Expression des m6A-Reader-Proteins YTHDC2 in einem chinesischen klinischen Kohortenstudium zum nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie bewertet die Expression von YTHDC2 beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom unter Verwendung von Bioinformatik und qRT-PCR. Während die Datenbankanalysen eine Herunterregulation und prognostische Relevanz nahelegen, zeigt die klinische Validierung keinen signifikanten Unterschied. Die Ergebnisse unterstreichen Widersprüche und deuten auf eine begrenzte diagnostische Genauigkeit sowie die Notwendigkeit weiterer Validierungen vor einer klinischen Anwendung hin.

Zusammenfassung

Das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (NSCLC) bleibt weltweit eine der führenden Ursachen für krebsbedingte Sterblichkeit, wobei nur begrenzte Biomarker für eine frühe Diagnose und Prognose zur Verfügung stehen. Die RNA-Modifikation N6-Methyladenosin (m6A) und ihre Leseproteine wie YTHDC2 spielen entscheidende Rollen in der Genregulation und Tumorentstehung. Diese Studie zielt darauf ab, das Expressionsprofil von YTHDC2 in NSCLC-Geweben mittels Bioinformatik und quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) zu bewerten, den Zusammenhang zwischen YTHDC2 und klinisch-pathologischen Merkmalen zu untersuchen und dessen potenzielle klinische und biologische Relevanz für zukünftige Forschungsarbeiten zu erörtern. Genexpressions- und Überlebensdaten aus Datenbanken wurden hinsichtlich ihrer prognostischen Genauigkeit analysiert. Die Expression von YTHDC2 wurde in NSCLC-Geweben einer chinesischen klinischen Kohorte quantifiziert und die klinisch-pathologischen Merkmale analysiert. Analysen öffentlicher Datenbanken zeigten, dass YTHDC2 in NSCLC-Geweben herunterreguliert ist (p < 0,05) und mit dem Überleben der Patienten assoziiert ist, obwohl die prognostische Aussagekraft gering war (AUC ≈ 0,5). Die qRT-PCR-Analyse von 19 gepaarten Tumor- und angrenzenden Normalgeweben ergab keinen statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,537) in der YTHDC2-Expression zwischen Tumorgewebe und angrenzendem Gewebe. Insgesamt deuten die Analysen öffentlicher Datenbanken darauf hin, dass YTHDC2 möglicherweise herunterreguliert ist und eine potenzielle prognostische Relevanz im NSCLC besitzt, doch eine unabhängige klinische Validierung in unserer Kohorte bestätigte keine signifikante differentielle Expression. Diese Ergebnisse verdeutlichen erhebliche Heterogenität zwischen groß angelegten Datensätzen und realen Kohorten und legen nahe, dass YTHDC2 allein wahrscheinlich kein zuverlässiger diagnostischer oder prognostischer Biomarker ist und für eine klinische Anwendbarkeit mit weiteren molekularen Markern kombiniert werden müsste.

Einleitung

Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC), das Plattenepithelkarzinom und Adenokarzinom umfasst, ist die am häufigsten diagnostizierte Lungenkrebsform und eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle weltweit¹. Globale Krebsstatistiken zeigen, dass Lungenkrebs eine der Hauptursachen für Krebstodesfälle ist². Neuere Fortschritte in Diagnostik, Chirurgie, Strahlentherapie und molekular gezielter Therapie haben die Prognose des NSCLC aufgrund der späten Erstdiagnose und der häufig asymptomatischen frühen Krankheitsphase nicht signifikant verbessert³. Dies unterstreicht die Notwendigkeit neuer Biomarker zur Identifizierung, prognostischen Beurteilung und Therapieeffektivitätsbewertung bei NSCLC-Patienten.

m6A ist die erste identifizierte und häufigste RNA-Modifikation bei Eukaryoten und ist an der RNA-Stabilität, Translation und Transkription beteiligt⁴. m6A-Modifikationen sind dynamisch und reversibel und werden durch Methyltransferasen (Writer), Demethylasen (Eraser) und spezifische Bindungsproteine (Reader) vermittelt⁵. Unter diesen moduliert YTHDC2, ein wichtiges m6A-Reader-Protein, die RNA-Stabilität und die Translationsrate⁶. Neuere Studien zeigen, dass YTHDC2 bei der Regulation mehrerer Krebsarten eine Rolle spielt, entweder durch Hemmung von Zellwachstum und Invasion oder durch Induktion des Zelltods⁷. Studien haben außerdem die klinische Relevanz weiterer m6A-Reader-Proteine, darunter YTHDF1, YTHDF2 und YTHDC1, beim Fortschreiten von Lungenkrebs, bei der Immunregulation und der Prognose hervorgehoben, was die Bedeutung einer systematischen Bewertung einzelner m6A-Reader in unabhängigen Patientenkohorten unterstreicht^8,9,10. Bei NSCLC liegen signifikant niedrige YTHDC2-Spiegel vor, die mit fortgeschrittenen Tumorstadien, Lymphknotenmetastasen und einer schlechten Prognose der Patienten assoziiert sind, was darauf hindeutet, dass YTHDC2 ein antitumorales Faktor sein könnte¹¹. In-vitro- und In-vivo-Experimente zeigen zudem, dass eine hohe Expression von YTHDC2 die Zellproliferation und Metastasierung bei Lungenkrebs hemmt⁷.

In dieser Studie wurde die Regulation von YTHDC2 beim NSCLC durch integrierte computergestützte Analysen und experimentelle Validierung mittels qRT-PCR untersucht. Ebenso wurde der Zusammenhang zwischen der YTHDC2-Expression und den klinisch-pathologischen Merkmalen sowie der Patientenprognose analysiert. Obwohl zunehmend Hinweise aus öffentlichen Datenbanken auf eine Dysregulation von YTHDC2 beim NSCLC hindeuten, berichten publizierte Studien widersprüchliche Ergebnisse hinsichtlich des Ausmaßes und der klinischen Bedeutung dieser Dysregulation, und unabhängige Validierungen in gut charakterisierten klinischen Kohorten, insbesondere in asiatischen Populationen, sind weiterhin begrenzt. Zudem stützten sich die meisten früheren Studien vorwiegend auf öffentliche transkriptomische Datensätze oder experimentelle Modelle, wobei vergleichsweise wenige bioinformatische Ergebnisse mit einer unabhängigen klinischen Validierung kombinierten. Durch die Kombination großangelegter öffentlicher transkriptomischer Analysen mit einer unabhängigen qRT-PCR-Validierung in einer chinesischen klinischen Kohorte zielte diese Studie darauf ab, die Reproduzierbarkeit früherer Befunde zu bewerten und die translative Lücke zwischen Analysen öffentlicher Datenbanken und klinischen Proben aus der Realität zu schließen. Daher verfolgte diese Studie das Ziel, die YTHDC2-Expression systematisch unter Verwendung integrierter Bioinformatik- und klinischer Validierungsansätze zu bewerten und ihre potenzielle biologische und klinische Relevanz beim NSCLC zu untersuchen. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die YTHDC2-Expression beim NSCLC dysreguliert ist und dass die Integration bioinformatischer Analysen mit einer unabhängigen klinischen Validierung eine zuverlässigere Einschätzung ihrer diagnostischen und prognostischen Bedeutung ermöglicht als jeder einzelne Ansatz für sich genommen.

