure Summary Log“ verwendet, um die benötigten Datentypen festzulegen, während „Configure Data Log (Cells)“ verwendet wird, wenn eine spezielle Markierung einzelner Zellen erforderlich ist.
      7. Führen Sie einen Testlauf durch, um die Erkennung zu beobachten. Wenn Sie mit den Erkennungsergebnissen zufrieden sind, speichern Sie die Einstellungen.
   2. Bildverarbeitungsmethode zwei: Lebend-Tot
      1. Wählen Sie das Programm „Live-Dead“ aus und beginnen Sie mit der Konfiguration der Einstellungen. Legen Sie nacheinander die Parameter für Wellenlänge 1 und Wellenlänge 2 fest.
      2. Unter „Wavelength 1 Parameters“ setzen Sie die Quelle für Wellenlänge 1 auf DAPI. Der Standardalgorithmus ist „Standard“.
      3. Legen Sie basierend auf den Färbungsbedingungen den Typ der gefärbten Zellen auf „Alle Zellen“ und den gefärbten Bereich auf „Kern“ fest. Legen Sie die ungefähre minimale Breite, die ungefähre maximale Breite und die Intensität über dem lokalen Hintergrund mit denselben Einstellungen wie bei der Methode „Multikanalige Zellbewertung“ fest.
      4. Aktivieren Sie „Split touching objects“ und testen Sie mit der Vorschau.
      5. Unter „Wavelength 2 Parameters“ setzen Sie die Quelle für Wellenlänge 2 auf Cy3.
      6. Legen Sie basierend auf der spezifischen Färbung den Typ der gefärbten Zellen auf „Tot“ und den gefärbten Bereich auf „Kern“ fest. Legen Sie die ungefähre minimale Breite, die ungefähre maximale Breite und die Intensität über dem lokalen Hintergrund mit denselben Einstellungen wie bei der Methode „Multikanalige Zellbewertung“ fest.
      7. Klicken Sie auf „Configure Summary Log“ und wählen Sie die Parameterkonfiguration basierend auf den benötigten Datentypen aus. Führen Sie einen Testlauf durch, um die Erkennung zu beobachten. Wenn Sie mit den Erkennungsergebnissen zufrieden sind, speichern Sie die Einstellungen.
   3. Bildverarbeitungsmethode drei: Entwicklermodus CME
      1. Wählen Sie das Programm „Custom Module (CME)“ aus und beginnen Sie mit der Konfiguration der Einstellungen. Richten Sie Bildnamen und Kanäle ein.
         HINWEIS: Um die nachfolgenden Parametereinstellungen zu erleichtern, sollten diese im Allgemeinen auf die bei der Bildaufnahme verwendeten Kanalnamen gesetzt werden.
      2. Öffnen Sie im Bereich „Find Objects“ die Funktion „Simple Threshold“, um die Erkennung für den gesamten Satz festzulegen.
      3. Legen Sie die Quelle entsprechend dem Bildnamen fest. Tragen Sie basierend auf dem 16-Bit-Graustufenwertebereich 0 bei „Threshold Low“ und 65535 bei „Threshold High“ ein.
      4. Benennen Sie das Verarbeitungsergebnis unter „Result“, wenden Sie es an und beobachten Sie die Markierungssituation. Öffnen Sie im Bereich „Find Objects“ die Funktion „Find Blobs“, um ein Maskierungsergebnis zu erzeugen.
      5. Legen Sie die Quelle wie bei „Simple Threshold“ entsprechend dem Bildnamen fest. Legen Sie die ungefähre minimale Breite, die ungefähre maximale Breite und die Intensität über dem lokalen Hintergrund gemäß den Einstellungen der Methode „Multikanalige Zellbewertung“ fest.
      6. Benennen Sie das Verarbeitungsergebnis unter „Result“, wenden Sie es an und beobachten Sie das Markierungsergebnis. Verwenden Sie für das Erkennungsergebnis von „Find Blobs“ das Werkzeug „Modify Objects“, um zu filtern, zu vergrößern, zu verkleinern und zu invertieren.
      7. Unter „Measure“ setzen Sie „Modified“. Geben Sie in „Measurement Inputs“ 1 für „Standard Area Value“ ein und aktivieren Sie „Create Object Overlay“.
      8. Wählen Sie unter „Objects to Measure“ die Quelle der markierten Objekte in „Mask of Objects“ und das zu messende Quellbild in „Image to Measure“. Wählen Sie basierend auf den benötigten Verarbeitungsergebnisparametern den entsprechenden „Measurement Name“, wenden Sie es an und beobachten Sie das Parametererkennungsergebnis.
      9. Nach Bestätigung der Parametereinstellungen speichern Sie die Konfiguration.
   4. Allgemeine Methode: ImageJ
      ​HINWEIS: Analysieren Sie die Bildergebnisse mithilfe der ImageJ-Methode für fluoreszierende Bilder¹⁹ und führen Sie anschließend eine vergleichende Analyse mit den drei Methoden dieses Geräts durch.
