Forschungsartikel
Diese explorative Rattenmodellstudie präsentiert eine redoxsensitive, oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS)-aktive Mikronadel für gleichzeitige Akupunkturintervention und ratiometrische Verfolgung von SERS-Indizes im Zusammenhang mit der lokalen oxidativen Kapazität und dem Redoxpotenzial bei Ratten mit beeinträchtigter Glukosetoleranz.
Eine beeinträchtigte Glukosetoleranz (IGT) ist mit einer gestörten Redoxhomöostase und erhöhtem oxidativem Stress verbunden, aber die dynamische Verfolgung redoxassoziierter Veränderungen während der Akupunkturintervention in vivo bleibt technisch herausfordernd. Diese Studie entwickelte ein redox-sensitives, oberflächenverstärktes Raman-Streuungssystem (SERS)-aktives Mikronadelsystem für gleichzeitige Akupunkturinterventionen und relative ratiometrische Verfolgung der oxidativen Kapazität (OC)- und Redoxpotenzial-(RP)-bezogenen Sers-Indizes bei Ratten mit IGT. Oxidativ- und Redox-sensitive SERS-Sonden wurden hergestellt, indem Gold-Nanoschalen (GNS) mit p-Phenylendiamin (p-PDA) für die OC-Reaktion bzw. Anthraquinon für RP-Reaktion funktionalisiert wurden. Die Sonden wurden in zwei geätzte Rillen auf Akupunkturnadeln geladen, um SERS-aktive Mikronadeln herzustellen. In dieser explorativen Studie wurden männliche Sprague–Dawley-Ratten ohne spezifische Krankheitserreger verwendet. Drei Ratten dienten als normale Kontrollpersonen, und 20 Ratten erhielten eine fettreiche Diät und erhielten Streptozotocin (STZ), um IGT auszulösen. Nach dem Screening wurden 18 geeignete IGT-Ratten in fettreiche und normale Diätgruppen eingeteilt, jeweils 9 Ratten pro Diätgruppe. Jede Diätgruppe wurde weiter unterteilt in Akupunktpunkt-Twisting-, Nicht-Akupunktur-Set-Twisting und Akupunkturpunkt-Direktinsertions-Subgruppen mit jeweils 3 Ratten pro Untergruppe. Needling wurde zweimal täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage durchgeführt, und es wurden Nüchternblutzucker (FPG), 2-stündige postprandialer Blutzucker (2hPG) sowie OC- und RP-bezogene Sers-Indizes erfasst. Die Ergebnisse zeigten, dass Nadeln an Akupunkturpunkten mit Verdrehung mit niedrigeren FPG- und 2hPG-Werten sowie veränderten OC- und RP-bezogenen SERS-Indizes in diesem IGT-Rattenmodell assoziiert waren. Da externe Kalibrierungskurven, unabhängige biochemische oxidative Stresstests, Probe-Leaching-Tests und Biokompatibilitätstests nicht enthalten waren, sollten die SERS-Verhältnisse als relative, redoxassoziierte optische Indizes und nicht als absolute biochemische Konzentrationen oder absolute Redoxpotentialwerte interpretiert werden. Diese Erkenntnisse unterstützen die Machbarkeit von SERS-aktiven Mikronadeln als explorative präklinische Plattform zur Kombination von Akupunkturintervention mit lokaler ratiometrischer SERS-Verfolgung bei IGT-Ratten.
Eine beeinträchtigte Glukosetoleranz (IGT), eine Abnahme der Glukosetoleranz des Körpers, stellt eine Übergangsstufe zwischen normalem Blutzucker und diabetischem Blutzucker1 dar. IGT ist somit ein wichtiges Frühwarnsignal und ein reversibles Stadium in der Entwicklung von Typ-2-Diabetes2. Klinische Daten zeigen, dass etwa 30 % der Bevölkerung mit IGT innerhalb von 5–10 Jahren zu Typ-2-Diabetes überschreiten3; Mit rechtzeitiger Intervention kann dieser Prozentsatz jedoch auf weniger als 10 % reduziert werden.