Protokoll

Die Studie wurde vom Ethikkomitee der Hainan Medical University (Genehmigungsnummer HMC1984.24) genehmigt und erfolgte gemäß der Deklaration von Helsinki (in der Fassung von 2013).

Studienteilnehmer

Anhand der Leitlinien der Chinesischen Medizinischen Vereinigung für die Diagnose und Behandlung von Lungenkrebs (Ausgabe 2024) wurde eine Studie an 50 Lungenkrebspatienten durchgeführt, die zwischen 2017 und 2024 im Sanya Central Hospital in der Provinz Hainan diagnostiziert wurden. Die CSCO-Stadieneinteilung (2024) erfolgte entsprechend der AJCC-Ausgabe 8 zur Gewährleistung der Vergleichbarkeit zwischen Studien, wie bereits in chinesischen Kohorten validiert¹², wobei zwei unabhängige Onkologen die Ergebnisse überprüften, um Konsistenz sicherzustellen. Der Patientenauswahlprozess, die Verfügbarkeit von Gewebeproben, die Beurteilung der RNA-Qualität sowie die endgültige Probenauswahl für die qRT-PCR-Analyse sind in Abbildung 1 zusammengefasst.

Studien Daten

Diese Studie verwendete Bioinformatik, um die Expressionslevel von YTHDC2 im NSCLC und deren Zusammenhang mit klinisch-pathologischen Merkmalen zu analysieren, wodurch Einblicke in potenzielle Mechanismen gewonnen wurden. Die bioinformatischen Analysen wurden ausschließlich unter Verwendung öffentlich zugänglicher RNA-Sequenzierungsdaten aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA) durchgeführt, einschließlich Proben von Lungenadenokarzinomen (LUAD), Plattenepithelkarzinomen der Lunge (LUSC) und entsprechendem normalen Lungengewebe, die über das GDC-Datenportal (https://portal.gdc.cancer.gov/) heruntergeladen wurden. Der heruntergeladene Datensatz enthielt RNA-Sequenzierungs-Expressionsdaten zusammen mit verfügbaren klinischen Variablen (Patienten-ID, Proben-ID, Alter, Geschlecht, pathologisches Stadium, Überlebensstatus und Gesamtüberlebenszeit) für geeignete TCGA-LUAD- und TCGA-LUSC-Fälle. Proben ohne Genexpressions- oder Überlebensinformationen wurden von den nachgeschalteten Überlebens- und ROC-Analysen ausgeschlossen. Der in dieser Studie verwendete Datensatz ist als Zusatzdatei 1 verfügbar. Es wurden keine klinischen Proben des Sanya Central Hospital für die bioinformatischen Analysen verwendet. Detaillierte Verfahren für die GEPIA-, Kaplan-Meier-Plotter- und survivalROC-Analysen sind im folgenden Abschnitt Bioinformatische Analyse beschrieben. Der vollständige bioinformatische Workflow, einschließlich Datenerfassung, Vorverarbeitung, Genexpressionsanalyse, Überlebensanalyse und ROC-Analyse, ist in Abbildung 2 zusammengefasst.

Einschluss- und Ausschlusskriterien

Die Ein- und Ausschlusskriterien der Patienten sind in Tabelle 1 dargestellt. Eine Power-Analyse mit Hilfe von Software zur statistischen Power-Analyse ergab, dass mindestens 26 Fälle pro Gruppe eine Power von 80 % ermöglichen, einen moderaten Effekt (d = 0,8, α = 0,05, zweiseitig) nachzuweisen. Obwohl die ursprüngliche Rekrutierung auf 50 Paare in der Lungenkrebsgruppe abzielte, umfasste die endgültige qRT-PCR-Analyse nach Ausschluss von Proben aufgrund der Gewebe- oder RNA-Qualität 30 Tumorproben und 19 Proben normalen angrenzenden Gewebes. Diese Verringerung der Stichprobengröße spiegelt klinische Gegebenheiten im realen Umfeld wider und unterstreicht die Bedeutung der RNA-Integrität und der Gewebeverfügbarkeit in translationsmedizinischen Studien. Bei n = 19 für Vergleiche beträgt die minimale nachweisbare Effektgröße d = 1,0 (80 % Power, α = 0,05). Die Studie war daher ausreichend dimensioniert, um große, jedoch keine kleinen bis moderaten Unterschiede in der YTHDC2-Expression nachzuweisen.

Gewebeproben und quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)

Die pathologischen Diagnosen wurden von zwei verschiedenen Pathologen in einer Doppelblindstudie festgestellt. Die Tumorreinheit wurde von Pathologen geschätzt (>70 % maligne Zellen) und mittels ESTIMATE (TCGA) bestätigt. Angrenzende Normalgewebe wurden makrodisseziert, um eine stromale Kontamination zu minimieren. Die histologischen Typen des Lungenkarzinoms umfassten Lungenadenokarzinom und Plattenepithelkarzinom, mit 26 Fällen von Lungenadenokarzinom und 4 Fällen von Plattenepithelkarzinom. Die klinische Stadieneinteilung der 50 Lungenkrebspatienten erfolgte gemäß den Stadien-Kriterien der „Leitlinien der Chinesischen Medizinischen Gesellschaft für Lungenkrebs (2024-Ausgabe)“. Pathologisch bestätigte NSCLC-Proben (n = 50) repräsentierten typische klinische Verteilungen (siehe Tabelle 2). Von den ursprünglich 50 eingeschlossenen Patienten erfüllten 30 Tumorgewebeproben und 19 gepaarte angrenzende Normalgewebeproben die Kriterien für die RNA-Qualität. Da für eine gepaarte statistische Analyse Proben desselben Patienten erforderlich sind, erfolgte der Vergleich der Expression in Tumor- und angrenzendem Normalgewebe anhand der 19 verfügbaren gepaarten Proben. Diese klinischen Proben wurden ausschließlich zur experimentellen Validierung mittels qRT-PCR verwendet und unabhängig von den öffentlichen TCGA-Datensätzen, die für die bioinformatische Analyse herangezogen wurden, ausgewertet. Die ausgewählten Proben wurden unmittelbar nach pathologischer Bestätigung aufgearbeitet und vor der RNA-Extraktion unter RNase-freien Bedingungen behandelt. Dieser Teilsatz spiegelt die Fälle wider, bei denen sowohl eine ausreichende Gewebemenge als auch hochwertige Gesamt-RNA (RNA-Integritätszahl, RIN) >7,0) erreicht werden konnte. Die Gesamt-RNA-Konzentration und -reinheit wurden vor der reversen Transkription gemessen, und nur Proben mit ausreichender RNA-Qualität (RIN >7,0) wurden für die nachgeschaltete Analyse einbezogen. Gleichmäßige Mengen an Gesamt-RNA wurden vor der quantitativen PCR gemäß dem Herstellervorschrift in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Dieser Prozess gewährleistete die Validität der analysierten Genexpressionsdaten. Die qRT-PCR-Experimente wurden auf einem Echtzeit-PCR-Thermocycler unter Verwendung eines sondenbasierten quantitativen PCR-Assays durchgeführt. Alle Reaktionen wurden im Dreifachansatz sowie jeweils mit No-Template-Kontrollen durchgeführt, um die analytische Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Die PCR-Amplifikation erfolgte unter folgenden Zyklenbedingungen: eine initiale Enzymaktivierungs- und Denaturierungsphase bei 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen mit Denaturierung bei 95 °C für 15 s und Annealing/Extension bei 60 °C für 60 s. Die Fluoreszenzsignale wurden am Ende jedes Amplifikationszyklus erfasst. Alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien stammten von kommerziellen Anbietern (siehe Materialienübersicht). Die in der qRT-PCR verwendeten Primer- und Sondensequenzen sind in Tabelle 3.

