Protokolle für effiziente Aufzucht und funktionelle Analyse der endoparasitoiden Wespe Asobara japonica und ihres Wirts Drosophila melanogaster

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, die funktionelle Analyse der Parasitoid-Wirt-Interaktionen bei Asobara japonica und Drosophila melanogaster zu erleichtern. Durch optimierte Aufzuchtmethoden, einen Infektionstest mit einer einzelnen Eiablage und RNAi-vermittelte Gen-Knockdown.

Zusammenfassung

Parasitismus ist eine biologische Interaktion, bei der ein Organismus den Körper oder die Ressourcen eines anderen (des Wirts) ausbeutet, was erheblichen Schaden oder Tod des Wirts verursacht. Unter den parasitären Tieren gehören Parasitoidwespen zu den artenreichsten Linien und machen fast 20 % aller Insektenarten aus. Insbesondere legen endoparasitoide Wespen direkt in den Wirtskörper ein und setzen eine Vielzahl von Giftfaktoren ein, um die Wirtsentwicklung, Immunität und Physiologie zu beeinflussen. Als Reaktion auf den Wespenangriff versuchen die Wirte, parasitäre Eier durch angeborene Immunmechanismen zu eliminieren. Die molekularen und zellulären Mechanismen, durch die einzelne Giftkomponenten die Wirtsbiologie modulieren und erfolgreichen Parasitismus fördern, sind jedoch weiterhin wenig verstanden. Hier beschreiben wir ein standardisiertes Laborprotokoll zur Aufzucht der endoparasitoiden Wespe Asobara japonica und ihrem Wirt Drosophila melanogaster. Sowohl parthenogenetische als auch sexuelle Stämme von A. japonica sind verfügbar, und der parthenogenetische Stamm weist eine hohe Erfolgsrate beim Parasitismus auf, was eine stabile Erhaltung der Laborbestände für Genomanalysen und Parasitismustests ermöglicht. Ein Infektionstest mit einer einzelnen Eiablage und eine doppelsträngige, RNA-basierte Gen-Knockdown-Methode wurden für die funktionelle Analyse von Giftgenen optimiert. Zusammen bieten diese Protokolle einen praktischen experimentellen Rahmen zur Analyse der molekularen Mechanismen, die den Interaktionen zwischen Parasitoiden und Wirten zugrunde liegen, und werden zukünftige Forschungen in Entwicklungsbiologie, Immunologie und Physiologie erleichtern.

Einleitung

Parasitismus ist ein Lebensstil, bei dem ein Organismus die Nährstoffressourcen eines anderen nutzt und in allen Taxa weit verbreitet ist. Es wird geschätzt, dass bis zur Hälfte aller bekannten Organismen im Lebenszyklus¹ Parasitismus zeigt. Unter den Parasiten sind parasitoide Wespen eine besonders vielfältige Gruppe und machen etwa 20 % aller Insekten^aus. Sie nutzen eine große Bandbreite an Gliederfüttern-Wirten wie Insekten, Spinnen und Milben und zeigen eine bemerkenswerte Vielfalt in ihren Lebensgeschichten und parasitären Strategien³. Diese Eigenschaften machen parasitäre Wespen zu einer der evolutionär und ökologisch erfolgreichsten Insektengruppen.

Interaktionen zwischen Parasitoiden und ihren Wirten wurden umfassend als Modellsysteme evolutionärer "Wettrüstungen" untersucht. Insbesondere nutzen endoparasitoide Wespen eine Vielzahl von Faktoren, darunter Gifte, symbiotische Viren und Teratozyten ^4,5. Diese Faktoren beeinflussen die Physiologie und Entwicklung des Wirts und stellen so eine erfolgreiche Entwicklung im Wirt sicher. Trotz dieser Fortschritte sind die molekularen Mechanismen, die dem Parasitismus zugrunde liegen, bei den meisten parasitoiden Arten weiterhin schlecht verstanden. Eine große Einschränkung ist ihre geringe Körpergröße, die die biochemische Identifizierung von Giftbestandteilen erschwert hat. Außerdem ist es technisch herausfordernd, Parasitoide und ihre Wirte mit synchronisierten Entwicklungsstadien unter Laborbedingungen zu erhalten.