IGT ist ein dynamischer und komplexer Prozess, und eine anhaltend hohe Glukoseumgebung ist ein wichtiger Auslöser für oxidative Stoffwechselstörungen5. Wenn der Körper sich in einem langanhaltenden Zustand der Hyperglykämie befindet, funktioniert die mitochondriale Atemkette abnormal, und die Rate der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies steigt um 30–50 %, was die oxidative Kraft im Körper direkt erhöht6; Gleichzeitig hemmen hohe Zuckerwerte die Aktivität wichtiger Enzyme wie Glutathionreduktase, verhindern das Antioxidanssystem, überschüssige reaktive Sauerstoffspezies rechtzeitig zu entfernen, und stören das Oxidations-Reduktions-Gleichgewicht zusätzlich. Darüber hinaus geht IGT mit pathologischen Veränderungen einher, darunter Insulinresistenz und eine leichte Beeinträchtigung der β-Zellfunktion, was zu einer Reihe biologischer und biochemischer Reaktionenführt. Zusammen mit der Entwicklung des Redox-Zustands verschärfen diese Veränderungen die Störung des Glukosestoffwechsels weiter und erhöhen das potenzielle Risiko für Diabeteskomplikationen, darunter Retinopathie, Nephropathie und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 9,10. Daher sollte die Überwachung der oxidativen Kapazität (OC) und des Redoxpotenzials (RP) bei Individuen oder Tiermodellen mit IGT unser Verständnis der Mechanismen der IGT-Entwicklung verbessern und die Entwicklung gezielter therapeutischer Strategien leiten.
Akupunktur hat eine Geschichte von mehr als 3.000 Jahren und hat eine gute klinische Wirksamkeit bei der Behandlung vieler Krankheitengezeigt 11. Darüber hinaus haben zahlreiche experimentelle Studien an Tieren gezeigt, dass Akupunktur positive Effekte bei der Regulierung oxidativer Stresszustände in Tiermodellen hat, indem sie das antioxidative Enzymsystem verbessert und die Lipidperoxidation12 reduziert. Als traditionelle chinesische medizinische Praxis hat Akupunktur auch bedeutende Vorteile bei der Behandlung von Diabetes und IGT gezeigt. Guanyuan (CV4) und Sanyinjiao Akupunkturpunkte (SP6) sollen den SIRT1/PGC-1α-Weg in der Skelettmuskulatur aktivieren und so die Insulinresistenz von fettleibig-diabetischen Mäusen13 lindern. Darüber hinaus modulieren Tianshu-Akupunkturpunkte (ST25) die Aktivität der glukosehemmenden Neuronen im lateralen hypothalamischen Bereich und tragen zur Regulation des Glykolipidstoffwechsels14 bei. Die meisten Studien zu den Mechanismen der intravaskulären Akupunktur konzentrieren sich jedoch hauptsächlich auf das neuromodulatorische, immunmodulatorische und gastrointestinale System, bei denen Akupunktur den Glukosestoffwechsel durch Modulation der autonomen Funktion beeinflussen oder indirekt den Blutzuckerspiegel regulieren kann, indem sie das Gleichgewicht der Darmflora verbessert15,16. Der spezifische Mechanismus der Wirkung der Akupunktur bei der IGT-Behandlung und ihre Auswirkungen auf oxidativen Stress haben keine eingehenden Untersuchungen und experimentelle Daten erhalten.
Oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) bietet eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität, was die Detektion einer Vielzahl von Analyten ermöglicht. SERS-Nanosonden auf Basis von Nanofaseroptik17, Chitosanmembranen18 und früheren Studien haben gezeigt, dass Akupunkturnadeln19 für den Nachweis von Biomarkern, Neurotransmittern und anderen Aspekten der zellulären Biochemie in vivo verwendet werden können. Akupunkturnadeln sind insbesondere vielversprechende Werkzeuge für Tiefengewebstests, die eine minimalinvasive In-situ-Überwachung gefolgt von ex-vivo-Analysen ermöglichen. Akupunktur als gut etablierte therapeutische Methode hat ein äußerst breites klinisches Anwendungsspektrum. Neuere Studien haben gezeigt, dass SERS-fähige optische Fasern, Wundverbände und Mikronadelgeräte eine in situ oder minimal invasive Verfolgung redoxassoziierter Signale in biologisch relevanten Umgebungen unterstützen können20,21. Parallel dazu haben sich SERS-aktive Akupunktur-Nadeln und verwandte Mikronadelsysteme als vielversprechende Träger für die Integration der Sensorfähigkeit mit der Gewebeinterventionetabliert 19, was zu SERS-aktiven Mikronadeln mit in-vivo-Reaktion und in vitro SERS-Nachweismöglichkeiten führt.