      1. Öffnen Sie die ImageJ-Software. Bildimport: Datei → Öffnen → Wählen Sie das zu analysierende ursprüngliche Graustufenbild aus.
      2. Konvertieren Sie das Bild in 8-Bit: Bild → Typ → 8-Bit. Erkennung des Graustufenwerts: Bild → Anpassen → Schwellwert → Standard, Rot → Hintergrund dunkel aktivieren → Festlegen → OK.
         HINWEIS: Falls die Erkennung des roten Bereichs unbefriedigend ist, ersetzen Sie „Standard“ durch eines der anderen 16 integrierten ImageJ-Erkennungsmodelle oder passen Sie den Schieberegler im Dialogfeld an.
      3. Parameter festlegen: Analysieren → Messungen festlegen. Aktivieren Sie im Popup-Dialogfeld „Fläche“, „mittlerer Grauwert“, „integrierte Dichte“, „auf Schwellwert beschränken“, „Bezeichnung anzeigen“, „Weiterleitung auf Keine“ standardmäßig und geben Sie 2 für „Dezimalstellen (0–9)“ ein. Klicken Sie auf OK.
      4. Erkennungsergebnisse analysieren: Analysieren → Messen. Ergebnisse speichern: Im Popup-Ergebnisdialogfeld Datei → Speichern unter, und wählen Sie den Speicherort aus.
7. Bildexport
   1. Wählen Sie ein hochwertiges Sichtfeld aus einer positiven Vertiefung als Referenzstandard aus.
      HINWEIS: Die grundlegenden Qualitätsanforderungen sind Authentizität, genaue Fokussierung, geeignete Belichtung (16-Bit) und angemessener Kontrast (ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis ist besser). Zu den hohen Qualitätsanforderungen gehören deutliche Merkmale, Kontrast, Praktikabilität, intuitive morphologische Veränderungen und hervorgehobene Schlüsselpunkte.
   2. Wählen Sie unter „Run Analysis“ im Bereich „Analysis“ „ExportPro“ aus und starten Sie „Run Setup for Analysis“. Wählen Sie unter „Select output options“ je nach Bildanforderungen „Einzelkanal“, „Farbüberlagerung“, „Bild verkleinern (optional)“ und „Maßstabsleiste (optional)“ aus.
   3. Wählen Sie die zu exportierenden fluoreszierenden Kanalbilder für jedes Sichtfeld aus. Wählen Sie unter „Individual Channel“ eine Farbe für jeden Kanal, beispielsweise Blau für den DAPI-Kanal und Monochrom für den TL-Kanal.
   4. Wählen Sie unter „Color overlay“ die Kanäle entsprechend BRIGHTFIELD, ROT, BLAU und GRÜN in der angegebenen Reihenfolge aus (wählen Sie die Farbwellenlänge für die Farbüberlagerung). Setzen Sie die Anzahl auf 100; beobachten Sie das Vorschaubild und akzeptieren Sie das Vorschauergebnis.
   5. Wählen Sie unter „output“ den Ordner aus, in dem die exportierten Bilder gespeichert werden sollen, unter „Export to folder“. Starten Sie den Durchlauf.
      HINWEIS: Bilder aus derselben Charge dürfen nicht separat exportiert werden; eine Charge von Bildern bezieht sich auf eine Sammlung von Bildern aus vier Kernproben: negative Kontrolle, positive Kontrolle, Basis-Kontrollgruppe und Ziel-Experimentiergruppe, die alle unter vollständig identischen experimentellen Bedingungen erhalten wurden.
8. Vergleich der Bildverarbeitungsmethoden
   1. Wählen Sie 9 Sichtfelder aus und vergleichen Sie die traditionelle manuelle Zählung von toten und lebenden Zellen mit den Methoden „Multikanalige Zellbewertung“, „Lebend-Tot“, „CME“ und „ImageJ“ hinsichtlich der Zählung lebender Zellen, toter Zellen und des Verhältnisses von toten zu lebenden Zellen. Verwenden Sie GraphPad Prism Version 10.1, um eine einfaktorielle ANOVA durchzuführen, begleitet von Tukeys Test für multiple Vergleiche, um die Unterschiede zu analysieren.
   2. Wählen Sie 81 Sichtfelder aus und vergleichen Sie die Unterschiede in der Zellzählung, Fläche und Intensität zwischen den Methoden „Multikanalige Zellbewertung“, „Lebend-Tot“, „CME“ und „ImageJ“. Verwenden Sie GraphPad Prism Version 10.1, um eine einfaktorielle ANOVA durchzuführen, begleitet von Tukeys Test für multiple Vergleiche, um die Unterschiede zu analysieren.
      HINWEIS: Zellkultur- und Färbungsversuche müssen im Biosicherheitswerkstatt durchgeführt werden. Entsorgen Sie Abflüssigkeiten, Spitzen und andere Versuchsrückstände gemäß den Laborvorschriften. Stellen Sie während des gesamten Experiments einen vollständigen Schutz sicher.

