Ein computergestützter Workflow zur Priorisierung von Wirtsgenen, die mit mikrobiellen Metaboliten assoziiert sind, beim obstipationsdominierten Reizdarmsyndrom

Zusammenfassung

Dieses Protokoll kombiniert die Vorhersage mikrobieller Metabolit-Ziele, rektale Mukosa-Transkriptomik, Protein-Protein-Interaktionen und Pfadverdünnung, molekulares Docking, molekulare Dynamiksimulation sowie die Schätzung der bindenden Freien Energie mittels Molekulare Mechanik/Poisson-Boltzmann-Oberflächenbereich (MM-PBSA), um eine Rangliste mit hypothetischen, kuratierten Kandidatenmetabolit-assoziierten Wirtsgenen und strukturell priorisierten Protein-Ligand-Komplexen für experimentelle Nachuntersuchungen zu erstellen.

Zusammenfassung

Es existiert keine standardisierte rechnergestützte Pipeline, um mikrobielle Metabolit-assoziierte Wirtsgene und Protein-Ligand-Komplexe systematisch aus öffentlich verfügbaren chemischen, genomischen und strukturellen Datenbanken zu priorisieren. Dieser Artikel beschreibt einen achtstufigen Arbeitsablauf, der einen benutzerdefinierten Satz von aus dem Darmmikrobiom stammenden Metaboliten entgegennimmt und eine Rangliste von Kandidaten-Metabolit-assoziierten Wirtsgenen, angereicherten biologischen Wegen sowie strukturell priorisierten Protein-Ligand-Komplexen für experimentelle Nachuntersuchungen generiert. Die Pipeline integriert (i) chemoinformatische Metabolit-Profilierung; (ii) Vorhersage von Kandidatenzielen aus mehreren Datenbanken mithilfe von Protein-Chemie-Interaktions- und ligandbasierten Zielvorhersagewerkzeugen sowie einem molekularen Docking-Programm; (iii) differentielle Genexpressionsanalyse öffentlich zugänglicher transkriptomischer Daten; (iv) Überlappung zwischen Zielgenen und differentiell exprimierten Genen; (v) Konstruktion von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken und Pfadangereicherung; (vi) molekulares Docking mit einem molekularen Docking-Programm; (vii) 200 ns lange Molekulardynamik-Simulation unter Verwendung einer Molekulardynamik-Engine mit einem für Molekulardynamik-Simulationen verwendeten Protein-Kraftfeld; und (viii) MM-PBSA-Bindungsenergie-Berechnung. Als durchgerechnetes Beispiel wurden neun vom Darmmikrobiom stammende oder durch dieses modifizierte Metabolite – darunter kurzkettige Fettsäuren, Gallensäuren, Tryptophan-abgeleitete Metabolite und Urolithin A – unter Verwendung des öffentlichen transkriptomischen Datensatzes des rektalen Schleimhautgewebes bei IBS-C, GSE36701, verarbeitet. Der Arbeitsablauf erstellte eine Rangliste mit 17 eindeutigen vorhergesagten, Metaboliten-assoziierten Genen, die in diesem Datensatz differentiell exprimiert waren. Docking-, Molekulardynamik-Simulations- und MM-PBSA-Analysen priorisierten strukturell fünf Metabolit-Protein-Komplexe: Lithocholsäure-VDR, Lithocholsäure-NR1H4/FXR, Ursodeoxycholsäure-NR1H4/FXR, Tryptamin-HTR2A (simuliert in einer expliziten 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) Lipiddoppelschicht) sowie Urolithin A-CASP3. Der Protokollablauf ist so konzipiert, dass er an andere Metabolitsätze, transkriptomische Krankheitsdatensätze und Zielklassen angepasst werden kann; alle Ergebnisse stellen hypothetische, rechnergestützte Vorhersagen dar, die eine unabhängige transkriptomische Reproduktion, Validierung auf Proteinebene und funktionelle Liganden-Antwort-Assays erfordern, bevor kausale oder therapeutische Schlussfolgerungen gezogen werden können.

Einleitung

Das Reizdarmsyndrom mit Verstopfung (IBS-C) ist eine weit verbreitete funktionelle Magen-Darm-Erkrankung, die durch wiederkehrende Bauchschmerzen, veränderte Stuhlgewohnheiten, Blähungen und Verstopfung gekennzeichnet ist und weltweit bei geschätzten 10–15 % der Allgemeinbevölkerung auftritt^1,2. Aktuelle pharmakologische Therapien, darunter Sekretagoge, Prokinetika und Spasmolytika, können bei einer Untergruppe von Patienten einzelne Symptome verbessern; dennoch bleibt die Therapieantwort heterogen, und eine dauerhafte Remission wird selten erreicht, was die komplexe, multifaktorielle Pathobiologie der Erkrankung widerspiegelt^1,3,4. Daher ist ein umfassenderes mechanistisches Verständnis darüber erforderlich, wie mikrobielle Darm Signale auf der Mukosa-Ebene transduziert werden, um überprüfbare Hypothesen für neuartige therapeutische Zielstrukturen zu generieren.