Die vorliegende Studie baut auf der zuvor berichteten SERS-aktiven Mikronadelstrategie zur Erkennung von oxidativen Kapazitäts- und Redoxpotenzial-bezogenen Signalen in glukoseinduzierten Stressmodellen auf. Die vorliegende Arbeit unterscheidet sich jedoch sowohl im biologischen Kontext als auch im experimentellen Zweck von der vorherigen Studie. Konkret wendet diese Studie die SERS-aktive Mikronadelplattform auf ein Rattenmodell mit beeinträchtigter Glukosetoleranz an und integriert lokale ratiometrische SERS-Verfolgung mit Akupunkturintervention. Die aktuelle Studie vergleicht außerdem Akupunkturpunkte mit benachbarten Nicht-Akupunkturstellen, bewertet verschiedene Nadelmanipulationen und überwacht Redox-assoziierte SERS-Indizes während einer 7-tägigen Interventionsphase. Im Vergleich zu zuvor berichteten SERS-basierten optischen Fasern, Wundverbänden und SERS-aktiven Mikronadeln, die hauptsächlich für die biochemische Detektion an einer Stelle oder mit einer Funktion entwickelt wurden, bietet die vorliegende Plattform zwei Fortschritte. Zunächst sind OC- und RP-responsive Sonden in zwei unabhängige geätzte Rillen auf einer einzigen Akupunkturnadel integriert, was eine gleichzeitige Überwachung komplementärer Redoxparameter ermöglicht. Zweitens fungiert die Akupunkturnadel nicht nur als Träger der SERS-Sonde, sondern auch als therapeutisches Gerät, das eine Redoxüberwachung während der Akupunkturintervention statt nach der Behandlung ermöglicht. Wie in Abbildung 1 gezeigt, entstehen nach dem Einführen der Mikronadeln in das Gewebe winzige Wunden, und die Sonden in den beiden Rillen reagieren mit dem Gewebe, sodass sie in vivo Spiegel von OC und RP nachweisen können. Ziel der Studie war es, diese SERS-aktiven Mikronadeln zu nutzen, um Veränderungen im OC und RP bei Ratten mit IGT zu untersuchen und die Effekte von Akupunktur im Zusammenhang mit Akupunkturpunkten bei diesen Tieren zu bestimmen, wodurch wertvolle Einblicke in den Wirkmechanismus der Akupunktur bei der Behandlung von IGT sowie die Beziehung zwischen Redox und abnormen hyperglykämischen Zuständen gewonnen wird.
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Tiere und Modelle von IGT
Alle Tierverfahren wurden vom Tierethikkomitee des Southeast University Suzhou Research Institute genehmigt (Genehmigungsnummer SEU-IACUC-20250318007) und wurden gemäß institutionellen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt. Die Ratten wurden entnommen und unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen bei 25 °C mit einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus untergebracht. Bei Verfahren, die eine Anästhesie erfordern, wurden die Ratten mit Isofluran, das durch eine Induktionskammer in Sauerstoff abgegeben, betäubt und mit einem Nasenkegel gehalten. Isofluran wurde mit 3 % für die Induktion und 1 % für die Erhaltung verwendet, wobei die Konzentration entsprechend der Atemfrequenz und der prozeduralen Reaktion angepasst wurde.
Eine ausreichende Anästhesietiefe wurde vor der Nadel oder Injektion durch den Verlust des Aufrichtreflexes und das Ausbleiben einer Reaktion auf Zehenkneifen bestätigt. Während der Anästhesie wurden das Atemmuster, die Körperhaltung und die Erholung überwacht, und die Tiere wurden auf ein Wärmepad gelegt, um die Körpertemperatur zu halten. Die Tiere wurden pro Korb zwei Tiere untergebracht, mit freiem Zugang zu Futter und Wasser, es sei denn, für die Glukosetests war Fasten erforderlich. Nach der Ankunft wurden die Ratten eine Woche lang akklimatisiert, bevor das Modell ingeleitet wurde. Das Tierwohl wurde täglich überwacht, einschließlich allgemeiner Aktivität, Pflege, Nahrungsaufnahme, Körpergewicht, Zustand der Injektionsstelle und der Erholung nach der Anästhesie. Am Ende der Studie wurden die Ratten gemäß dem genehmigten Tierprotokoll eingeschläfert. Die Euthanasie erfolgte durch schrittweise Füllung von CO₂-Inhalation, gefolgt von der Bestätigung des Todes mittels der zervikalen Dislokationsmethode. Tiere, die die humanen Endpunktkriterien erfüllten, darunter starker Gewichtsverlust, anhaltende Beweglichkeit, abnormale Atmung, Unfähigkeit zu essen oder zu trinken oder starke Belastungen, wurden sofort eingeschläfert, anstatt bis zum geplanten Endpunkt gehalten zu werden. Männliche Sprague–Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 200 ± 20 g wurden in dieser Studie verwendet. Nach einer Woche der Akklimatisierung wurden die Ratten zufällig in zwei Gruppen eingeteilt: Die drei Ratten der normalen Gruppe erhielten normales Futter, während die 20 Ratten der Modellgruppe mit fettreichem Chow (50 % Basalfutter + 10 % Schmalz + 25 % Saccharose + 15 % Eigelbpulver) für 3 Wochen gefüttert wurden. Die Tiere der Modellgruppe erhielten eine intraperitoneale Injektion von 20 mg/kg 2%ige STZ-Lösung (gelöst in 0,1 mol/L, pH-Puffer 4,4 Citrat) für 12 Stunden, nach 12 Stunden Fasten ohne Wasserrestriktion. Die Normalgruppen erhielten nach der Verpflegung mit normalem Futter eine intraperitoneale Injektion der entsprechenden Dosis Citratpufferlösung. Eine Woche später wurde ein intraperitonealer Glukosetoleranztest (IPGTT) durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