Jüngste Fortschritte in der Next-Generation-Sequenzierung und anderen Omics-Technologien ermöglichen nun genomweite Analysen selbst bei sehr kleinen parasitären Arten. Diese Ansätze haben neue Wege eröffnet, um zuvor unzugängliche molekulare Mechanismen zu erforschen, wodurch Interaktionen zwischen Parasitoiden und Wirten mit beispielloser Auflösung untersucht werden können. In diesem Zusammenhang konzentriert sich unser Labor auf Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae), eine Art, die ursprünglich in Japan ^6,7,8 identifiziert wurde. A. japonica enthält einen thelytokösen parthenogenetischen Stamm, bei dem Weibchen ohne Paarung Nachkommen zeugen. Diese Funktion ermöglicht es uns, erhebliche Mengen genetisch einheitlicher genomischer DNA für die Ganzgenomsequenzierung⁹ zu sammeln. Darüber hinaus parasitiert diese Art eine breite Palette von Drosophila-Arten, darunter den Modellorganismus D. melanogaster, der aufgrund seiner gut etablierten Aufzuchtbedingungen und präzise definierten Entwicklungsstadien große experimentelle Vorteile bietet,  was reproduzierbare Infektionstests und eine genaue Kontrolle der Parasitoidentwicklung^ermöglicht.

Während des Parasitismus von A. japonica injiziert eine weibliche Wespe zusammen mit einem einzelnen Ei Gift in eine Fliegenlarve, in der eine Wespenlarve neben ihrem Wirt wächst. Bemerkenswert ist, dass A. japonica eine hohe Parasitismus-Erfolgsrate beim Wirt D. melanogaster aufweist, was dieses Parasitoid-Wirt-Paar zu einem leistungsstarken experimentellen Modell macht. Hier beschreiben wir Protokolle für stabile Aufzucht, einen Infektionstest mit einer Eiablage und eine doppelsträngige RNA (dsRNA)-basierte Gen-Knockdown-Methode bei A. japonica. Diese Protokolle bieten einen zuverlässigen Rahmen zur Analyse molekularer Mechanismen, die den Interaktionen zwischen Parasitoiden und Wirt zugrunde liegen.

Protokoll

Eine schematische Übersicht der synchronisierten Aufzuchtmethode für D. melanogaster und A. japonica ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Aufzucht der Wirtsfruchtfliege Drosophila melanogaster im Labor

1. Halten Sie alle Versuchstiere bei 25 °C und 50-60 % relativer Luftfeuchtigkeit unter einem 12:12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus. Verwenden Sie den Wildtyp-Stamm Oregon-R (OR) als Wirt für A. japonica (Abbildung 2A).
2. Übertragen Sie erwachsene Fliegen in ein neues Fläschchen, das Standard-Maismehl-Hefe-Agar-Medium (0,55 % Agar, Tabelle 1) enthält. Beschriften Sie das Fläschchen mit dem Transferdatum und dem Namen des Stamms mit "OR".
3. Entfernen Sie diese erwachsenen Fliegen einen Tag nach dem Transfer, um eine übermäßige Anzahl von Eiern im Futter zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass die Larven auf der Nahrungsoberfläche fressen.
   HINWEIS: Als Richtlinie sollten Sie etwa 200–250 Eier pro Fläschchen (φ30×100 mm) aufbewahren. Höhere Eidichten können den Erfolg des Parasitismus verringern und die Variation in der Entwicklung von Wirt und Wespen erhöhen.
4. Vier Tage nach Schritt 1.2 einen Löffel Fliegenlarven (4 Tage nach der Eiablage, dAEL) in ein neues Fläschchen. Halten Sie diese Larven für die nächste Generation unberührt von Parasitoiden. Dieses Verfahren hilft auch, die Larvendichte des Wirts in einem Fläschchen zu kontrollieren.