Die Darmmikrobiota trägt durch die Produktion und Biotransformation chemisch vielfältiger Metabolite – darunter kurzkettige Fettsäuren (SCFAs), sekundäre Gallensäuren, Tryptophan-abgeleitete Verbindungen und polyphenolabgeleitete Metabolite wie Urolithine^5,6,7,8 – zur Homöostase des unteren Gastrointestinaltrakts bei. Diese Moleküle kommunizieren mit Wirtszellen über ein breites und noch unvollständig charakterisiertes Repertoire molekularer Zielstrukturen, das weit über die klassischen Metabolit-sensorischen Membranrezeptoren hinausgeht und nukleare Rezeptoren, zytosolische Enzyme, histonmodifizierende Proteine, Vorläufer von Peptidhormonen sowie intrazelluläre Signalproteine umfasst⁹. Bei Patienten mit Reizdarmsyndrom (IBS) wurden Veränderungen in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften sowie in den Metabolitenprofilen nachgewiesen, was eine biologische Grundlage dafür liefert, zu untersuchen, ob Wirtsgene, die mit der Responsivität auf mikrobielle Metabolite assoziiert sind, in der Rektalschleimhaut von IBS-C-Patienten transkriptionell gestört exprimiert werden¹⁰.

Das Neun-Metaboliten-Panel wurde a priori festgelegt, um eine kompakte, chemisch vielfältige und biologisch interpretierbare Gruppe kleiner Moleküle bereitzustellen, die entweder von dem Darmmikrobiom stammen oder durch dieses modifiziert wurden. Die Auswahl basierte auf fünf Kriterien: Repräsentation der wichtigsten mikrobiellen Metabolitenklassen, die an der Wirt-Mikrobiom-Signalübertragung beteiligt sind; nachgewiesene oder plausible Exposition der entfernt liegenden intestinalen Mukosa; Verfügbarkeit eindeutiger PubChem-Identifikatoren und kanonischer Strukturen; molekulare Größe und strukturelle Handhabbarkeit für ligandbasierte Zielvorhersage und Docking; sowie frühere Plausibilität für epitheliale, neuroimmunologische, enteroendokrine, nukleare Rezeptor- oder motilitätsbezogene Signalwege bei IBS-C. Das ausgewählte Panel umfasste Butyrat und Propionat als SCFAs; Chenodesoxycholsäure, Lithocholsäure und Ursodesoxycholsäure als Gallensäuren; Tryptamin, Indol-3-propionsäure und Indol-3-milchsäure als Tryptophan-abgeleitete Metaboliten; sowie Urolithin A als mikrobiomderiviertes Polyphenolmetabolit^5,6,7,8,9,10.

Die meisten früheren computerbasierten und experimentellen Untersuchungen haben einzelne Metabolit–Rezeptor- oder Metabolit–Enzym-Paare isoliert betrachtet, ein Ansatz, der die verteilte, konvergente Natur der mikrobiellen Metabolitsignalübertragung über verschiedene Wirtswege hinweg nicht erfasst^9,11. Die Integration mehrerer analytischer Stufen verleiht eine sich gegenseitig verstärkende Filterwirkung, die keine einzelne Stufe allein bieten kann. Die computergestützte Vorhersage von Zielstrukturen anhand kurationierter Datenbanken liefert einen umfangreichen Satz an potenziellen Wirtsproteinen für jeden Metaboliten. Der Durchschnitt mit krankheitsrelevanten transkriptomischen Daten filtert diesen Satz erheblich, wobei nur Kandidaten beibehalten werden, deren Transkripte im Krankheitskontext verändert sind. Analysen zur Anreicherung biologischer Signalwege und zu Protein–Protein-Interaktionsnetzwerken ordnen anschließend die reduzierte Liste von Kandidaten bekannten biologischen Modulen zu. Molekulares Docking ermöglicht eine erste computergestützte Bewertung der Komplementarität der Bindetaschen für jeden Kandidatenkomplex, und eine zusätzliche 200 ns lange Molekulardynamik-(MD-)Simulation mit MM-PBSA-Bindungsenergie-Dekomposition verleiht der strukturellen Priorisierung eine zeitlich aufgelöste, thermodynamische Dimension, die allein aus Docking-Scores nicht verfügbar ist. Die Durchführung jedes Schritts unabhängig, ohne systematische Integration und schrittweise Filterung, würde zu Kandidatenlisten führen, die zu umfangreich wären, um experimentell handhabbar zu sein, und würde versagen, konvergente Signalwegsarchitekturen zu erkennen.

Im Rahmen dieses gesamten Protokolls verstehen wir unter dem Begriff „metabolitassoziiertes Gen“ (MAG) ein menschliches Gen, dessen Proteinprodukt von mindestens einer curatierten Datenbank für computergestützte Vorhersagen als putativer molekularer Zielort für einen oder mehrere vom Darmmikrobiom stammende Metabolite vorgeschlagen wurde und dessen Transkript im krankheitsrelevanten transkriptomischen Datensatz, der zur Demonstration des Workflows verwendet wurde, differentiell exprimiert ist. Diese operationelle Definition schließt ausdrücklich Membranrezeptoren sowie nukleäre Rezeptoren, zytosolische Enzyme, Signalproteine, Vorläufer von Peptidhormonen und andere intrazelluläre Proteine ein. Die Bezeichnung als MAG stellt jedoch keine experimentelle Evidenz dafür dar, dass ein Metabolit bindet, einen Protein-Ligand-Komplex bildet, einen Rezeptor aktiviert, die Proteinmenge verändert oder eine Erkrankung verursacht, sondern eine rechnergestützt abgeleitete, hypothesengenerierende Nominierung, die einer experimentellen Validierung bedarf.