Der Nüchternblutzucker (FPG) wurde durch Blutentnahme an der Schwanzspitze jeder Rattengruppe nach 12 Stunden Fasten ohne Wasserrestriktion gemessen, und 2 Stunden postprandialer Blutzucker (2hPG) wurde nach einer intraperitonealen Injektion von 20 % Dextrose 2 g/kg gemessen. In der Normalgruppe lag der FPG-Bereich bei 5,1–6,6 mmol/L und der 2hPG-Glukosebereich bei 7,3–9,4 mmol/L, verglichen mit einem FPG von ≤7,0 mmol/L und einem 2hPG-Bereich von 10–16 mmol/L in der Modellgruppe. Von den 20 Ratten, die der Einleitung des IGT-Modells zugewiesen wurden, erfüllten 18 die vordefinierten IGT-Kriterien nach IPGTT und wurden in das anschließende Interventionsexperiment einbezogen. Zwei Ratten wurden ausgeschlossen, da ihre FPG- oder 2hPG-Werte außerhalb des vordefinierten IGT-Bereichs lagen. Die 18 geeigneten Ratten wurden dann zufällig einer fettreichen und einer normalen Diätgruppe zugeteilt, jeweils 9 Ratten pro Gruppe. Jede Diätgruppe wurde weiter in drei Untergruppen unterteilt: Akupunktpunktverdrehung, Nicht-Akupunkturstellenverdrehung und Akupunkturpunkt-direkter Einsatz, mit jeweils drei Ratten pro Untergruppe. Dies war eine explorative Methodenentwicklungsstudie, die darauf abzielte, die Machbarkeit der Kombination von Akupunkturintervention mit SERS-basierter ratiometrischer Verfolgung in einem präklinischen IGT-Rattenmodell zu bewerten. Es wurde keine formale statistische Leistungsberechnung durchgeführt. Die Untergruppengröße von drei Ratten wurde anhand von Machbarkeit, vorläufigen SERS-Mikronadelstudien und dem Prinzip der Tierreduktion ausgewählt. Die Ratten wurden vom Versuchsleiter zufällig zugeteilt; formelle Zuteilung, Tarnung und Blendung wurden nicht durchgeführt.
Die Akupunkturbehandlungsprotokolle wurden unter Berücksichtigung evidenzbasierter klinischer Praxisrichtlinien für die traditionelle chinesische Medizin und der Machbarkeit von Tierversuchengeprüft 22. Die ausgewählten Akupunktpunkte waren Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), bilaterale Tianshu (ST25), bilaterale Shuidao (ST28) und bilaterale Zusanli (ST36). RN12, RN9 und RN7 lagen auf der vorderen Mittellinie und wurden als einzelne Mittellinienpunkte behandelt, während ST25, ST28 und ST36 beidseitig behandelt wurden. Die Akupunkturpunkt-Paarungen basierten auf denen, die für die klinische Behandlung von IGT23 verwendet wurden. Die Anpassung basierte auf der Literatur24,25 unter Verwendung der dichotomen Methode. Bei Ratten wurden Akupunkturpunkte anhand anatomischer Orientierungspunkte und proportionaler Umwandlung von Standardpunkten des Menschen lokalisiert. Die abdominalen RN/CV-Punkte wurden entlang der vorderen Mittellinie anhand des Xiphoideus, des Umbilicus und der Schamsymphyse als anatomische Orientierungspunkte identifiziert. ST25 war beidseitig auf der Nabelschnur markiert, und ST28 beidseitig im unteren Bauchbereich im gleichen lateralen Abstand zur vorderen Mittellinie. ST36 wurde am anterolateralen Hintergliedmaß im vorderen Bereich des Tibialis, lateraal zum Tibia-Tuberkel, identifiziert. Benachbarte Vergleichsstellen ohne Akupunktur wurden 5 mm lateral zu den entsprechenden Akupunktpunkten und außerhalb der anerkannten Meridianlinie markiert, wobei sichtbare Gefäße, Narben und frühere Einstichstellen vermieden wurden. Vor dem Nadeln wurden die Ratten gemäß dem genehmigten Tierprotokoll mit Isofluran betäubt und in Rückenposition auf eine Wärmeplatte gelegt. Die Bauch- und Hintenkörperhaut an jeder Zielstelle wurde rasiert und mit 75 % Ethanol desinfiziert. SERS-aktive Mikronadeln wurden ungefähr senkrecht zur Haut in eine Tiefe von etwa 10 mm eingeführt. Für die Akupunkturpunktverdrehungsgruppen wurden SERS-aktive Mikronadeln in die ausgewählten Akupunktpunkte eingeführt und während der 20-minütigen Retentionszeit sanft bidirektional gedreht. Für die Gruppen ohne Akupunkturstellen wurde dasselbe Verfahren an den 5 mm benachbarten Vergleichsstellen durchgeführt. Für die Direkteinführungsgruppen wurden SERS-aktive Mikronadeln in die Akupunkturen eingeführt und 20 Minuten lang ohne Verdrehung gehalten. Alle Needling-Verfahren wurden vom selben geschulten Bediener durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den Bedienern zu minimieren.