2. Aufzucht der endoparasitoiden Wespe Asobara japonica im Labor

1. Verwenden Sie einen parthenogenetischen Stamm Tokyo (TK) und einen sexuellen Stamm Iriomote-jima (IR) (Abbildung 2B). Erstere bestehen aus Weibchen, letztere aus Weibchen und Männchen. Männchen schließen zwei bis vier Tage früher als Weibchen. Daher sollten die Weibchen vor dem Transfer anhand ihrer Eilegestellen bestätigt werden.
2. Übertragen 10–20 erwachsene Wespen direkt aus dem Lagerfläschchen in das Fläschchen mit Fliegenlarven bei 4 dAEL. Beschriften Sie das Fläschchen mit dem Übertragungsdatum und dem Stammnamen "TK" oder "IR". Halten Sie die Wespen unter denselben Bedingungen wie bei Step 1.1.
3. Erlauben Sie erwachsenen Wespen, in Fliegenlarven Eier zu legen. Beseitigen Sie diese Wespen ein bis zwei Tage später, um Superparasitismus zu verhindern, was zum Tod des Wirts führen kann. Entfernen Sie geschlossene erwachsene Fliegen, die 10 oder mehr Tage nach Schritt 2.2 aus dem Parasitismus entkommen sind.
4. Zwei Wochen nach Schritt 2.2 beginnen erwachsene Wespen aus dem Wirtsfliegenpuppengehäuse zu wachsen. Übertragen Sie diese frisch gezüchteten erwachsenen Wespen in ein neues Lebensmittelfläschchen mit Filterpapier, das 25 % Glukose und 50 mM Vitamin-C-Lösung enthält. Die Filterpapierstücke sollten bei 130 °C für 2 Stunden sterilisiert werden. Die Bereitstellung der Lösung auf Filterpapier fördert das Legablageverhalten und verlängert die Lebensdauer erwachsener Wespen. Unser Ansatz zur Nutzung von Vitamin C zur Verbesserung der Eizellenablage wurde durch Beobachtungen in Drosophila-Studien ¹¹ inspiriert.