Bioinformatische Analyse

Analyse der Genexpression von YTHDC2 mittels GEPIA-Datenbank

Die GEPIA-Datenbank wurde zur Analyse der YTHDC2-Expression in NSCLC verwendet. Der GEPIA-Webserver (http://gepia.cancer-pku.cn/) wurde über einen Webbrowser aufgerufen. Das Modul „Expression DIY“ wurde ausgewählt, das Gensymbol "YTHDC2" eingegeben, die Datensätze LUAD und LUSC ausgewählt, die standardmäßigen Normalisierungsparameter beibehalten, und Differenzial-Expressions-Boxplots wurden direkt über die GEPIA-Oberfläche generiert. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert.

Kaplan-Meier-Plotter-Datenbank zur Überlebensanalyse von Lungenkrebspatienten

Die Studie analysierte den Zusammenhang zwischen der Expression von YTHDC2 und der Prognose bei Lungenkrebspatienten unter Verwendung der Kaplan-Meier-Plotter-Datenbank. Es wurde der Lungenkrebs-Datensatz ausgewählt, das Gen-Symbol "YTHDC2" eingegeben, die automatisch ausgewählte optimale Cutoff-Option angewendet, und Kaplan-Meier-Kurven für das Gesamtüberleben sowie das Überleben nach Progression wurden mit den standardmäßigen Analyseeinstellungen erstellt. Die Patienten wurden automatisch anhand des von der Kaplan-Meier-Plotter-Plattform bestimmten optimalen Cutoffs in Gruppen mit hoher und niedriger Expression eingeteilt, und Hazard-Ratios mit entsprechenden 95 %-Konfidenzintervallen wurden mithilfe der standardmäßigen Einstellungen der Plattform generiert.

Ausführen von R-Paketen in der R-Software zum Erstellen von ROC-Kurven

RNA-Sequenzierungs-Expressionsdaten und die entsprechenden klinischen Metadaten für berechtigte TCGA-LUAD- und TCGA-LUSC-Fälle wurden aus dem GDC-Datenportal heruntergeladen. Die heruntergeladenen Datensätze wurden anhand der Patientenidentifikatoren zusammengeführt und für nachfolgende Analysen in R importiert. Mithilfe des survivalROC-Pakets wurden zeitabhängige ROC-Kurven zu Vorhersagezeitpunkten von 1, 3 und 5 Jahren erstellt, und die entsprechenden Flächen unter der Kurve (AUC-Werte) wurden berechnet, um die prognostische Leistung der YTHDC2-Expression zu bewerten. Für die survival ROC-Analyse wurden ausschließlich TCGA-LUAD- und TCGA-LUSC-Patienten mit verfügbarer RNA-Seq-Expressions- und Überlebensinformation berücksichtigt. Die lokale klinische Kohorte wurde nicht für die Überlebensvorhersage verwendet, da Langzeit-Follow-up-Daten nicht verfügbar waren.

Untersuchung der YTHDC2-Expression im Gewebe mittels qRT-PCR

Zur Analyse der Genexpression wurde eine qRT-PCR durchgeführt. Entsprechend den vom Hersteller empfohlenen Reaktionsbedingungen wurden gleiche Volumina an cDNA zu jeder Reaktion hinzugefügt. Die Amplifikation erfolgte mittels eines sondebasierten quantitativen PCR-Assays, wobei Fluoreszenzdaten automatisch am Ende jedes Amplifikationszyklus erfasst wurden. Kurzgefasst umfasste der RNA-Extraktionsprozess mehrere Schritte, darunter Probenvorbereitung, Deparaffinierung, Entfernung von Restflüssigkeit, Proteinase-K-Digestion, Inkubation, Zentrifugation, DNase-Behandlung, Zugabe von DNase I sowie Ethanolpräzipitation. Die Probe wurde anschließend an eine auf Silica basierende RNA-Reinigungssäule gebunden und bei 8.000 × g für 30 s zentrifugiert. Die Säule wurde danach mit Waschpuffer 1, Waschpuffer 2 und mit Ethanol verdünntem Waschpuffer 2 gewaschen und bei 13.000 × g für 2 min getrocknet. Die RNA wurde eluiert, indem 70 µL RNase-freies Wasser in die Mitte der Säulenmembran gegeben und anschließend bei 13.000 × g für 1 min zentrifugiert wurde. Jedes Primerpaar zeigte ein einzelnes Amplifikationsprodukt, was durch Schmelzkurvenanalyse bestätigt wurde, bevor die relative Genexpression berechnet wurde. Die Primer-Effizienz (90–110 %) wurde mithilfe von Standardkurven vor der Probenauswertung validiert. Schmelzkurvenanalysen bestätigten das Vorhandensein einzelner Amplikone und das Fehlen von Primerdimeren. Die relative YTHDC2-Expression wurde nach der 2^-ΔCt-Methode berechnet, bei der Ct-Werte auf das endogene Referenzgen GAPDH normalisiert wurden. Da die Expressionswerte als normalisierte Expressionsniveaus und nicht als Faltungsänderungen relativ zu einer Kalibratorprobe angegeben wurden, werden die Ergebnisse als 2^−ΔCt-Werte berichtet. GAPDH wurde als Housekeeping-Gen ausgewählt, da seine Expression im Vergleich zu den getesteten Alternativen (ACTB, CV = 12 %; 18S rRNA, CV = 18 %) eine minimale Variabilität (CV < 5 %) aufwies, was den Kriterien zur Auswahl von Referenzgenen in m6A-Studien entspricht.

Statistische Analyse

Die statistischen Analysen wurden mit statistischer Software durchgeführt, einschließlich der Erstellung von Grafiken und Diagrammen. Zur Analyse quantitativer und kategorialer Daten zur YTHDC2-Genexpression bei NSCLC-Patienten wurde die R-Software für bioinformatische Analysen und die Erstellung von ROC-Kurven verwendet. ROC-Kurven und AUC wurden zur Bewertung der diagnostischen Leistung der YTHDC2-Expression bei der Vorhersage des Überlebens herangezogen. Bei regressionsbasierten Analysen wurden Effektgrößen (Odds Ratios) mit entsprechenden 95 %-Konfidenzintervallen angegeben, wo zutreffend. Der Wilcoxon-Test für abhängige Stichproben wurde verwendet, um die YTHDC2-Expression zwischen gepaarten Tumor- und angrenzenden normalen Gewebeproben zu vergleichen, während die Pearson-Korrelationsanalyse zur Beurteilung des Zusammenhangs zwischen der YTHDC2-Expression und klinisch-pathologischen Merkmalen eingesetzt wurde. Korrelationskoeffizienten (r) und entsprechende p-Werte wurden angegeben. Da die qRT-PCR-Daten aus gepaarten Tumor- und angrenzenden normalen Gewebeproben derselben Patienten bestanden und die Genexpressionsdaten nicht normalverteilt waren, wurde der Wilcoxon-Test für abhängige Stichproben zur Untersuchung der YTHDC2-Expressionsniveaus zwischen den gepaarten Geweben verwendet. Dieser Test setzt keine Normalverteilung der Daten voraus und wird häufig bei schiefen biologischen Daten eingesetzt. Alle statistischen Tests waren zweiseitig, und ein p <0,05 galt als statistisch signifikant. Stetige Variablen wurden vor der Analyse auf Normalverteilung geprüft. Stetige Variablen werden je nach Fall als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median (Interquartilsabstand) angegeben.