Ergebnisse

Auswirkungen der standardisierten Probenvorbereitung auf die Bildqualität

Die Plattenparameter wurden so konfiguriert, dass das Instrument die Zellbildschicht zuverlässig lokalisieren konnte. Proben, die als einzelne Zellschicht mit mäßiger Konfluenz präpariert wurden, erleichterten die Bildfokussierung bei verschiedenen Objektivvergrößerungen und verbesserten die Bilderkennung sowie die quantitative Analyse. Standardisierte Probenvorbereitung und optimierte Plattenparameter minimierten effektiv Randeffekte, Zellüberlappungen und andere Faktoren, die zu einer schlechten Bildqualität beitragen (Abbildung 1).

Vergleich der Funktionen der Bildberechnungsmethode

Die PI/Hoechst-33342-Doppelfärbungsmethode wurde verwendet, um lebende und tote Zellen zu unterscheiden. Die Methoden Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead und CME verarbeiteten diese Bilder erfolgreich, indem sie Objekte anhand der Fluoreszenzintensität und Objektgröße identifizierten, während ImageJ Objekte anhand von Grauwerten identifizierte. Die mit diesen Methoden erzielten Markierungsergebnisse waren im Allgemeinen vergleichbar (Abbildung 3A–E).

Die Multilambda-Zellbewertungsmethode erforderte eine Kernanfärbung, um alle Zellen zu identifizieren (Abbildung 4A). Sie kann bis zu 7 Bildkanäle verarbeiten und Parameter wie Zellanzahl, Fläche und optische Dichte berechnen.