3. Infektionstest mit einer Eiablage

1. Synchronisieren Sie das Entwicklungsstadium der für das Infektionsexperiment verwendeten Fliegenlarven.
   1. Setzen Sie die ausgewachsenen Fliegen in ein 50-ml-Rohr mit einer Traubensaft-Agarplatte (3 % Agar), bestrichen mit frischer Hefepaste, und lassen Sie sie 24 Stunden lang Eier legen.
   2. Sammeln Sie frisch geschlüpfte Larven des ersten Stadiums auf der Agarplatte des Traubensafts und geben Sie sie in ein kleines Fläschchen (12 ml) mit 2–3 g Fliegenfutterpaste (Fliegenfutter mit einer angemessenen Menge Wasser gemischt). 20–30 Larven werden in das Fläschchen gelegt. Die Fliegenlarven dürfen bei 25 °C wachsen.
2. Zum richtigen Zeitpunkt bereiten Sie eine 4 cm große Petrischale vor, die eine dünne, gleichmäßig verteilte Schicht Fliegenfutterpaste enthält, die eine Fläche von etwa 1,5–2,0 cm Durchmesser bedeckt (im Folgenden als Infektionstestarena bezeichnet). Zusätzlich zum Infektionstest bereiten Sie ein neues kleines Fläschchen (12 ml) vor, das eine passende Menge Fliegenfutterpaste enthält. Dieses Fläschchen wird zur Aufzucht der Wirtslarven nach dem Infektionstest verwendet.
3. Sammeln Sie gestaffelte Larven und geben Sie sie in eine Schale mit deionisiertem Wasser (Widerstand = 15 MΩ·cm, 25 °C). Spülen Sie die Larven im Napf mit sanftem Rühren ab, um die Restnahrung aus ihrem Körper zu entfernen.
4. Nach dem Abspülen werden überschüssige Feuchtigkeiten vorsichtig mit fusselfreien Papiertüchern entfernt, da überschüssiges Wasser das Verhalten der Wespenablagerung im Infektionsassay-Arenen beeinträchtigt. Dann bringen Sie die Larven in die Arena. Dieser Schritt erhöht die Larvenaktivität während des Infektionsexperiments.
5. Betäuben erwachsene Wespen mit CO2-Gas_bei einer Durchflussrate von 5 L·^min-1 und einem Druck von 0,2 MPa. Dann werden etwa drei weibliche Wespen vorsichtig in die Infektionstestarena gelegt. Schließen Sie den Deckel der Schüssel und lassen Sie sie sich von Fliegenfutterpaste erholen.
6. Beobachten Sie das Ovpositionsverhalten dieser Wespen unter einem Stereomikroskop (Zoomeinstellung: 10× bis 15×).
   HINWEIS: Wenn eine Wespe einen sich bewegenden Fliegenlarvenkörper berührt, setzt sie schnell ihren Eilegespender in den Fliegenkörper ein und injiziert Giftbestandteile. Obwohl die Fliegenlarve sich windet und ihren Körper windet, wird sie sofort gelähmt. Anschließend vibriert die Wespe mit ihrem Abdomen und legt ein Ei in den Wirtslarvenkörper, woraufhin der Eigelege herausgezogen wird. Dieses Eierablagerungsverhalten wird als Infektion bezeichnet.
7. Nach der Infektion öffnen Sie den Deckel und übertragen Sie die infizierte Fliegenlarve in das neue kleine Fläschchen mit der in Schritt 3.2 vorbereiteten Fliegenfutterpaste. Um den Zeitpunkt der Infektion zu standardisieren, führen Sie das Infektionsexperiment innerhalb von 15 Minuten durch.
8. Beschriften Sie das kleine Fläschchen mit experimentellen Informationen wie Datum, Probenname, Infektionszeit und Anzahl der Personen. Diese Fläschchen werden verstopft, dann in einen feuchten Behälter gestellt und bei 25 °C aufbewahrt.