Ergebnisse

Expression des YTHDC2-Gens in Tumoren basierend auf der TCGA-Datenbank

Abbildung 3 veranschaulicht die Assoziation zwischen NSCLC und YTHDC2, indem die Expressionsniveaus von YTHDC2 in verschiedenen Krebserkrankungen mithilfe des GDC-Tools in der TCGA-Datenbank untersucht werden.

Expression des YTHDC2-Gens im NSCLC in der GEPIA-Datenbank

483 Lungenadenokarzinom-Gewebeproben, 347 normale Lungen-Gewebeproben, 486 Plattenepithelkarzinom-Gewebeproben der Lunge und 338 normale Lungen-Gewebeproben wurden durch zusätzliche Untersuchung der YTHDC2-Expressionslevel in Lungenadenokarzinom (LUAD) und Plattenepithelkarzinom der Lunge (LUSC) innerhalb der GEPIA-Datenbank erhalten. Durch statistische Analysen zeigte sich, dass sowohl Lungenadenokarzinom- als auch Plattenepithelkarzinom-Gewebe deutlich niedrigere YTHDC2-Expressionslevel aufweisen als normales Lungengewebe (p < 0,05), wie in Abbildung 4 veranschaulicht.

GEPIA-Analyse der YTHDC2-Expression über die pathologischen Stadien hinweg

Die GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) Datenbank wurde verwendet, um ein Stadiumsdiagramm zu erstellen, um die differentielle Expression von YTHDC2 über die Stadien des NSCLC hinweg zu bewerten. Wie in Abbildung 5 gezeigt, wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede in der YTHDC2-Expression über die pathologischen Stadien des NSCLC hinweg beobachtet (p = 0,644).

Kaplan-Meier-Analyse von YTHDC2 und Überleben bei Lungenkrebs

Die Kaplan-Meier-Plotter-Datenbank wurde verwendet, um eine Kaplan-Meier-Überlebensanalyse des Gens YTHDC2 durchzuführen. Laut den Ergebnissen wiesen Patienten mit hoher YTHDC2-Expression ein signifikant besseres Gesamtüberleben (OS) auf als Patienten mit niedriger Expression (p < 0,05). Wie in Abbildung 6A (OS) dargestellt, hatten Patienten mit Lungenkrebs, die höhere Spiegel von YTHDC2 exprimierten, eine bessere Prognose, und dieser Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,05). Laut Abbildung 6B (PPS) zeigte die Gruppe mit hoher YTHDC2-Expression im Vergleich zur Gruppe mit niedriger Expression im Post-Progression-Survival-(PPS)-Datensatz eine bessere Prognose; der Unterschied war statistisch signifikant (p < 0,05).

YTHDC2 Überlebensraten-Vorhersagemodell

Die zeitabhängige ROC-Analyse basierend auf TCGA-RNA-seq-Expressions- und Überlebensdaten zeigte eine begrenzte Vorhersagekraft der alleinigen YTHDC2-Expression für das Überleben bei NSCLC mit AUC-Werten von 0,50 (95 % KI: 0,38–0,62), 0,51 (95 % KI: 0,39–0,63), 0,52 (95 % KI: 0,40–0,64) und 0,52 (95 % KI: 0,39–0,65) nach 1, 3, 5 bzw. 8 Jahren (Abbildung 7). Alle AUC-Konfidenzintervalle enthielten den Wert 0,5, was einer Leistung entspricht, die nicht besser ist als der Zufall. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die alleinige YTHDC2-Expression keine ausreichende Diskriminierungskraft für die Überlebensvorhersage besitzt und nicht als eigenständiger prognostischer Biomarker betrachtet werden sollte. Die Kombination mit klinisch-pathologischen Variablen oder multiplen Gen-Signaturen könnte die Vorhersagegenauigkeit verbessern.

YTHDC2-Expression in Tumorgeweben im Vergleich zu Normalgeweben mittels qRT-PCR

Die Genexpression von YTHDC2 wurde in malignen und angrenzenden normalen Geweben von NSCLC-Patienten mittels qRT-PCR untersucht. Der normalisierte YTHDC2-Expressionswert (2^−ΔCt) betrug 3,24 ± 2,34 in malignen Geweben und 3,60 ± 1,70 in benachbarten normalen Geweben. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der YTHDC2-Expression zwischen 19 gepaarten NSCLC-Tumorgeweben und den jeweils entsprechenden angrenzenden Normalgeweben (p = 0,537), wie in Abbildung 8 dargestellt. Während bioinformatische Analysen großer Datensätze auf eine signifikante Herunterregulation von YTHDC2 bei NSCLC hindeuten, zeigte die qRT-PCR in unserer Kohorte keinen signifikanten Unterschied, was mögliche Diskrepanzen aufgrund der Kohortengröße, der Probenvielfalt und der technischen Variabilität verdeutlicht. Zudem weist das niedrige AUC (0,5) darauf hin, dass YTHDC2 allein über keine ausreichende diagnostische oder prognostische Genauigkeit verfügt.

YTHDC2-Expression und klinisch-pathologische Merkmale bei NSCLC

Die Studie umfasste 50 Personen mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC). Es handelte sich um 32 männliche Patienten (64,00 %) und 18 weibliche Patienten (36,00 %) mit einem mittleren Alter von 63,10 ± 9,85 Jahren. Das Alter reichte von 37 bis 86 Jahren. Von den Patienten hatten 25 zuvor geraucht, 25 hatten noch nie geraucht. Unter den pathologischen Typen befanden sich neun Fälle von Plattenepithelkarzinom (18,00 %) und einundvierzig Fälle von Lungenadenokarzinom (82,0 %). 22 Patienten befanden sich entsprechend der klinischen Stadieneinteilung der CSCO in den Stadien III–IV (44,00 %), 28 in den Stadien I–II (56,00 %). Bei 24 Patienten lagen keine Lymphknotenmetastasen vor, bei sechsundzwanzig Individuen (54,00 %) hingegen schon. Bei neun Patienten handelte es sich um schlecht differenzierte Karzinome (18,00 %), bei 41 Patienten um gut bis mäßig differenzierte Tumoren (82,00 %).