Dieses Protokoll beschreibt den vollständigen achtstufigen computergestützten Arbeitsablauf (Abbildung 1) mit ausreichend detaillierten Angaben, um eine unabhängige Reproduktion, Anpassung an andere Metabolit-Panels oder Krankheitsdatensätze sowie eine Übertragung auf andere Kontexte der Wirt-Mikrobiota-Interaktion zu ermöglichen. Der Arbeitsablauf ist ausdrücklich als ein Rahmenwerk zur Hypothesengenerierung und strukturellen Priorisierung konzipiert, das ausschließlich auf öffentlich verfügbaren Omics- und Strukturressourcen basiert und aus den rein rechnergestützten Ergebnissen keine Rückschlüsse auf veränderte Metabolitkonzentrationen, Aktivierungszustände von Rezeptoren, Änderungen der Proteinausprägung, nachgeschaltete Signalaktivität oder klinische Relevanz zieht. Hier veranschaulichen wir das Protokoll anhand eines durchgerechneten Beispiels unter Verwendung von neun aus der Darmmikrobiota stammenden oder von dieser modifizierten Metaboliten sowie des öffentlichen transkriptomischen Datensatzes der Rektalschleimhaut bei IBS-C, GSE36701, mit dem Ziel, MAGs zu identifizieren und Metabolit-Protein-Komplexe für nachfolgende experimentelle Untersuchungen zu priorisieren.

Protokoll

Bei der Analyse wurden ausschließlich öffentlich zugängliche, anonymisierte transkriptomische Daten aus GSE36701 sowie öffentlich zugängliche chemische, protein- und strukturbasierte Datenbanken verwendet. Auf die Datenbanken wurde zwischen Januar und Mai 2026 zugegriffen. Spätere Zugriffsdaten wurden in der separaten Materialtabelle dokumentiert.

1. Studiendesign, Hardware- und Softwareanforderungen

1. Definieren Sie den Arbeitsablauf, bevor Sie mit der Analyse beginnen. Verwenden Sie acht Stufen: Metabolitauswahl, Targetvorhersage, Differenzialexpressionsanalyse, Target, Überlappung differenziell exprimierter Gene (DEG), Protein-Protein-Interaktions- (PPI-) / Pfadvernetzungsanalyse, molekulares Docking, MD-Simulation und MM-PBSA-Berechnung.
2. Beachten Sie, dass Docking, MD und MM-PBSA ausschließlich strukturelle Priorisierungswerkzeuge darstellen. Interpretieren Sie diese Ergebnisse nicht als experimentellen Nachweis einer Bindung, Rezeptoraktivierung, Änderung der Proteinmenge, therapeutischen Wirksamkeit oder Krankheitsursächlichkeit.
3. Überprüfen Sie die Rechnerhardware, bevor Sie MD-Simulationen durchführen. Verwenden Sie ein 64-Bit-Linux-Betriebssystem, eine CPU mit mindestens 6 Kernen oder besser, eine GPU-Beschleunigungsplattform mit ≥8 GB VRAM oder eine äquivalente GPU-Beschleunigungsplattform mit mindestens 8 GB VRAM, mindestens 32 GB RAM und mindestens 200 GB freiem Speicherplatz pro MD-System.
4. Dokumentieren Sie die zentralen Softwarekomponenten: eine Molekulardynamik-Engine, ein molekulares Docking von Metabolitliganden an Zielproteine, die Konvertierung chemischer Dateiformate¹², die Generierung dreidimensionaler Liganden, die Ligandenpräparation, ein Toolkit zur Vorbereitung von Docking-Eingabedaten, ein molekulares Docking von Metabolitliganden an Zielproteine, eine allgemeine Programmierumgebung, eine statistische Rechenumgebung mit Bioinformatik-Software-Framework und ein Paket zur Analyse differentieller Genexpression.
5. Dokumentieren Sie die Werkzeuge für die Strukturanalyse: webbasiertes Werkzeug zur Konstruktion von Membransystemen, CHARMM-kompatibler Dienst zur Ligandenparametrisierung, Werkzeug zur Berechnung der Bindungsenergie nach dem Verfahren der Molekularmechanik/Kontinuumslösung, Bibliothek zur Konvertierung molekularer Topologie und Parameter, Programm zur dreidimensionalen Molekülvisualisierung sowie Werkzeug zur Molekülvisualisierung und Erstellung zweidimensionaler Interaktionsdiagramme 2021 (siehe Tabelle der Materialien für Downloadlinks und Versionsinformationen).
6. Notieren Sie die exakten Protein-Kraftfelder, die für die Molekulardynamik-Simulationen verwendet wurden, sowie CGenFF, CHARMM-GUI, R/Bioinformatik-Software-Framework und die Release-Bezeichner des Werkzeugs zur Berechnung der Bindungsenergie nach dem Verfahren der Molekularmechanik/Kontinuumslösung in der Tabelle der Materialien/Umgebungsdatei. Kennzeichnen Sie fehlende Bezeichner als „nicht rekonstruierbar“; leiten Sie sie nicht ab.