Needling wurde zweimal täglich, um 10:00 und 15:00 Uhr, an 7 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Vor jedem Tagesablauf wurde die FPG nach 8 Stunden Fasten ohne Wassereinschränkung gemessen. Nach dem täglichen Needling-Verfahren wurden OC- und RP-Antworten aufgezeichnet. Am 7. Tag wurde nach der Akupunkturbehandlung eine IPGTT durchgeführt und 2hPG-Werte erfasst.
Warnhinweise
Streptozotocin ist gefährlich und sollte als giftige Chemikalie behandelt werden. Bereiten Sie die Streptozotocin-Lösung in einer chemischen Dampfhaube oder einem zertifizierten Biosicherheitsschrank vor, während Sie einen Laborkittel, Nitrilhandschuhe, Schutzbrillen und eine Maske tragen. Streptozotocin-kontaminierte Spritzen, Nadeln, Feuchttücher, Bettzeug, Käfige und tierbezogene Abfälle sollten gemäß institutionellen Verfahren für gefährliche biologische und chemische Abfälle behandelt werden. Gebrauchte Nadeln und Spritzen sollten sofort in stichresistente Behälter ohne Deckdeckel entsorgt werden.
Herstellung von SERS-aktiven Mikronadeln zur Detektion von OC und RP
Akupunkturnadeln wurden vorbereitet, wie zuvor berichtet26. SERS-aktive Mikronadeln wurden während der gesamten Studie mit demselben Typ kommerzieller Edelstahl-Akupunkturnadeln (0,25 mm × 26 mm) hergestellt. Die Nadeln wurden ungefähr senkrecht zur Haut bis zu einer Tiefe von 10 mm eingeführt. Für Verdrehungsgruppen wurde die manuelle bidirektionale Rotation sanft und gleichmäßig für 20 Minuten während der Retentionszeit vom gleichen geschulten Bediener angewendet. Die Manipulation wurde nicht instrumentell gesteuert; daher wurden die exakte Rotationsfrequenz und -amplitude nicht quantifiziert. Diese Einschränkung wurde in der Diskussion anerkannt.
Anfangs wurden die Nadeln in einer 20%igen (mit /v) PMMA-Lösung in MMA eingeweicht und anschließend einen Tag lang bei Raumtemperatur (25 °C) getrocknet. Anschließend wurden zwei parallele Einkerbungen gleichmäßiger Größe und ähnlicher Form und Tiefe in der PMMA-Schutzschicht (5 mm auseinander) mit einer kleinen Handwerksmesserklinge angefertigt, die mit Ethanol gereinigt worden war; anschließend wurden die Nadeln in 0,5 M Schwefelsäure eingetaucht und diente als Elektrolyt für 10 Sekunden, um eine elektrochemische Gravierung bei einer Spannung von 12 V zu durchlaufen, wodurch an den Scoringstellen zwei nahezu kreisförmige Rillen entstanden. Drittens wurden die Nadeln nach dreimaliger Spülung 24 Stunden bei Raumtemperatur in eine Ethanollösung mit 0,1 mol L−1 MPTES und 0,3 mol L−1 APTES eingetaucht, wodurch die gerillten Oberflächen eine Sulfhydrylfunktion erhielten. Viertens wurde die Beschichtung durch das Eintauchen der Nadel in MMA entfernt. Redox-potentiell-responsive SERS-aktive Mikronadeln wurden auf Basis einer zuvor berichteten Methode27 hergestellt. Das SERS-Substrat wurde auf eine der geätzten Rillen jeder Akupunkturnadel adsorbiert, danach wurden die resultierenden SERS-aktiven Mikronadeln in eine wässrige p-PDA-Lösung mit einer Konzentration von 1 × 10–4 mol/L für 60 Minuten bei 37 °C eingetaucht, was zu oxidationsempfindlichen, SERS-aktiven Mikronadeln führte. SERS-Substrate, die auf Gold-Nanoschalen basieren, wurden wie zuvor beschriebensynthetisiert 28. Bei der vorliegenden Arbeit wurden diese Mikronadeln in die andere Rille jeder Akupunkturnadel getropft und dann natürlich trocknen lassen. Dies führte zu SERS-aktiven Mikronadeln mit OC- und RP-Antwort.