Die Assoziation zwischen klinisch-pathologischen Merkmalen und den YTHDC2-Expressionsniveaus in NSCLC-Geweben wurde untersucht. Unterschiede in der YTHDC2-Expression wurden zwischen pathologischen Subtypen sowie hinsichtlich des Lymphknoten-Metastasenstatus beobachtet (p < 0,05). Da jedoch nur vier Proben aus Plattenepithelkarzinomen verfügbar waren, sollte der Vergleich der pathologischen Subtypen vorsichtig interpretiert und als explorativ betrachtet werden. Wie in Abbildung 9A,B dargestellt, war die YTHDC2-Expression im Plattenepithelkarzinom signifikant höher als im Lungenadenokarzinom und signifikant höher in NSCLC-Geweben mit Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu solchen ohne Lymphknotenmetastasen (5,70 ± 2,53 vs. 3,83 ± 0,91, p = 0,027). Da jedoch lediglich vier Proben aus Plattenepithelkarzinomen eingeschlossen wurden, sollte der Vergleich zwischen den pathologischen Subtypen mit Vorsicht interpretiert und als explorativ angesehen werden, bis er in größeren Kohorten validiert ist. Eine höhere YTHDC2-Expression bei Patienten mit Lymphknotenmetastasen könnte auf eine mögliche Assoziation zwischen YTHDC2 und dem Vorliegen von Lymphknotenmetastasen hindeuten; diese Beobachtung sollte jedoch aufgrund der begrenzten Stichprobengröße vorsichtig bewertet werden und bedarf der Validierung in größeren, unabhängigen Kohorten. Alter, Rauchgeschichte, klinisches CSCO-Stadium und histologische Differenzierung beeinflussten die YTHDC2-Expression hingegen nicht signifikant (p > 0,05). Weitere Informationen sind in Tabelle 4, Tabelle 5 und Abbildung 9 enthalten.

Binäre logistische Regression der Lymphknotenmetastasierung bei NSCLC

In Übereinstimmung mit der Korrelationsanalyse war die Expression von YTHDC2 signifikant mit der Lymphknotenmetastasierung assoziiert (p < 0,05). Unter Verwendung der Lymphknotenmetastasierung als abhängige Variable sowie des Alters, des Geschlechts, der Rauchanamnese, des Tumorstadiums, des pathologischen Typs, der YTHDC2-Expressionsstärke und des Differenzierungsgrades als unabhängige Variablen wurde bei NSCLC-Patienten eine binäre logistische Regressionsanalyse durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die YTHDC2-Expression bei NSCLC-Patienten signifikant mit der Lymphknotenmetastasierung assoziiert war (p = 0,027, OR = 2,286, 95 % KI: 1,101–4,748).

In den allgemeinen klinischen Daten zeigte sich eine statistisch signifikante Korrelation zwischen dem Tumorstadium von NSCLC-Patienten und Lymphknotenmetastasen (p = 0,007, OR = 27, 95 % CI: 2,504–291,186). Alter, Geschlecht, Rauchgeschichte, pathologischer Typ und Differenzierungsgrad waren hingegen nicht signifikant mit Lymphknotenmetastasen bei NSCLC korreliert (p > 0,05), wie in Tabelle 6 dargestellt.

Datenverfügbarkeit: Die Datensätze, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind im Zenodo-Repository verfügbar (DOI: 10.5281/zenodo.21409961). Das Repository enthält die klinischen Metadaten aus dem TCGA, Probenauswertungen, Spezifikationen zur Datenerhebung und das Analysemanifest, die für die bioinformatischen Analysen verwendet wurden. Weitere Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Abbildung 1: Flussdiagramm zur Patientenauswahl und Gewebeeinschlusskriterien für die qRT-PCR-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Workflow der bioinformatischen Analysen zur Bewertung der YTHDC2-Expression und prognostischen Bedeutung bei NSCLC Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Expression des YTHDC2-Gens in der TCGA-Datenbank. Die YTHDC2-Expressionsniveaus bei Lungenadenokarzinom (LUAD) und Plattenepithelkarzinom der Lunge (LUSC) wurden mit denen in normalen Lungenproben anhand von RNA-Sequenzierungsdaten verglichen, die über das Genomic Data Commons (GDC)-Datenportal aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA) bezogen und mittels der GEPIA-Webplattform analysiert wurden. Die Daten wurden über die GEPIA-Plattform ausgewertet. Die statistische Signifikanz wurde anhand eines p-Werts < 0,05 bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Differenzielle Expression von YTHDC2 beim NSCLC basierend auf der Analyse der GEPIA-Datenbank. Die YTHDC2-Expressionsniveaus bei Lungenadenokarzinom (LUAD) und Plattenepithelkarzinom der Lunge (LUSC) wurden mit denen in normalem Lungengewebe anhand von Daten aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA) und den Genotype-Tissue Expression (GTEx)-Projekten über die GEPIA-Plattform verglichen. Boxplots stellen normalisierte Genexpressionsniveaus dar. Die statistische Signifikanz wurde mit einem p-Wert < 0,05 bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Stadienweise Expressionsanalyse von YTHDC2 beim NSCLC unter Verwendung der GEPIA-Datenbank. Die Expressionsebenen von YTHDC2 wurden über verschiedene pathologische Stadien (I–IV) des NSCLC mithilfe der GEPIA-Plattform analysiert. Das Stadiumsdiagramm veranschaulicht die Variation der Genexpression über die Tumorstadien hinweg. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede in der YTHDC2-Expression zwischen den Stadien beobachtet (p = 0,644). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Kaplan-Meier-Überlebensanalyse der YTHDC2-Expression bei NSCLC-Patienten (Kaplan-Meier Plotter). (A) Gesamtüberleben (OS): Kaplan-Meier-Überlebenskurven zum Vergleich des Gesamtüberlebens von NSCLC-Patienten, die anhand des optimalen Cut-offs („auto-select best cutoff“), das vom Kaplan-Meier-Plotter-Tool bereitgestellt wird, in Gruppen mit hoher (n = 140) und niedriger (n = 364) YTHDC2-Expression eingeteilt wurden. Der log-rank-Test wurde zur Beurteilung der statistischen Signifikanz verwendet (p = 0,0093); Hazard Ratio (HR) = 0,61; 95 % Konfidenzintervall (KI): 0,42–0,89. Eine erhöhte YTHDC2-Expression ist mit einem signifikant besseren Gesamtüberleben assoziiert. (B) Überleben nach Progression (PPS): Kaplan-Meier-Überlebenskurven zum Vergleich des Überlebens nach Progression bei NSCLC-Patienten, die anhand des optimalen Cut-offs („auto-select best cutoff“), das vom Kaplan-Meier-Plotter-Tool bereitgestellt wird, in Gruppen mit hoher (n = 181) und niedriger (n = 296) YTHDC2-Expression eingeteilt wurden. Der log-rank-Test wurde für den statistischen Vergleich verwendet (p = 4,2 × 10⁻⁵); Hazard Ratio (HR) = 0,63 (95 % Konfidenzintervall: 0,51–0,79). Eine hohe YTHDC2-Expression ist mit einem signifikant längeren Überleben nach Progression assoziiert. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: YTHDC2-Überlebensratenvorhersagemodell. Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurven zur Bewertung der Vorhersagegenauigkeit von YTHDC2 für das Gesamtüberleben bei TCGA-LUAD- und TCGA-LUSC-Patienten mit verfügbaren RNA-seq-Expressions- und Überlebensdaten zu den Zeitpunkten 1, 3, 5 und 8 Jahren. AUC-Werte: 1 Jahr = 0.50, 3 Jahre = 0.51, 5 Jahre = 0.52 und 8 Jahre = 0.52. Die gestrichelte Diagonale zeigt den Zufall (AUC = 0,5) an. Die Analyse wurde mit dem survival ROC-Paket in R durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: YTHDC2-Expression in gepaarten NSCLC-Tumor- und angrenzenden Normalgeweben, gemessen mittels qRT-PCR. Die relative YTHDC2-Expression wurde nach der 2^–ΔCt -Methode berechnet und auf GAPDH normalisiert. Die Expressionswerte stellen normalisierte Expressionsniveaus dar, nicht Faltungsänderungen relativ zu einer Kalibratorprobe. Die statistische Analyse erfolgte anhand der 19 verfügbaren gepaarten Tumor–angrenzendes Normalgewebe-Paare für den gepaarten Vergleich. Die Daten sind als individuelle gepaarte Beobachtungen mit Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Unterschiede zwischen den gepaarten Proben wurden mittels des Wilcoxon-Test für verbundene Stichproben analysiert (p = 0,537). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 9: Zusammenhang zwischen der YTHDC2-Expression und klinisch-pathologischen Merkmalen bei NSCLC-Patienten. (A) YTHDC2-Expression in verschiedenen pathologischen Typen mit höherer Expression im Plattenepithelkarzinom im Vergleich zum Adenokarzinom (p < 0,05). (B) YTHDC2-Expression in Abhängigkeit vom Lymphknoten-Metastasenstatus mit höherer Expression bei Patienten mit Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu Patienten ohne Metastasen (p < 0,05). (C) YTHDC2-Expression über verschiedene histologische Differenzierungsgrade hinweg ohne statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,181). (D) YTHDC2-Expression über die klinischen CSCO-Stadien hinweg ohne statistisch signifikanten Unterschied (p = 0,08). Die YTHDC2-Expressionslevel wurden mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) gemessen und mit der 2^–ΔCt-Methode berechnet, normiert auf GAPDH. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Statistische Vergleiche erfolgten mittels Wilcoxon-Rangsummentest. *p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