2. Auswahl der Metaboliten und chemoinformatische Charakterisierung

1. Definieren Sie das Metabolitenpanel vor der Zielvorhersage. Schließen Sie Butyrat (PubChem CID: 264), Propionat (CID: 1032), Chenodesoxycholsäure (CID: 10133), Lithocholsäure (CID: 9903), Ursodesoxycholsäure (CID: 31401), Tryptamin (CID: 1150), Indol-3-propionsäure (CID: 3744), Indol-3-milchsäure (CID: 92904) und Urolithin A (CID: 5488186) ein.
2. Rufen Sie den kanonischen Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES) und die PubChem CID für jedes Metabolit ab. Überprüfen Sie Synonyme und doppelte Strukturen vor der Zielvorhersage. Speichern Sie die endgültigen Identifikatoren im Metaboliten-Hauptblatt.
3. Übermitteln Sie die kanonischen SMILES-Zeichenketten an das Webtool zur Vorhersage physikochemischer Eigenschaften und ADME-Eigenschaften¹³ (siehe Tabelle der Materialien). Notieren Sie Molekulargewicht, topologische polare Oberfläche (TPSA), konsensuelles logP, Wasserstoffbrücken-Donatoren, Wasserstoffbrücken-Akzeptoren, rotierbare Bindungen, vorhergesagte gastrointestinale Absorption, P-Glykoprotein-Vorhersage sowie Lipinski-, Veber-, Ghose-, Egan-, Muegge- und PAINS-Warnungen.
4. Behalten Sie Metaboliten mit erfolgreicher Strukturerkennung, einem Molekulargewicht ≤500 Da und ohne PAINS-Warnungen bei. Notieren Sie jedes nicht erfüllte Kriterium sowie die Entscheidung, das Metabolit beizubehalten oder auszuschließen.
5. Weisen Sie Ionisierungszustände vor der nachgeschalteten Zielvorhersage und dem Docking zu. Verwenden Sie deprotonierte Carboxylate für Butyrat und Propionat, neutrale Carbonsäureformen für Gallensäuren, protonierte Ammoniumform für Tryptamin und neutrale Formen für die übrigen Metaboliten.

3. Vorhersage von menschlichen Zielstrukturen

1. Öffnen Sie eine Vorhersage für chemisch-proteinartige Wechselwirkungsziele¹⁴ (siehe Tabelle der Materialien). Geben Sie jeweils den Namen des Metaboliten oder die PubChem-CID ein, wählen Sie Homo sapiens (Taxonomie-ID: 9606) aus und legen Sie den minimalen kombinierten Interaktionsscore auf ≥0,700 fest.
2. Bevorzugen Sie experimentelle und aus kuratierten Datenbanken stammende Nachweiskanäle in einer Vorhersage für chemisch-proteinartige Wechselwirkungsziele. Laden Sie die vollständige Tabelle der Proteinassoziationen für jeden Metaboliten herunter.
3. Öffnen Sie ein Molekül-Docking-Programm¹⁵ (siehe Tabelle der Materialien). Reichen Sie jeweils die kanonische SMILES-Zeichenkette mit ausgewähltem Homo sapiens ein und behalten Sie Ziele mit einer Wahrscheinlichkeit von ≥0,70 bei.
4. Vereinen Sie die Ergebnisse der Vorhersage für chemisch-proteinartige Wechselwirkungsziele und des Molekül-Docking-Programms zu einer Vereinigungsmenge für jeden Metaboliten. Behalten Sie alle Ziele bei, die mindestens einen der beiden Datenbankschwellenwerte erfüllen, und entfernen Sie exakte doppelte Einträge mit demselben Gensymbol.
5. Standardisieren Sie die Proteineinträge auf HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC)-genehmigte Gensymbole, indem Sie Proteinidentifikatoren auf standardisierte, von der HGNC genehmigte Gensymbole oder auf die integrierte Datenbank menschlicher Geninformationen abbilden (siehe Tabelle der Materialien). Lösen Sie Aliase, veraltete Symbole und Isoformanmerkungen auf, sodass jeweils ein einziges Gensymbol pro Protein verbleibt.
6. Klassifizieren Sie jedes Ziel als Membranrezeptor, nuklearer Rezeptor, Enzym, intrazelluläres Signalprotein, Peptidhormon, hormonassoziiertes Protein oder anderes intrazelluläres Protein. Tragen Sie die Klasse in die Zielproteintabelle ein.