Die Live-Dead-Methode war flexibler als die Multilängenwellen-Cell-Scoring-Methode. Beide Kanäle bieten Module für die Kernfärbung, die Cytoplasmafärbung oder eine kombinierte Kern-Cytoplasma-Färbung, um alle Zellen, lebende Zellen oder tote Zellen zu identifizieren. Die Funktion „Überlappende Objekte trennen“ separiert sich überlagernde Objekte und ermöglicht so die Berechnung von Zellanzahl, Fläche und optischer Dichte. Da sie jedoch nur Zweitkanaldaten verarbeitete, eignete sie sich besonders gut für PI/Hoechst-33342-Doppelfärbungs-Assays zur Bestimmung der Zellviabilität (Abbildung 4B).

Die CME-Methode basierte auf benutzerdefinierter Bildverarbeitungslogik. Die Anzahl der verarbeiteten Kanäle entsprach der Anzahl der aufgezeichneten Kanäle. Die Erkennungsergebnisse wurden mithilfe von Funktionen wie Lücken füllen, Objekte invertieren, Objekte vergrößern, Objekte verkleinern, logische Operationen, Objekte am Rand entfernen, markierte Objekte behalten, Objekte vergrößern ohne Berührung, Objektzentren markieren, Wasserscheide, markierte Objekte entfernen und Maskenfilter verfeinert, um Verunreinigungen und andere Störquellen zu eliminieren. Diese Methode ermöglichte zudem die Berechnung mehrerer Objektparameter für eine mehrdimensionale Analyse.

ImageJ verarbeitete mehrere Kanäle nicht gleichzeitig. Bei Bildserien mit erheblichen Hintergrundvariationen waren eine manuelle Verarbeitung und eine Anpassung der Schwellenwerte erforderlich, was die Subjektivität erhöhte und die Reproduzierbarkeit verringerte.

Analyse der Unterschiede in den Verarbeitungsergebnissen

Eine vergleichende Analyse der Bildverarbeitungsmethoden zeigte keine signifikanten Unterschiede in den Gesamtzellzahlen, Totzellzahlen oder im Verhältnis von toten zu allen Zellen zwischen den Methoden Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME, ImageJ und der traditionellen manuellen Zählung über 9 Sichtfelder hinweg (Abbildung 5A–C, Zusatzdatei 1).

Ebenso wurde kein signifikanter Unterschied im Verhältnis von abgestorbenem Zellbereich zu gesamtem Zellbereich zwischen den Methoden Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME und ImageJ beobachtet. Allerdings wurde ein signifikanter Unterschied im Verhältnis der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität abgestorbener Zellen zur Fluoreszenzintensität aller Zellen zwischen den Methoden Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead und CME basierend auf Daten aus 81 Sichtfeldern beobachtet (Abbildung 5D–F).

Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein standardisierter Workflow für das High-Content-Imaging-System etabliert (Abbildung 6).