S. Nr.	Einschlusskriterien	Ausschlusskriterien
1	Alter ≥18 Jahre, unabhängig vom Geschlecht.	Diagnose weiterer maligner Erkrankungen.
2	Bestätigte NSCLC-Diagnose gemäß den klinischen Leitlinien für Lungenkrebs der Chinesischen Medizinischen Vereinigung (Ausgabe 2024).	Vorliegen chronischer Atemwegs- oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen (z. B. COPD, Lungenherz, Herzinsuffizienz).
3	Vorhandensein vollständiger klinischer Daten, einschließlich demografischer Angaben, serumgebundener Tumormarker und kontrastverstärkter CT-Bildgebung des Thorax, sowie unterschriebene informierte Einwilligung.	Schwere Organfunktionsstörungen, einschließlich Niereninsuffizienz (eGFR <30 ml/min/1.73m²) oder Leberzirrhose.
4	Therapie-naive Patienten ohne vorherige tumorbasierte Therapien.	Besondere Bevölkerungsgruppen, einschließlich schwangerer oder stillender Frauen (bestätigt durch β-hCG-Test, falls anwendbar).
5	Vorhandensein ausreichender Tumor- und/oder angrenzender Gewebeproben, geeignet für die molekulare Analyse.	Schlechte Probenqualität, einschließlich unzureichenden Gewebes oder degradierter RNA (bestätigt durch pathologische Begutachtung).

Tabelle 1: Einschluss- und Ausschlusskriterien für NSCLC-Patienten in der Studie

Gewebetyp	Angepaarte Proben analysiert (n)	Relative Expression (Mittelwert ± SD)
Tumorgewebe	19	3.24 ± 2.34
Passendes angrenzendes Normalgewebe	19	3.60 ± 1.70

Tabelle 2: Expression von YTHDC2 in gepaarten NSCLC-Tumoren und angrenzenden Normalgeweben. Die relative Expression von YTHDC2 wurde mittels der 2^–ΔCt-Methode gemessen und auf GAPDH normalisiert. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Der statistische Vergleich der 19 gepaarten Tumor–angrenzenden Normalgewebe-Proben erfolgte mit dem Wilcoxon-Test für verbundene Stichproben (p = 0.537).

Zielgen	Primer/Sonde	Sequenz (5′→3′)
YTHDC2	Vorwärts (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	Rückwärts (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	Sonde (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	Vorwärts (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	Rückwärts (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	Sonde (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

Tabelle 3: Primer- und Sondensequenzen, die für die quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) verwendet wurden. Die Expression von YTHDC2 wurde mittels TaqMan-Chemie unter Verwendung von GAPDH als interne Kontrolle quantifiziert.

Merkmale	Kategorie	n	%
Pathologischer Typ	Adenokarzinom	41	82
	Plattenepithelkarzinom	9	18
CSCO-Stadieneinteilung	I–II	28	56
	III–IV	22	44
Lymphknotenmetastasen	Nein	24	48
	Ja	26	52
Differenzierungsgrad	Geringe Differenzierung	9	18
	Mittlere bis hohe Differenzierung	41	82
Alter	≥60 Jahre	36	72
	<60 Jahre	14	28
Geschlecht	Männlich	32	64
	Weiblich	18	36
Rauchgeschichte	Ja	25	50
	Nein	25	50

Tabelle 4: Klinische und pathologische Merkmale von NSCLC-Patienten. Die Daten werden als Anzahlen (n) und Prozentanteile (%) basierend auf der gesamten Studienpopulation (n = 50) angegeben.

Klinisch-pathologisches Merkmal	Gruppe	n	YTHDC2-Expression (Mittelwert ± SD)	p-Wert
Gewebetyp	Tumor	30	3.24 ± 2.34	0.537
	Angrenzendes normales Gewebe	19	3.60 ± 1.70
Pathologischer Typ	Adenokarzinom	26	4.13 ± 1.29	0.022*
	Plattenepithelkarzinom	4	7.50 ± 3.41
CSCO-Stadieneinteilung	I–II	22	4.29 ± 1.94	0.08
	III–IV	8	5.05 ± 1.51
Lymphknotenmetastasierung	Nein	19	3.83 ± 0.91	0.027*
	Ja	11	5.70 ± 2.53
Histologische Differenzierung	Mäßig bis gut differenziert	25	4.33 ± 1.90	0.181
	Schlecht differenziert	5	5.18 ± 1.60
Alter	≥60 Jahre	20	4.62 ± 2.10	0.835
	<60 Jahre	10	4.16 ± 1.12
Rauchgeschichte	Ja	12	4.62 ± 2.40	0.845
	Nein	18	4.38 ± 1.40

Tabelle 5: Assoziation zwischen der Expression von YTHDC2 und klinisch-pathologischen Merkmalen bei NSCLC-Patienten. Die YTHDC2-Expression wurde mittels qRT-PCR gemessen und mit der 2^–ΔCt-Methode berechnet, normiert auf GAPDH. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die Gruppengrößen (n) repräsentieren die Anzahl der analysierten gültigen Proben. Statistische Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit dem Wilcoxon-Rangsummentest durchgeführt. *p < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.