4. Transkriptomisches Datenset und Analyse differentiell exprimierter Gene

1. Rufen Sie GSE36701 über das webbasierte Analysetool für differentielle Genexpression der NCBI auf^16,17 (siehe Tabelle der Materialien). Notieren Sie, dass der Datensatz Expressionsdaten aus Rektalschleimhautbiopsien von IBS-C-, Durchfall-dominanter Reizdarmsyndrom- (IBS-D-), postinfektiösem Reizdarmsyndrom- und gesunden Kontrollgruppen enthält¹⁸.
2. Durchsuchen Sie GEO und ArrayExpress nach einer unabhängigen Validierungskohorte. Verwenden Sie Kombinationen der Begriffe IBS-C, konstipationsdominantes Reizdarmsyndrom, Rektalschleimhaut, Kolonschleimhaut, Biopsie, Transkriptom, Microarray und RNA-seq. Notieren Sie die Repositorien, Suchbegriffe, Suchdatum und ob ein vergleichbarer Validierungsdatensatz identifiziert wurde.
3. Starten Sie das webbasierte Analysetool für differentielle Genexpression über den GSE36701-Eintrag (siehe Tabelle der Materialien). Weisen Sie die 18 IBS-C-Proben der IBS-C-Gruppe zu, die 40 gesunden Probanden der Kontrollgruppe, und lassen Sie die IBS-D- und postinfektiösen IBS-Proben unzugeordnet.
4. Führen Sie die Analyse der differentiellen Expression mit dem Framework des Pakets für differentielle Genexpressionsanalyse unter Anwendung der Falsch-Entdeckungs-Rate (FDR)-Korrektur nach Benjamini-Hochberg durch¹⁹. Laden Sie die vollständige Ergebnistabelle mit Probe-ID, Gensymbol, Genbezeichnung, logFC, AveExpr, moderiertem t-Wert, rohem P-Wert und adjustiertem P-Wert herunter.
5. Kombinieren Sie die Proben zu genbasierten Einträgen. Entfernen Sie Proben ohne Gensymbole; behalten Sie bei doppelten Symbolen die Probe mit dem niedrigsten FDR-Wert bei; verwenden Sie als Entscheidungskriterium bei Gleichstand den größeren absoluten logFC-Wert.

5. Überlappungsanalyse von Target-deg und statistische Bewertung

1. Schneiden Sie jede metabolitenspezifische vorhergesagte Ziel-Liste mit der genbasierten DEG-Liste bei einem FDR < 0,05. Notieren Sie die überlappenden Gene, das Ursprungs-Metabolit, logFC, angepassten P-Wert und Expressionsrichtung.
2. Vereinigen Sie die metabolitenspezifischen Überlappungslisten zu einer nicht redundanten MAG-Liste. Zählen Sie die Gesamtanzahl der vorhergesagten Zielgene, metabolitenspezifischen Überlappungen und der insgesamt eindeutigen MAGs.
3. Prüfen Sie die richtungsbezogene Konsistenz auf Ebene der Sonden für Gene mit mehreren Sonden. Markieren Sie jedes Gen, bei dem die Sonden hinsichtlich der Expressionsrichtung uneinheitlich sind.
4. Erstellen Sie die Kontingenztabelle für den exakten Fisher-Test unter Verwendung der Gesamtanzahl der kollabierten Geneinträge, der Gesamtanzahl der DEGs, der Gesamtanzahl der eindeutigen vorhergesagten Zielgene und der beobachteten MAGs. Berechnen Sie den einseitigen P-Wert, das Chancenverhältnis (Odds Ratio) und das 95 % Konfidenzintervall mithilfe der Implementierung des exakten Fisher-Tests.
5. Falls die Hintergrund-DEG-Rate 50 % überschreitet, berichten Sie die Überlappung als beschreibend statt als unabhängig validierte Anreicherung. Betrachten Sie eine einheitliche Downregulation als beschreibendes Richtungsmuster, es sei denn, ein separater Test zur Richtungsbestimmung wird durchgeführt.

6. Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks und Anreicherung von Signalwegen

1. Übermitteln Sie die vollständige, eindeutige MAG-Liste zur Konstruktion des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks und der Pfadverknüpfungsanreicherung²⁰ (siehe Tabelle der Materialien). Wählen Sie Homo sapiens aus und legen Sie den minimalen Interaktionsscore auf 0,700 fest.
2. Exportieren Sie das kombinierte Netzwerk aus Protein-Protein-Interaktionskonstruktion und Pfadverknüpfungsanreicherung sowie die vollständige Interaktionstabelle. Falls textbasierte Mining-Verfahren eine künstlich dichte Topologie erzeugen, deaktivieren Sie das Text-Mining und behalten Sie experimentelle, Ko-Expressions- und Datenbankkanäle bei.
3. Erstellen Sie Metabolit-Klassen-Subnetzwerke für SCFA-assozierte, gallensäureassoziierte sowie Tryptamin/Serotoninerge MAGs. Verwenden Sie dieselben Einstellungen für Organismus und Konfidenz wie bei der Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkkonstruktion und Pfadverknüpfungsanreicherung.
4. Führen Sie die Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkkonstruktion und Pfadverknüpfungsanreicherung gegenüber der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)²¹, Reactome²² und Gene Ontology (GO) Biological Process^23,24 durch. Wenden Sie die Benjamini–Hochberg-BH-FDR <0,05 an und exportieren Sie alle Anreicherungstabellen.