4. Entstehung von RNA-Interferenzwespen (RNAi) durch dsRNA-Injektion

1. Synthese von dsRNAs von 400 bp oder mehr für dsRNA-vermittelte Gen-Knockdown (RNA-Interferenz, RNAi) mit einem in vitro transkriptionsbasierten dsRNA-Synthesesystem. Die dsRNA-Proben sollten bis zur Nutzung bei -20 bis -80 °C aufbewahrt werden. Detaillierte Protokolle sind wie zuvor beschrieben⁹.
2. Bereiten Sie eine 5,5 cm große Petrischale mit 2 % Agar zur Platzierung von Wespenkörpern vor. Füllen Sie zwei Drittel jedes Gerichts mit Agar, um eine dicke Schicht Agarplatte für die Injektion zu erzeugen.
3. Legen Sie ein fusselfreies, mit Wasser befeuchtetes Papiertuch auf den Deckel einer Plastikschale.
4. Sammeln Sie 7 Tage nach der Infektion (DPI) die Wirtsfliegenpuppen aus dem Fläschchen und legen Sie sie auf die in Schritt 4.3 vorbereiteten Papiertücher. Ein Tropfen Wasser an die Fläschchenwand zu geben, hilft, die Puppenhüllen der Wirtsfliegen vom Fläschchen zu lösen.
5. Unter dem Stereomikroskop (Zoomeinstellung: 20× entfernen Sie das Puppengehäuse der Wirtsfliegen und legen Sie einen Wespenkörper mit der Pinzette frei. Bei 7 dpi befinden sich die meisten Wespen im Puppenstadium, in dem Kopf, Thorax und Hinterleib erkennbar sind. Ein Wespenkörper ist unbeweglich.
6. Platzieren Sie die geborgenen Wespenkörper auf die in Schritt 4.2 vorbereitete Agarplatte, wobei ihre Körperachsen in derselben Ausrichtung ausgerichtet werden. Stellen Sie 20-30 Wespenkörper mit der Rückenseite nach oben in ein bis zwei Reihen an. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit auf der Agarplatte mit einem fusselfreien Papiertuch, um das Ausrutschen der Wespen zu verhindern.
7. Richten Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers das Injektionsgerät und das Stereomikroskop auf (Abbildung 3A). Verwenden Sie ein Mikroinjektionssystem, das mit einer Glas-Kapillarnadel ausgestattet ist, die eine präzise Steuerung von Injektionsvolumen und Einspritzgeschwindigkeit ermöglicht. Platzieren Sie die Agarplatte, in der die Wespenköpfe ausgerichtet sind, zur Spitze der Einspritznadel. Das Einspritzvolumen beträgt 50 nL·^wasp-1 und die Einspritzgeschwindigkeit beträgt 50 nL·^sec-1 am Injektor.
8. Bereiten Sie Glas-Kapillarnadeln mit einem Nadelzieher vor. Die Form der Glaskapillare ist mit der Heiztemperatur einstellbar.
9. Setzen Sie die Glas-Kapillarnadel in einem Winkel von 30–35° auf den Nadelschleifer. Schleifen Sie die Nadel, bis die Spitzenlänge 0,04 mm erreicht (vier Teilungen am Okular-Retikel, Abbildung 3B).
10. Kurz vor der Injektion dsRNA auftauen. Die Konzentration von dsRNA beträgt 0,25–1 μg·^μL-1. Zur Visualisierung wird die dsRNA-Lösung mit einem blauen Farbstoff (Erioglaucindinatriumsalz, 2 % Gewicht·^Volumen-1) gefärbt. Mit einer Mikrolader-Pipettespitze füllt man die Glaskapillare mit einer dsRNA-Lösung mit blauem Farbstoff. 4 μL reichen aus, um 30 Wespenkörper zu injizieren. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Lösung vorhanden sind.
    HINWEIS: Nachdem Sie die dsRNA-Lösung geladen haben, tippen Sie vorsichtig mit einem Fingernagel auf die Seite der Nadel, um alle eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen. Restluftblasen können den Fluss der Lösung behindern und die erfolgreiche Injektion behindern.
11. Mit einer 1-ml-Spritze und einer Nadel füllen Sie den freien Teil der Glaskapillare mit Mineralöl, wobei keine Luftblasen in der Kapillare verbleiben.
12. Befestigen Sie die Glas-Kapillarnadel mit dsRNA-Lösung und Mineralöl am Nadelbehälter und montieren Sie sie dann am Einspritzgerät.
13. Stellen Sie die Position der Agarplatte und der Glaskapillarnadel am Injektor so ein, dass die Glasnadel in einem Winkel von 30–45° relativ zu den Wespenkörpern positioniert ist (Abbildung 3A).
14. Führe die Glaskapillarnadel in die dorsale Seite des Wespenkörpers ein, mit der leicht seitlichen Seite zur dorsalen Mittellinie. Mikroinjizieren Sie die dsRNA-Lösung im Körper. Die injizierte dsRNA-Lösung ist mit blauem Farbstoff  sichtbar (Abbildung 3C).
15. Nach der Injektion werden die Agarplatten in einen feuchten Behälter (70–80 % relative Luftfeuchtigkeit) gelegt und eine Woche lang in einem 25 °C-Inkubator gelagert, bis die erwachsenen Wespen eingeschlossen sind. Verletzte Wespenkörper sollten von der Agarplatte entfernt werden, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern.
    PAUSENPUNKT: In Schritt 4.6 dürfen die Wespepuppen mehrere Stunden vor der Injektion auf der Agarplatte gehalten werden. Nadeln können im Voraus vorbereitet werden (Schritt 4.8 und 4.9); allerdings neigen sie mit der Zeit zu Verstopfen. Frisch vorbereitete Nadeln bieten in der Regel eine zuverlässigere Injektionsleistung.