Variable	β	Wald	p-Wert	OR	95% KI
Alter (≥60 vs <60)	0,07	0,01	0,93	1,08	0,20–5,68
Geschlecht (weiblich vs männlich)	0,53	0,4	0,525	1,7	0,33–8,67
Rauchgeschichte (ja vs nein)	0,54	0,46	0,496	1,71	0,36–8,09
Tumorstadium (III–IV vs I–II)	3,3	7,38	0,007*	27	2,50–291,18
Differenzierung (schlecht vs mäßig–gut)	–1,29	1,62	0,204	0,28	0,04–2,02
YTHDC2-Expression	0,83	4,91	0,027*	2,29	1,10–4,75

Tabelle 6: Multivariate logistische Regressionsanalyse von Faktoren, die mit Lymphknotenmetastasen bei NSCLC-Patienten assoziiert sind. Es wurde eine binäre logistische Regression mit Lymphknotenmetastasen als abhängige Variable durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Odds Ratios (ORs) mit 95 % Konfidenzintervallen (KI) angegeben. Referenzkategorien: Alter (<60 Jahre), Geschlecht (männlich), Rauchgeschichte (nein), Tumorstadium (I–II) und Differenzierung (mäßig–gut). *p < 0,05 weist auf statistische Signifikanz hin.

Diskussion

YTHDC2, das größte N6-Methyladenosin (m6A)-bindende Protein der YTH-Familie, zeichnet sich durch seine ATP-abhängige RNA-Helikase-Aktivität aus und stellt damit einen Schlüsselregulator des RNA-Stoffwechsels dar¹³. Im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der YTH-Familie kommt YTHDC2 sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma vor, wo es die mRNA-Translation und die RNA-Stabilität reguliert¹⁴. Frühere experimentelle Studien haben gezeigt, dass YTHDC2 das Fortschreiten des Lungenadenokarzinoms (LUAD) unterdrückt, indem es die Expression der mRNAs von ADIRF und MRPL12 hemmt, die Apoptose verstärkt und die Zellproliferation sowie Metastasierung verringert^15,16. Weitere experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass YTHDC2 lncRNAs wie ZNRD1-AS1 stabilisiert, um die Proliferation von LUAD zu hemmen, und m6A-modifizierte mRNAs wie CYLD und SLC7A11 moduliert, wodurch der NF-κB-Signalweg, die Cystein-Aufnahme und antioxidative Prozesse gehemmt sowie Ferroptose und antikanzeröse Aktivität gefördert werden^17,18.

In dieser Studie wurde die Expression und klinische Bedeutung des m6A-Leseproteins YTHDC2 beim NSCLC mittels eines integrativen Ansatzes untersucht, der bioinformatische Analysen mit experimenteller Validierung kombiniert. Die bioinformatische Analyse der Datenbanken TCGA und GEPIA zeigte eine signifikante Downregulation von YTHDC2 in NSCLC-Tumorgeweben im Vergleich zu normalem Lungen­gewebe, und ein höherer YTHDC2-Expressionsgrad war mit einer verbesserten Gesamtüberlebenszeit und Überlebenszeit nach Progression assoziiert, was auf eine mögliche prognostische Rolle hindeutet. Interessanterweise konnten unsere qRT-PCR-Experimente unter Verwendung der 19 verfügbaren gepaarten Tumor- und angrenzenden Normalgewebeproben der vorliegenden Kohorte keinen statistisch signifikanten Unterschied in der YTHDC2-Expression zwischen Tumor- und angrenzendem Normalgewebe nachweisen. Diese Diskrepanz verdeutlicht die Herausforderungen bei der Übertragung von Ergebnissen aus umfangreichen öffentlichen Datensätzen auf unabhängige klinische Kohorten und unterstreicht die Notwendigkeit einer vorsichtigen Interpretation von In-silico-Analysen. Das Verständnis der Gründe für diese Unterschiede ist entscheidend, um die Eignung von YTHDC2 als Biomarker und therapeutisches Ziel beim NSCLC korrekt bewerten zu können. Der Fokus der vorliegenden Studie auf YTHDC2 entspricht dessen einzigartiger Helikaseaktivität unter den YTH-Leseproteinen¹⁹, doch jüngste Pan-Krebs-Analysen zeigen kontextabhängige Funktionen anderer Familienmitglieder. So zeigten Li et al., dass YTHDF1/2 in den meisten Krebserkrankungen (z. B. LIHC, LUAD) hochreguliert sind und mit einer ungünstigen Prognose korrelieren, während YTHDC1/2 tumorunterdrückende Effekte in KIRC und BRCA aufweisen²⁰. Bemerkenswert ist, dass die onkogene Rolle von YTHDF1 über die Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Wegs im Gegensatz zur antimetastatischen Funktion von YTHDC2 beim NSCLC steht, was die Notwendigkeit subtypspezifischer Biomarkerstrategien verdeutlicht. Im Vergleich zu etablierten prognostischen Markern (z. B. PD-L1 für die Immuntherapieantwort) könnte die Vorhersagekraft von YTHDC2 durch Kombination mit anderen m6A-Regulatoren (z. B. METTL3, YTHDF1) oder Genen der Immuncheckpoint-Regulation verbessert werden, wie pan-kameröse Analysen zur Immuninfiltration nahelegen. Obwohl frühere Studien darauf hindeuten, dass YTHDC2 den NF-κB/CYLD-Weg reguliert¹², war die vorliegende Studie durch den Mangel an Validierung auf Proteinebene mittels Immunhistochemie oder Western Blot sowie durch fehlende funktionelle Validierung limitiert. Zukünftige Arbeiten sollten Knockdown-Assays mit m6A-Sequenzierung kombinieren, um direkte Zielstrukturen zu kartieren.

Frühere Analysen zeigten, dass die Expression von YTHDC2 in NSCLC-Geweben herunterreguliert ist und mit einer ungünstigen Prognose korreliert²¹. Die Kaplan-Meier-Analyse deutete auf ein längeres Überleben bei Patienten mit höherer YTHDC2-Expression hin, doch die ROC-Kurvenanalyse legte eine begrenzte Vorhersagekraft für das Überleben nahe²⁰. Die Überlebens-ROC-Analyse in der vorliegenden Studie wurde mithilfe von TCGA-RNA-seq-Expressions- und Überlebensdaten durchgeführt, da Langzeit-Follow-up-Informationen für unsere lokale klinische Kohorte nicht verfügbar waren. Wichtig ist, dass die in dieser Studie beobachteten niedrigen AUC-Werte (~0,5) darauf hindeuten, dass die YTHDC2-Expression an Sensitivität und Spezifität für den klinischen Einsatz als alleiniger Biomarker mangelt²². Diese Einschränkung steht im Einklang mit neu aufkommenden Erkenntnissen, dass Einzelgen-Biomarker bei komplexen Erkrankungen wie NSCLC häufig unzureichend sind, wobei zunehmend multi-omische Ansätze und integrierte Biomarker-Panels erforderlich sind, um klinisch relevante Vorhersageleistung zu erreichen. Eine höhere YTHDC2-Expression wurde in NSCLC-Geweben mit Lymphknotenmetastasen beobachtet, was auf einen möglichen Zusammenhang zwischen der YTHDC2-Expression und dem metastatischen Status der Lymphknoten in der vorliegenden Kohorte hindeutet. Obwohl Unterschiede in der YTHDC2-Expression auch zwischen Adenokarzinom und Plattenepithelkarzinom festgestellt wurden, sollte dieser Vergleich mit Vorsicht interpretiert werden, da lediglich 4 Proben von Plattenepithelkarzinomen zur Analyse verfügbar waren, was die statistische Aussagekraft dieses Subgruppenvergleichs erheblich einschränkt. Keine signifikanten Unterschiede zeigten sich hinsichtlich klinischem Stadium, Differenzierung, Alter oder Rauchgeschichte, was wahrscheinlich auf Studieneinschränkungen zurückzuführen ist, darunter die Stichprobengröße und das Ein-Zentrum-Design. Obwohl die beobachtete Assoziation zwischen reduzierter YTHDC2-Expression und Lymphknotenmetastasierung auf eine mögliche biologische Rolle bei NSCLC hindeutet, schließen die geringe Diskriminationsleistung (AUC ~0,5) und die inkonsistente Detektion mittels qRT-PCR deren Verwendung als alleinigen klinischen Marker aus. Zukünftige Studien sollten untersuchen, ob die Kombination von YTHDC2 mit anderen m6A-bezogenen Proteinen den Vorhersagewert verbessert.