7. Molekulares Docking

1. Entnehmen Sie experimentell bestimmte Rezeptorstrukturen aus der Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank RCSB PDB²⁵ (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie VDR/1DB1, NR1H4/FXR/3DCT, CASP3/2DKO und HTR2A/6A93 für die fünf priorisierten Protein-Ligand-Komplexe.
2. Bereiten Sie jeden Rezeptor vor, indem Sie Kette A beibehalten und Wasser, mitkristallisierte Liganden, Cofaktoren, Ionen und nicht-proteingebundene HETATM-Einträge entfernen. Entfernen Sie bei 6A93 vor der Rezeptorvorbereitung das T4-Lysozym-Fusionssegment.
3. Fügen Sie polare Wasserstoffatome hinzu, weisen Sie Gasteiger-Ladungen zu und speichern Sie jeden Rezeptor als PDBQT mit dem molekularstrukturellen Werkzeugpaket. Überprüfen Sie die Protonierungszustände der Histidin-Reste im Bindungsgebiet vor der PDBQT-Konvertierung und dokumentieren Sie die gewählten Zustände.
4. Erzeugen Sie die 3D-Struktur jedes Liganden im chemischen Strukturdatei-Konvertierungswerkzeug. Führen Sie eine Energieminimierung mit dem Universal Force Field (UFF) über 500 Schritte durch, legen Sie den Ionisierungszustand bei pH 7,4 fest, weisen Sie Gasteiger-Ladungen zu und speichern Sie das Ergebnis als PDBQT.
5. Definieren Sie ein Docking-Feld von 25 Å × 25 Å × 25 Å, zentriert auf dem Schwerpunkt des mitkristallisierten Liganden. Verwenden Sie die Zentren (10, 19, 33) für VDR, (137, 31, 78) für FXR, (37, 34, 32) für CASP3 und (12, −1, 61) für HTR2A.
6. Führen Sie ein molekulares Docking von Metabolitliganden an Zielproteine^26,27 mit Exhaustiveness = 8, Seed = 42, num_modes = 9 und energy_range = 3 kcal/mol durch. Notieren Sie den am höchsten bewerteten Vina-Score sowie die Root-Mean-Square-Abweichung (RMSD)-Werte für alle Positionierungen.
7. Wählen Sie Modus 1 für jeden priorisierten Komplex. Erzeugen Sie zweidimensionale Ligand-Rest-Diagramme mit einem molekularen Visualisierungswerkzeug und einem zweidimensionalen Interaktionsdiagramm-Tool sowie dreidimensionale Rezeptor-Ligand-Darstellungen in einem dreidimensionalen molekularen Visualisierungsprogramm.
8. Führen Sie Redocking-Kontrollen für VDR/1DB1 und FXR/3DCT durch. Akzeptieren Sie die Rezeptor-Docking-Konfiguration, wenn die RMSD der schweren Atome <2,0 Å im Vergleich zur kristallographischen Position ist.
9. Führen Sie Cross-Docking-Kontrollen durch, indem Sie Lithocholsäure (LCA) in CASP3 und Tryptamin in VDR docken. Vergleichen Sie die Scores der kognaten und nicht-kognaten Bindungen und notieren Sie Fälle, in denen die Score-Differenz <1,0 kcal/mol beträgt.

8. Molekulardynamik-Simulation

1. Generieren Sie Ligandenparameter mit einem CHARMM-kompatiblen Dienst zur Ligandenparametrisierung²⁸ (siehe Tabelle der Materialien). Überprüfen Sie alle Strafwerte und markieren Sie jeden Parameter mit einem Strafwert >50.
2. Konvertieren Sie Liganden-Stream-Dateien mithilfe des Skripts zur Umwandlung von Kraftfeld-Topologien in für die Molekulardynamik-Engine geeignete .itp- und .prm-Dateien. Kombinieren Sie Liganden- und Proteintopologiedateien für jeden Komplex.
3. Wenden Sie die Umverteilung der Wasserstoffmassen mit der Bibliothek für molekulare Topologie- und Parameterkonvertierung an. Erzeugen Sie wässrige Topologien unter Verwendung des für Molekulardynamik-Simulationen verwendeten Protein-Kraftfelds²⁹ und eines expliziten Drei-Punkt-Wassermodells³⁰.
4. Solvatisieren Sie die wässrigen Komplexe in einer dodekaedrischen Box mit einem Mindestabstand von 1,2 nm zwischen Solut und Boxrand. Neutralisieren Sie die Systeme und fügen Sie NaCl bis zu einer Konzentration von 0,15 M hinzu.
5. Erstellen Sie das Tryptamin-HTR2A-Membransystem mit einem webbasierten Werkzeug zur Konstruktion von Membransystemen^31,32,33 (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie rezeptorbezogene Koordinaten, die auf der Membran-Protein-Orientierungsdatenbank basieren³⁴ (siehe Tabelle der Materialien), eine reine POPC-Doppelschicht, 22,5 Å dicke Wasserschichten und 0,15 M NaCl.
6. Minimieren Sie die Energie aller Systeme mittels steilstem Abstieg über bis zu 50.000 Schritte. Bestätigen Sie die Konvergenz bei einem Fmax <1000 kJmol^-1nm^-1, bevor die Einlaufphase beginnt.
7. Stabilisieren Sie die wässrigen Systeme mittels Ensemblemethode mit konstanter Teilchenzahl, Volumen und Temperatur (NVT) sowie konstanter Teilchenzahl, Druck und Temperatur (NPT). Stabilisieren Sie das Membransystem mithilfe des sechsstufigen, webbasierten, mehrstufigen Workflows zur Vorbereitung und Stabilisierung molekularer Systeme unter allmählicher Freigabe von Restriktionen.
8. Führen Sie eine Produktions-Molekulardynamik-Simulation über 200 ns für alle fünf Komplexe durch. Verwenden Sie eine Zeitschrittweite von 4 fs mit Wasserstoff-Massen-Umverteilung (HMR), dem V-rescale-Thermostat bei 310 K, dem Parrinello-Rahman-Barostat bei 1 bar, der Particle-Mesh-Ewald-(PME)-Elektrostatik³⁵ und LINCS-Restriktionen³⁶.
9. Analysieren Sie die endgültigen Trajektorien mit Hilfsmitteln zur Auswertung von Molekulardynamik-Trajektorien. Berechnen Sie den Backbone-RMSD, die Cα-Root-mean-square-Fluktuation (RMSF), den Trägheitsradius, die solventzugängliche Oberfläche (SASA) sowie die Wasserstoffbrücken zwischen Protein und Ligand, wobei die letzten 150 ns als primärer Analysezeitraum verwendet werden.