Abbildung 1: Bildgebungsresultate von geringer Qualität. (A) Das Sichtfeld liegt nahe der Vertiefungskante und zeigt Schatten der Vertiefungskante (in diesem Fall BV2-Zellen). (B) Die Pfeile a und b zeigen die Überlappung von Zellen im DAPI-Kanal und im TL-Kanal, verursacht durch übermäßige Konfluenz, sogar eine zweite Zellschicht oder schwebende Zellen. (C) Im Sichtfeld befinden sich keine Zellen; die Plattenparameter sind falsch eingestellt, der Fokus liegt nicht auf der Zellschicht, oder die Zellen wurden nicht angefärbt, sodass in diesem Sichtfeld kein Bild entsteht. Maßstabsbalken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Einstellungen der Bildgebungsparameter. (A) Pfeil a zeigt auf das Symbol für die Bit-Tiefe. (B) Pfeil b zeigt die Position der Schattierungskorrektur an. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Ergebnisse desselben Bildausschnitts, identifiziert mit mehreren Methoden. (A) Ergebnisse der Multi-Wellenlängen-Zellbewertungsmaske: Die grauen und roten Bereiche stellen alle in dem DAPI-Kanal identifizierten Zellkerne dar, wobei die roten Bereiche die in dem Cy3-Kanal identifizierten Kerne von toten Zellen repräsentieren. (B) Ergebnisse der Lebend-Tot-Maske: Die grünen und roten Bereiche stellen alle in dem DAPI-Kanal identifizierten Zellkerne dar, wobei die roten Bereiche den in dem Cy3-Kanal identifizierten Kernen von toten Zellen entsprechen. (C) Ergebnis der CME-Maske: Die gelben und blauen Bereiche stellen alle in dem DAPI-Kanal identifizierten Zellkerne dar, wobei die blauen Bereiche den in dem Cy3-Kanal identifizierten Kernen von toten Zellen entsprechen. (D) ImageJ-Maskenergebnis im DAPI-Kanal. (E) ImageJ-Maskenergebnis im Cy3-Kanal. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Teilweise Parameter-Einstellungsseiten. (A) Die durch a markierte Stelle zeigt, dass der erste Kanal der Multikanal-Zellzählung nur den Zellkern auswählen kann; (B) b und c zeigen, dass Live-Dead nur zwei Kanäle verarbeiten kann und eine Doppelfärbung mit PI/Hoechst 33342 für tote und lebende Zellen unterstützt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Unterschiede in den Ergebnissen der Fluoreszenzbildverarbeitung. (A) Unterschiede in der Gesamtanzahl der Zellen zwischen den fünf Verarbeitungsmethoden. (B) Unterschiede in der Anzahl der toten Zellen zwischen den fünf Verarbeitungsmethoden. (C) Unterschiede im Verhältnis von toten Zellen zu allen Zellen zwischen den fünf Verarbeitungsmethoden. (D) Unterschiede im Verhältnis von toten Zellen zu allen Zellen zwischen den vier Verarbeitungsmethoden. (E) Unterschiede im Verhältnis der Fläche toter Zellen zur Gesamtzellfläche zwischen den vier Verarbeitungsmethoden. (F) Unterschiede im Verhältnis der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität toter Zellen zur durchschnittlichen Fluoreszenzintensität aller Zellen über die vier Verarbeitungsmethoden hinweg. Alle Fehlerbalken in den Diagrammen stellen Standardabweichungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Standardisierter Arbeitsablauf. Übersichtsdiagramm des standardisierten Verfahrens für die Probenpräparation, Fluoreszenzfärbung, bildbasierte Hochdurchsatzanalyse, Bildverarbeitung, Bildexport und Datenanalyse. Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Ansicht dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1. Rohdaten für die in Abbildung 5 dargestellte Analyse der Zellanzahl, Fläche und Fluoreszenzintensität. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Mithilfe der Doppelfärbung mit PI und Hoechst zur Bestimmung der Zellviabilität kann das Hochdurchsatz-Instrument beispielsweise innerhalb desselben Ansatzes mithilfe integrierter Algorithmusmodule schnell und in hoher Durchsatzleistung die Zellviabilität berechnen. Diese Methode weist mehrere Vorteile auf, darunter geringes Probenvolumen, niedrige Kosten, minimale Zellschädigung, schwache Fluoreszenzlöschung, Beständigkeit gegen Löschung sowie die Möglichkeit, mehrere Bilder aufzunehmen. Außerdem beträgt die Bildaufnahmedauer für eine 96-Loch-Platte in der Regel nur 30–45 min²⁰.