Ex-vivo-Bewertung der OC- und RP-Reaktion auf SERS-aktive Mikronadeln
Die Reaktionen der OC- und RP-Sonden wurden durch das Einführen der SERS-aktiven Mikronadeln in ex vivo Gewebe bewertet. Um die Reaktionsfähigkeit der OC-Sonde auf oxidative Veränderungen zu überprüfen, wurden SERS-Spektren von p-PDA vor und nach der Oxidation aufgezeichnet. Spektren der Redox-SERS-Sonden wurden ebenfalls in einer stark reduzierenden NaBH-4-Lösung und einer stark oxidierenden HAuCl-4-Lösung aufgenommen. Die Selektivität der OC-Sonde wurde mit Reduktionsmitteln bewertet, darunter 1 × 10-4 M FeSO4, 1 × 10-4 M Na2SO4 und 1 × 10-4 M Ascorbinsäure sowie Oxidationsmittel, darunter 1 × 10-4 M CuSO4, 1 × 10-4 M H2O2, 1 × 10-4 M FeCl3, und 1 × 10-4 m HAuCl4. Alle Lösungen wurden in 20 mM PBS (pH 7,4) vorbereitet, und die Sonden wurden mit jeder Lösung 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Robustheit der SERS-aktiven Mikronadeln wurde bewertet, indem OC-Reaktionen vor und nach der Reaktion mit 1 × 10–4 mol/L FeCl3 bei Raumtemperatur erfasst wurden. Diese ex-vivo- und lösungsbasierten Tests wurden verwendet, um die Reaktionsfähigkeit der Sonde unter kontrollierten Bedingungen zu bestätigen. Sie reproduzieren jedoch nicht vollständig die Komplexität der in vivo Gewebe-Mikroumgebung, in der lokale pH-Variationen, Proteinadsorption, extrazelluläre Matrixkomponenten und andere biologische Substanzen die SERS-Signale beeinflussen können. Daher wurden die in vivo OC- und RP-Messungen als relative, redoxassoziierte SERS-Indizes und nicht als matrixunabhängige biochemische Messungen interpretiert.
OC- und RP-Detektion an Akupunktur- und Nicht-Akupunkturstellen
Um die Leistung der OC- und RP-Sonden an Akupunkturpunkten und Nicht-Akupunkturpunkten zu bewerten, wurden die SERS-aktiven Mikronadeln in gesunde Ratten an den ST36- und RN12-Akupunkturpunkten und 5 mm angrenzend an jedem dieser Punkte, in einer Tiefe von etwa 10 mm, für denselben Zeitraum eingeführt.
Auswirkungen des Nadeldrehens auf OC- und RP-Erkennung
Um die Reaktionsfähigkeit der OC- und RP-Sonden unter verschiedenen Nadeltechniken zu beurteilen, wurden SERS-aktive Mikronadeln in die ST36- und RN12-Akupunkturpunkte und 5 mm angrenzend an diesen Punkten bei gesunden Ratten in einer Tiefe von etwa 10 mm eingesetzt. An jedem Akupunkturpunkt wurde eine Nadel verdreht, während die entsprechende Nadel an diesem Punkt nicht verdreht war, und umgekehrt (eine Nadel am Akupunkturpunkt war verdreht, während ihr Gegenstück am Akupunkturpunkt nicht verdreht war). SERS-Signale von den Sonden wurden zur gleichen Einführungszeit für jede Nadel gesammelt.