9. Schätzung der bindenden Freien Energie mittels MM-PBSA

1. Extrahieren Sie Trajektorien-Aufnahmen für die MM-PBSA-Analyse. Verwenden Sie 2.001 Frames für jeden wässrigen Komplex und 201 verarbeitete Frames für das membrangebundene HTR2A-Subsystem.
2. Führen Sie das Werkzeug zur Berechnung der Bindungsenergie aus Molekülmechanik und Kontinuumslösung³⁷ mit Poisson-Boltzmann-Solvatation, einem dielektrischen Innenkonstantenwert von 1, einem dielektrischen Außenkonstantenwert von 80, einer SASA-basierten unpolaren Solvatation und ohne Entropiekorrektur durch. Geben Sie die mittlere Bindungsenergie und die Standardabweichung an.
3. Führen Sie eine pro-Rest-Zerlegung für alle fünf Komplexe durch. Geben Sie stabilisierende und destabilisierende Reste mit absoluten Beiträgen ≥0,5 kcal·mol⁻¹ an.

    

Ergebnisse

Kandidaten für metabolitassoziierte Zielstrukturen

Die neun Metaboliten ergaben heterogene vorhergesagte Zielstrukturen in einer chemisch-proteinspezifischen Interaktionsvorhersage und einem molekularen Docking-Programm. Propionsäure, Tryptamin, Gallensäuren und Urolithin A lieferten mehrere Zielstrukturen mit bekannter Relevanz für die gastrointestinale Signalübertragung. Zu dem vorhergesagten Zielstrukturenspektrum gehörten kanonische Membranrezeptoren, nukleare Rezeptoren, intrazelluläre Enzyme, Signalproteine und peptidhormonassoziierte Proteine. Die nachgeschalteten Ergebnisse werden daher als metabolitassoziierte Gene (MAGs) beschrieben, anstatt ausschließlich rezeptorbezogene Befunde (Tabelle 1).

Vergleich mit berichteten Metabolit-Protein-Interaktionen

Um die Zielvorhersageergebnisse anhand bestehender experimenteller Erkenntnisse zu bewerten, wurden die vorhergesagten metabolitassoziierten Zielbeziehungen in drei Evidenzstufen klassifiziert: (i) experimentell belegte direkte oder nahe verwandte klassenspezifische Metabolit-Protein-Interaktionen, bei denen der Metabolit oder ein eng verwandter endogener Metabolit bereits als bindend, aktivierend, hemmend oder funktionell regulierend für das codierte Protein beschrieben wurde; (ii) durch Signalwege oder Zielklassen gestützte Interaktionen, bei denen das vorhergesagte Ziel zu einem etablierten, metabolitreaktiven Signalweg oder Rezeptorfamilie gehört, direkte Belege für das genaue Metabolit-Protein-Paar jedoch begrenzt sind; und (iii) rein rechnergestützte Assoziationen, für die in der ausgewerteten Literatur keine direkte experimentelle Interaktion nachgewiesen werden konnte. Diese Bewertung diente dazu, die vorhergesagten MAGs einzuordnen, nicht deren Gültigkeit zu bestätigen.