Ergebnisse

Die asexuellen und sexuellen Varianten von Asobara japonica
A. japonica ist in ganz Japan weit verbreitet. Die parthenogenetischen Stämme der Lylytokos sind auf den Hauptinseln vorherrschend, während arrhenotokische sexuelle Stämme auf den subtropischen Inseln, darunter Amami-Oshima und Iriomote-jima ^8,12, vorkommen. Bei sexuellen Stämmen kommen die Männchen einige Tage früher als die Weibch...

Diskussion

In dieser Studie haben wir eine vielseitige experimentelle Plattform zur Untersuchung von Parasitoid-Wirt-Interaktionen auf molekularer Ebene eingerichtet. Durch die Optimierung der Aufzuchtbedingungen, einen Infektionstest mit einer einzelnen Eierablagerung und das RNAi-Protokoll bieten wir ein robustes System für funktionelle Studien parasitoid-abgeleiteter Faktoren. Diese Plattform wird zukünftige Studien erleichtern, die darauf abzielen, die Mechanismen aufzudecken, mit denen parasit...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
50 mL Tube	Greiner Bio-One	210261	Infektionstest
1 mL Spritze	TERUMO	SS-01T	dsRNA-Injektion
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Aufzucht
Asnol Petrischale φ40×13,5mm	As One Corporation	1-8549-01	Infektionstest
Asnol Petrischale φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA-Injektion
Blauer Farbstoff (Erioglaucindinatriumsalz)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA-Injektion
Butyl p-Hydroxybenzoat	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Aufzucht
CO2-Druckregler	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Infektionstest
Konfokales Laserscanningmikroskop	Zeiss	LSM700	Bildanalyse
Maisgrieß	Sunny Maize Co., Ltd.	Nr.4M	Aufzucht
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Kernfärbung, 1:10000
Deionisiertes Wasser	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Infektionstest
Doppelstufen-Glasmikropipettenzieher	Narishige	PC-10	dsRNA-Injektion
Fiji	N.N.	https://fiji.sc	Bildanalyse
Filterpapier	Advantec	ARTIKEL 526	Aufzucht
Fliegenfutterfläschchen	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Aufzucht
Fliegenfutterfläschchenstopfen	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Aufzucht
Pinzette	Dumont Biologie	11252-20	Dissektion
Gefrierschrank, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Probenlagerung
Gefrierschrank, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Probenlagerung
Objektträger	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Infektionstest
Glukose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Nicht verfügbar	Aufzucht
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA-Synthese
Inkubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Aufzucht
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA-Synthese
Mikropipettenschleifer	Narishige	EG-401	dsRNA-Injektion
Mineralöl	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA-Injektion
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA-Injektion
Nanoject-Glaskapillaren	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA-Injektion
pBluescript KS (+) Plasmid	Nicht verfügbar	Nicht verfügbar	dsRNA-Synthese
pBluescript SK (-) Plasmid	Nicht verfügbar	Nicht verfügbar	dsRNA-Synthese
PrimeScript Reverse Transkriptase	Takara	2680A	dsRNA-Synthese
Propionsäure	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Aufzucht
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Infektionstest, dsRNA-Injektion.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix mit gDNA-Entferner	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus-Reagenz	Takara	9108	qRT-PCR
Kleines Fläschchen (Teströhrchen 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Infektionstest
Kleines Fläschchenstopfen	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Infektionstest
Spatel	As One Corporation	6-522-02	Aufzucht
Quadratische Petrischale	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA-Injektion
Stereomikroskop	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Infektionstest
Stereomikroskop	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA-Injektion
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	dsRNA-Synthese
Thermischer Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermischer Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA-Synthese, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Nicht verfügbar	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbinsäure	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Aufzucht
Welch's Traubensaft 100	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Infektionstest
Hefe	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Aufzucht