Veränderungen von OC und RP bei Ratten mit IGT in Bezug auf Akupunkturpunkte, Nadeldrehen und Ernährungsbedingungen
Um die Auswirkungen von Akupunkturpunkten, Nadeldrehen und Ernährungsbedingungen auf OC und RP bei Ratten mit IGT zu bewerten, wurden Ratten der fettreichen Diätgruppe zufällig drei Gruppen zugeteilt (A1, A2 und A3; jeweils drei Ratten), ebenso wie die in der normalen Diätgruppe (Gruppen B1, B2 und B3; drei Ratten in jeder Gruppe). Bei Ratten in den Gruppen A1 und B1 wurden nach der Sedierung SERS-aktive Mikronadeln in Akupunkturpunkte eingeführt und 20 Minuten lang verdreht; dasselbe Verfahren wurde bei Ratten in den Gruppen A2 und B2 durchgeführt, wobei die Mikronadeln 5 mm neben den Akupunkturpunkten eingeführt wurden. Bei Ratten in A3 und B3 wurden die SERS-aktiven Mikronadeln ohne Verdrehung in die Akupunkturpunkte der Ratten eingeführt; Die Nadeln blieben 20 Minuten an Ort und Stelle. Needling wurde zweimal täglich durchgeführt, um 10:00 und 15:00 Uhr, über 7 Tage hinweg. Vor den täglichen Eingriffen wurde ein Blutzuckermessgerät verwendet, um FPG-Werte für jede Gruppe von Ratten zu erfassen (nach dem Fasten, aber ohne Wasserrestriktion für 8 Stunden). Nach jedem Tag des Nadelns wurden OC- und RP-Reaktionen gemessen und aufgezeichnet. Am siebten Tag, nach der Akupunktur, wurde bei jeder Gruppe von Ratten IPGTT durchgeführt und 2hPG-Werte erfasst.
Charakterisierung und Messung
Die Morphologie der SERS-aktiven Mikronadeln wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) untersucht. Die SERS-Spektren wurden bei 25 °C mit einem Raman-Spektrometer aufgenommen, das mit einem 50× langen Arbeitsdistanzobjektiv (NA: 0,5) und einem 785 nm Laser ausgestattet war. Für alle Messungen betrug die Erfassungszeit 10 Sekunden, und das Raman-System wurde mit einer nominalen Laserleistung von 600 μW unter derselben optischen Konfiguration betrieben. Die tatsächliche an der Gewebeoberfläche abgegebene Laserleistung wurde in dieser Studie nicht direkt gemessen. Daher wurden die SERS-Spektren für relative Vergleiche zwischen Gruppen unter identischen Erwerbsbedingungen verwendet, und es wurden keine Schlussfolgerungen hinsichtlich absoluter photothermischer Sicherheit des Gewebes gezogen. Die Intensitätsverhältnisse zweier SERS-Sonden wurden mit folgendem Ansatz berechnet: Das Verhältnis der Intensitätswerte bei 1450 cm−1 zu dem bei 1500 cm−1 wurde als Indikator für OC (I1450 cm−1/I1500 cm−1) bestimmt, nachdem die Intensität bei 1700 cm−1 (als Hintergrund) von jedem der beiden Gipfel abgezogen wurde, jeweils, wie in früheren Berichten 17; und unter Verwendung von I1606 cm−1/I1666 cm−1 als RP-Indikator wurde die Intensität bei 1700 cm−1 (als Hintergrund) jeweils von den beiden Gipfeln subtrahiert. Die berechneten Werte I1450 cm−1/I1500 cm−1 und I1606 cm−1/I1666 cm−1 wurden als relative SERS-abgeleitete Indizes der OC- bzw. RP-assoziierten Antworten analysiert. Diese Verhältnisse wurden verwendet, um Veränderungen zwischen Gruppen und Zeitpunkten unter identischen Erwerbseinstellungen zu vergleichen.
In der vorliegenden Studie wurde keine externe Kalibrierungskurve festgelegt, um diese Verhältnisse in absolute Konzentrationen oxidativer Spezies oder absolute elektrochemische Redoxpotentialwerte umzuwandeln. Jedes Spektrum wurde zweimal an fünf verschiedenen Punkten der SERS-Sonde in drei replizierten Proben aufgezeichnet. Origin wurde verwendet, um Daten zu verarbeiten und Diagramme zu erstellen. Um die akquisitionsbezogene Variabilität zu minimieren, wurden auf alle Gruppen dieselbe Laserwellenlänge, das Objektiv, die Aufnahmezeit, die Laserleistungseinstellung und der Spektralverarbeitungsworkflow angewendet. Potenzielle photothermische oder photochemische Effekte, die durch Laserbestrahlung verursacht werden, wurden nicht unabhängig quantifiziert und gelten als Einschränkung. Statistische Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Stichprobengröße und der statistische Test, der für jedes Experiment oder Figurenpanel verwendet wird, sind in den entsprechenden Figurenlegenden angegeben. Für Ex-vivo-Probe-Validierungsexperimente wurde die SERS-Sonde oder eine unabhängig präparierte Mikronadel als Analyseeinheit verwendet. Für Blutzucker- und SERS-Indexanalysen in vivo wurde die Ratte als biologische Analyseeinheit verwendet. Spektren, die von mehreren Punkten auf derselben Sonde gesammelt wurden, wurden als technische Messungen behandelt und vor der Analyse auf Gruppenebene gemittelt. Statistische Analysen wurden mit SPSS-Software durchgeführt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit den statistischen Tests durchgeführt, die in den entsprechenden Abbildungslegenden angegeben sind. Serielle Nüchternblutzucker- und SERS-Indexmessungen während des 7-tägigen Interventionszeitraums wurden aufgrund der kleinen Untergruppengröße als explorative longitudinale Trends interpretiert, und es wurde kein formales Wiederholungs- oder Mixed-Effects-Modell angewendet. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.