Die bioinformatischen Analysen legten nahe, dass die Expression von YTHDC2 im NSCLC vermindert ist und mit besseren Patientenergebnissen assoziiert sein könnte. Obwohl eine verminderte Expression ebenfalls bei Patienten mit Lymphknotenmetastasen beobachtet wurde und Unterschiede zwischen den pathologischen Subtypen festgestellt wurden, sollten diese Subgruppenergebnisse aufgrund der begrenzten Stichprobengröße, insbesondere bei Plattenepithelkarzinomen, vorsichtig interpretiert werden. Diese Ergebnisse wurden jedoch durch die qRT-PCR-Analyse in unserer klinischen Kohorte nicht bestätigt, was möglicherweise auf Unterschiede in den Kohortenmerkmalen, der Stichprobengröße, der technischen Variabilität, der posttranskriptionellen Regulation oder dem Fehlen einer Validierung auf Proteinebene zurückzuführen ist. Künftige Forschungsarbeiten sollten die Mechanismen von YTHDC2 in anderen Lungenkrebs-Subtypen mittels In-vitro- und In-vivo-Experimenten untersuchen. Solche Studien könnten die biologische Rolle von YTHDC2 weiter aufklären und klären, ob es im Rahmen eines Multimarker-Ansatzes klinische Relevanz besitzt, anstatt als alleiniger Biomarker zu dienen.

Einschränkungen

Die vorliegende Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Es handelte sich um eine einzentrische retrospektive Studie mit einer relativ geringen Stichprobengröße, was die Übertragbarkeit der Ergebnisse einschränken könnte. Die Verwendung von FFPE-Geweben könnte die RNA-Qualität und die Empfindlichkeit der qRT-PCR beeinträchtigt haben. Zudem wurde ausschließlich die Expression von YTHDC2-mRNA untersucht, während eine Validierung auf Proteinebene mittels Immunhistochemie (IHC) oder Western Blotting nicht durchgeführt wurde. Da die mRNA-Expression aufgrund posttranskriptioneller Regulation nicht notwendigerweise mit der Proteinkonzentration korreliert, könnte dies teilweise die Diskrepanz zwischen unseren klinischen Befunden und den Analysen öffentlicher Datenbanken erklären. Die Studie enthielt außerdem keine Langzeit-Follow-up-Daten, und die Subgruppenanalysen (z. B. Plattenepithelkarzinom) waren statistisch unterdimensioniert.

Zukünftige Richtungen

Zukünftige Forschungsarbeiten sollten die Mechanismen von YTHDC2 beim NSCLC mittels In-vitro- und In-vivo-Experimenten untersuchen, um seine funktionelle Rolle besser zu verstehen. Multizentrische Studien mit größeren Stichprobengrößen sind erforderlich, um die Ergebnisse zu validieren und die Verallgemeinerbarkeit zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Integration von YTHDC2 mit anderen m6A-bezogenen Regulatoren und klinisch-pathologischen Variablen seine prädiktive und prognostische Aussagekraft erhöhen. Weitere Studien, die multi-omische Ansätze wie Transkriptomik, Proteomik und Epigenomik einbeziehen, sind notwendig, um die biologischen Mechanismen hinter der Dysregulation von YTHDC2 aufzuklären. Eine Validierung auf Proteinebene mittels Immunhistochemie (IHC) oder Western Blot sollte ebenfalls durchgeführt werden, um die Übereinstimmung zwischen mRNA- und Proteinausdruck zu bewerten. Die Standardisierung von Probenvorbereitung und Validierungstechniken wird ebenfalls entscheidend sein, um Reproduzierbarkeit und klinische Anwendbarkeit sicherzustellen.

Schlussfolgerung

Diese Studie bietet eine explorative Bewertung der YTHDC2-Expression im NSCLC durch die Integration bioinformatischer Analysen mit klinischer qRT-PCR-Validierung. Aufgrund der inkonsistenten Detektion über verschiedene analytische Plattformen hinweg und der begrenzten diagnostischen Genauigkeit (AUC ≈0,5) ist eine Verwendung als alleiniger klinischer Biomarker derzeit jedoch nicht möglich. Obwohl bioinformatische Analysen auf eine mögliche prognostische Bedeutung hindeuten, unterstützt eine unabhängige klinische Validierung deren Zuverlässigkeit für diagnostische oder prognostische Anwendungen nicht. Diese Ergebnisse sollten vorsichtig interpretiert werden und erfordern eine Validierung in größeren, multizentrischen Kohorten sowie Untersuchungen auf Proteinebene und funktionelle Studien, bevor eine klinische Anwendung in Betracht gezogen werden kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Individuelle Primer und Sonden	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	Individuelle Synthese	Primer- und Sonden-Sequenzen siehe Tabelle 6
DNase I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	DNase I (HiPure FFPE RNA Kit)	Entfernung von genomischer DNA-Kontamination
ESTIMATE-Algorithmus	Yoshihara et al.	R-Paket (Version 1.0.13)	Schätzung der Tumorreinheit
FFPE RNA-Extraktionskit	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	RNA-Extraktion aus FFPE-Gewebe
GDC-Datenportal	National Cancer Institute (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	Herunterladen von TCGA-Datensätzen
GEPIA-Webserver	Peking University, China	http://gepia.cancer-pku.cn	Genexpressionsanalyse
Kaplan–Meier-Plotter	Semmelweis-Universität, Ungarn	https://kmplot.com	Überlebensanalyse
Mikrozentrifuge	Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland	5424 R	RNA-Reinigungsverfahren
NanoDrop-Spektrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	NanoDrop 2000/2000c	RNA-Quantifizierung
Probenbasiertes qPCR-Master-Mix	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Quantitative PCR-Amplifikation
R-Statistiksoftware	R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich	Version 4.4.1	Statistische Analysen und ROC-Analyse
Echtzeit-PCR-System	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA	CFX Opus 96	Quantitative Echtzeit-PCR
Reverse Transkriptionskit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	cDNA-Synthese
RNA-Reinigungssäule	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure Mini Column I	Silica-Membran-RNA-Reinigungssäule
RNAse-freies Wasser	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	RNAse-freies Wasser	RNA-Elution
SPSS Statistics	IBM Corp., Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics Version 27.0	Statistische Analysen
survivalROC-Paket	CRAN (R Foundation for Statistical Computing)	Version 1.0.3.1	Zeitabhängige ROC-Analyse
TCGA-Datenbank	National Cancer Institute (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	Öffentliche Krebsgenomik-Datenbank
Waschpuffer RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Puffer RW1	Waschpuffer für die RNA-Reinigung
Waschpuffer RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Puffer RW2	Waschpuffer für die RNA-Reinigung