In dem experimentellen Protokoll ist darauf zu achten, die folgenden Schritte zur Sicherstellung der Bildqualität einzuhalten: Zunächst ist eine geeignete Plattendichte sicherzustellen, um einerseits eine zu hohe Zelldichte zu vermeiden, die das Bild mit Zellen füllen kann, und andererseits eine zu geringe Dichte, die dazu führen kann, dass Zellen während der Färbung und der Waschschritte weggespült werden. Zweitens ist der Farbstoff gründlich zu waschen, um zu verhindern, dass Restfarbstoff die Bildaufnahme beeinträchtigt. Bei Zellen mit geringer Adhäsion sollten das Hinzufügen und Entfernen von Flüssigkeit vor und nach der Färbung vorsichtig und langsam erfolgen, wobei ein vertikales Hinzufügen vermieden werden sollte. Es sollte eine seitliche Zugabe an die Wandung erfolgen, um zu verhindern, dass im Zentrum des Sichtfeldes Zellen verlorengehen; hierbei ist besonders auf die Ablösung toter Zellen während Vitalitätsassays zu achten. Gegebenenfalls kann die Probenplatte zentrifugiert werden, um experimentelle Fehler zu reduzieren. Drittens ist eine geeignete Belichtungszeit zu wählen. Eine zu lange Belichtung verlängert die gesamte Aufnahmezeit und kann dazu führen, dass das Detektionsfenster verpasst wird, was möglicherweise zu einer Überbelichtung einiger Zellen oder einer Erkennung des Hintergrunds führt. Eine zu kurze Belichtung kann unvollständige Bilddaten zur Folge haben und charakteristische Details verloren gehen lassen.

Wenn während der Bildaufnahme kein klares Bild gefunden werden kann, sollte die Ursache anhand des Zellzustands, von Farbstoffrückständen, Parametereinstellungen und anderen Faktoren systematisch verfolgt werden. Befinden sich während des Experiments keine Zellen am Boden des Wells, wird im Sichtfeld kein Bild erkannt. Bilden sich zwei oder mehr ungleichmäßige Zellschichten am Boden des Wells, wird die Fokussierung erschwert, was zu einem unscharfen Bild führt. Ein übermäßiger Farbstoffrückstand kann zu einer starken Hintergrundfluoreszenz führen, wodurch das Zielobjekt im Bild weniger deutlich hervortritt. Große Bereiche von Farbstoffrückständen können Zellen im Sichtfeld verdecken, während kleine Rückstands­partikel, die in ihrer Größe Zellen ähneln, die anschließende Bilderkennung und Segmentierung stören können. Wenn die Plattenhöhe und die Wellhöhe nicht gemäß den Herstellerangaben für die 96-Well-Platte eingestellt sind, wird entweder kein Bild im Sichtfeld erscheinen oder die Probenposition kann verschoben werden, was möglicherweise die Objektivlinse beschädigt.

Aufgrund der Flexibilität und Einfachheit der Bedienung sowie der guten Ergebnisse bei der Datenverarbeitung ist Live-Dead das optimale Bildverarbeitungsmodul für die PI- und Hoechst-Doppelfärbung. Dieses Programm ist speziell auf PI- und Hoechst-Färbeverfahren optimiert und im Vergleich zu anderen Methoden und Software-Lösungen einfach zu bedienen, berechnet schnell und ermöglicht ein unkompliziertes Batch-Laden von Bildern in die Datenbank bei gleichbleibenden Parametereinstellungen. Die Ergebnisse sind besser vergleichbar als die mit der derzeit gängigen Software ImageJ erzielten. Unterschiedliche experimentelle Modi können entsprechende proprietäre Methoden oder den allgemeinen Berechnungsmodus Multi-Wavelength Cell Scoring nutzen; dabei sind die proprietären Methoden benutzerfreundlicher, während der allgemeine Berechnungsmodus weniger Einschränkungen bezüglich der Färbeprotokolle aufweist. Unterschiedliche Färbeprotokolle erfordern jeweils unterschiedliche optimale Bildverarbeitungsmodulen. Es sollten rechnergestützte Methoden entwickelt werden, die auf die jeweiligen experimentellen Zielsetzungen zugeschnitten sind. Die ExportPro-Methode zum Bildexport ist einfach und leicht zu erlernen und ermöglicht die Vorschau von Referenzobjekten. Sie ist besonders für Anfänger geeignet, verfügt über eine grafische Benutzeroberfläche, die die Bedeutung der Parameter klar darlegt und Messungen vereinfacht, senkt so die Hürden für die Analyse mit mehreren Software-Tools und spart Zeit beim Erlernen der Werkzeuge.