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Herstellung von SERS-aktiven Mikronadeln zur Detektion von OC und RP
Um Veränderungen in OC und RP zu identifizieren, wurden SERS-aktive Mikronadeln mit den entsprechenden Sonden hergestellt. Repräsentative SEM-Bilder bestätigten die Zwei-Rillen-Struktur der SERS-aktiven Mikronadeln. Abbildung 2A zeigt den Akupunkturnadelkörper mit zwei geratzten Rillen, Abbildung 2B eine mit GNS bela...
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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Die Autoren danken dem Personal der Tiereinrichtung und der Bildgebungsplattform für den technischen Support. Diese Arbeit wurde von den wichtigsten Forschungs- und Entwicklungsprojekten der Provinz Jiangsu in der chinesischen Medizin (2020ZX05), den wichtigsten Forschungs- und Entwicklungsprojekten der Provinz Jiangsu (BE2022684), dem Wissenschafts- und Technologieprojekt der Staatsverwaltung für Marktregulierung (2022MK158) sowie der Wissenschafts-Technologie-Stiftung von Suzhou (SYW2024031) unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES, 98%) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | A800524 | |
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan (MPTES, 95%) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | M742544 | |
| Ascorbinsäure | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | CFAD310554 | |
| Blutzuckermessgerät | Cofoe Medical Technology Co., Ltd. | Cofoe A03 | |
| Blutzucker-Teststreifen | Cofoe Medical Technology Co., Ltd. | Cofoe-A03-C | |
| Kupfersulfat (CuSO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | PHR1477 | |
| Ethylalkohol (≥99,7%) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | XW00641752 | |
| Eisen(II)-sulfat (FeSO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | XW01772078701 | |
| Glukose (Glu) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | D9434 | |
| Wasserstoffperoxid (H2O2) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | P-17-0500 | |
| Eisen(III)-chlorid (FeCl3) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | CP81015228 | |
| Methylmethacrylat (MMA) | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. | M109626 | |
| Mikro-Raman-Spektrometer | Renishaw | InVia Raman Mikroskop | |
| p-Phenylendiamin (p-PDA) | Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd. | P128784 | |
| Polymethylmethacrylat (PMMA) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | P742581 | |
| Rasterelektronenmikroskop | Zeiss | ULTRA Plus | |
| Natriumborhydrid (NaBH4) | Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd. | S432207 | |
| Natriumsulfit (Na2SO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | S572396 | |
| Nadeln für die Akupunktur aus rostfreiem Stahl | Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd. | X-20-03 | |
| Statistisches Analysesoftware | International Business Machines Corporation | Version 2021 | |
| Streptozotocin (STZ) | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. | S408311 | |
| Tetrachlorogoldsäure (HAuCl4) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | A124024 | |
| SPSS-Software | International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA | Version 26.0 | |
| Ratten | Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd. | Spezifische-Pathogen-freier männlicher Sprague-Dawley | |
| Basisfutter | Anuokang Biotech. | SY10001 | |
| Schweinefett | MCE | HY-W127601 | |
| Saccharose | MCE | HY-B1779 | |
| Eigelbpulver | MCE | HY-B2235B | |
| Zitronensäuremonohydrat | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Trinatriumcitratdihydrat | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Citrate-Puffer | beyotime | P0086 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | beyotime | ST448-1L | |
| Isofluran | Bioss | D54468 | |
| Isofluran-Anästhesiesystem für Kleintiere | RWD Life Science | R500 | |
| Induktionskammer und Nasenkonus | RWD Life Science | R500kompatible Zubehörteile | |
| Wärmepad | Shanghai Yuyan Life Science | Y69020 | |
| 75% Ethanol | Boyu Bio. | YB60401 | |
| CO2-Euthanasiekammer | Lab Animal Tec. Co. | LAT-10-0090 | |
| WPS | Beijing Kingsoft Office Software | WPS365 |
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