Diese Studie validierte lediglich ein grundlegendes Färbeprotokoll. Als Referenz müssen andere experimentelle Protokolle, die sich deutlich davon unterscheiden, noch gegen den neuen Standard validiert werden.

Das Hochdurchsatzmikroskopie-System fungiert als zentrale Technologieplattform, die hochauflösende Bildgebung, die simultane Erfassung mehrerer Parameter, automatisierte quantitative Analyse und Hochdurchsatz-Screening^21,22,23 integriert. Durch das integrierte Design der bildgebenden und rechnerischen Fähigkeiten des Geräts wird erwartet, dass die Entwicklung und Etablierung entsprechender experimenteller Protokolle und Rechenmodelle für zahlreiche bestehende Bildgebungsversuche ermöglicht wird^7,24, wodurch letztendlich die Konsistenz und Vergleichbarkeit der von verschiedenen Bedienern zu unterschiedlichen Zeitpunkten und in verschiedenen Chargen gewonnenen Daten verbessert wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5-mL-Zentrifugenröhrchen	Labigic Technology Co., Ltd.	MCT-001-150
1000 µL-Pipettenspitzen	Labigic Technology Co., Ltd.	35423003E
15-mL-Zentrifugenröhrchen	Labigic Technology Co., Ltd.	CT-002-15A
2,5 µL-Pipettenspitzen	Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.	B10T
200 µL-Pipettenspitzen	Labigic Technology Co., Ltd.	T-001-200
50-mL-Zentrifugenröhrchen	Labigic Technology Co., Ltd.	CT-002-50A
96-Well-Zellkulturplatte	Corning Incorporated	3599
Verstellbare Ein-Kanal-Pipette, 0,1–2,5 μL	Eppendorf SE	3120000216
Verstellbare Ein-Kanal-Pipette, 100–1000 μL	Eppendorf SE	3120000267
Verstellbare Ein-Kanal-Pipette, 20–200 μL	Eppendorf SE	3120000259
Verstellbare Ein-Kanal-Pipette, 2–20 μL	Eppendorf SE	3120000232
Zellkulturschale	Corning Incorporated	430167
Kryoröhrchen	Labigic Technology Co., Ltd.	BS-20-ST
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	D8371
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Life Technologies Limited	11966-025	In dieser Studie wurde das vollständige DMEM durch Zugabe von 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung und 89 % DMEM hergestellt.
ESCO CelCulture CO2-Inkubator	Esco Micro Pte. Ltd.	CCL-170B-8
Fötales Rinderserum (FBS, Superfein)	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210-50
Fluoreszenzfarbstoffe Hoechst 33342	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	B8040
HT22-Zelle	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0697
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ ist eine der im Manuskript verwendeten Bildverarbeitungssoftware.
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System	Molecular Devices, LLC	ImageXpress Micro Confocal	Im Manuskript wird „High-Content Imaging System“ als Ersatz für den Gerätenamen verwendet.
Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit und Gefriermöglichkeit	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.	L530R
MetaXpress High-Content-Bildaufnahme- und Analyse-Software	Molecular Devices, LLC		Die Software ist eine Ergänzung zum ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System. Im Manuskript bezieht sich „Die mit dem Gerät bereitgestellte Analyse-Software“ auf diese Software.
OptiMair vertikaler laminarer Luftstromschrank	Esco Micro Pte. Ltd.	ACB-4E1
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging Inc.	PM996
PBS	Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd	YC-5013
Penicillin-Streptomycin-Lösung	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	PB180120
Propidiumiodid-Lösung (PI)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	C0080
Trypsin-EDTA-Lösung	BasalMedia Technology Co., Ltd.	S310KJ