Mehrere Vorhersagen spiegelten zuvor berichtete biologische Zusammenhänge wider. Die Propionat-FFAR2-Interaktion wurde als experimentell gestützt betrachtet, da FFAR2/GPR43 ein kanonischer Rezeptor für kurzkettige Fettsäuren ist. Butyrat-HDAC3 wurde als experimentell oder klassenbasiert gestützt klassifiziert, da Butyrat ein anerkannter Inhibitor der histonendeacetylierenden Enzyme ist und die vorhergesagte Wechselwirkung ein Mitglied der HDAC-Enzymfamilie betraf. Vorhersagen im Zusammenhang mit Gallensäuren, die NR1H4/FXR und VDR betreffen, wurden aufgrund der etablierten Biologie der Gallensäure-Nuklearrezeptoren als gestützt angesehen, insbesondere für hydrophobe Gallensäuren wie LCA; Vorhersagen bezüglich FXR und Ursodeoxycholsäure (UDCA) wurden mit Vorsicht interpretiert, da UDCA im Allgemeinen ein schwächerer oder kontextabhängiger FXR-Ligand ist. Die mit Tryptamin assoziierten Vorhersagen für HTR1B, HTR2A, HTR2B und HTR6 wurden als durch serotonerge Signalwege gestützt, jedoch nicht als bestätigte direkte rezeptorspezifische Interaktionen eingestuft, da Tryptamin ein mikrobiell aus Tryptophan gebildetes Monoamin ist und Serotoninrezeptoren als etablierte Regulatoren der gastrointestinellen Motilität und Sekretion gelten. Urolithin A-CASP3 wurde als durch Signalwege gestützt betrachtet, basierend auf publizierten Hinweisen auf Zusammenhänge zwischen Urolithin A und apoptotischen bzw. Caspase-vermittelten Reaktionen, jedoch nicht durch direkte Nachweise einer Bindung an CASP3. Indol-3-milchsäure-KYAT1 und Indol-3-propionsäure-KYAT1 blieben als rein rechnergestützte Hypothesen erhalten, da die Gesamtliteratur zwar eine Rolle mikrobieller Indolderivate in der Wirtssignalgebung unterstützt, jedoch keine direkte Bindung dieser spezifischen Metaboliten an KYAT1 belegt ist^7,8,38,39,40.

Dementsprechend unterscheidet Tabelle 1 die rechnergestützte Zielstrukturvorhersage von dem Grad vorheriger experimenteller oder pfadbezogener Evidenz. Zudem enthält sie für jedes Ziel die Vorhersagequelle (eine Vorhersage der Chemikalien-Protein-Wechselwirkung, ein molekulares Docking-Programm oder beides), den kombinierten Interaktionsscore für die Vorhersage der Chemikalien-Protein-Wechselwirkung sowie die Wahrscheinlichkeit des molekularen Docking-Programms, falls das Ziel mittels eines solchen Programms identifiziert wurde. Vorhergesagte Zielstrukturen ohne direkte, vorherige experimentelle Belege werden als kandidatenhafte, metabolitassoziierte Gene beschrieben, die eine unabhängige Validierung auf Proteinebene und hinsichtlich der Ligandenantwort erfordern.

Überlappung zwischen vorhergesagten Zielstrukturen und bei IBS-C differenziell exprimierten Genen

Der Durchschnitt der vereinigten, vorhergesagten Ziel-Listen und der differentiell exprimierten Gene auf Genebene identifizierte 17 eindeutige, vorhergesagte, metabolitassoziierte Gene, die im Vergleich zwischen IBS-C und gesunden Probanden signifikant differentiell exprimiert waren. Alle 17 Gene waren herunterreguliert. Die Gruppe umfasste Membran- und Kernrezeptoren (CASR, FFAR2, GPR68, HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6, NR1H4, TBXA2R, VDR) sowie Nicht-Rezeptorproteine (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, HDAC3, KYAT1, MLN) (Tabelle 1, Abbildung 2A,B).

Alle 17 MAGs erfüllten eine Fehlentdeckungsrate (FDR) unterhalb eines Schwellenwerts von 0,05; 16 von 17 erfüllten die strengere FDR < 0,001, wobei das verbleibende Gen (HTR1B) bei FDR < 0,05 signifikant war. Sieben der 17 Zielgene (CASP3, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, HDAC3, TBXA2R) erfüllten sowohl die Bedingung FDR < 0,001 als auch eine absolute log₂-Fold-Change von mehr als 1,0 (logFC-Bereich −1,34 bis −1,10), was auf eine starke und konsistente Herunterregulation dieser Untergruppe hindeutet. Die übrigen Zielgene zeigten eine moderate, aber statistisch signifikante Herunterregulation (|logFC| im Bereich von 0,45 bis 0,97). Dieses einheitliche beschreibende Muster wurde unter Berücksichtigung der genomweiten Expressionsmerkmale des Datensatzes vorsichtig interpretiert (siehe statistische Bewertung unten).

Statistische Bewertung der Überlappung zwischen Ziel-DEG

Um die statistische Signifikanz der 17-Gen-Überlappung formell zu bewerten, wurde ein einseitiger Fishers exakter Test angewandt, wobei die 17 vorhergesagten Zielgene als Abfragesatz und alle 18.296 eindeutigen, genverkürzten Einträge aus GSE36701 als genomischer Hintergrund verwendet wurden. Von diesem Hintergrund waren 17.296 Gene (94,5 %) differentiell exprimiert bei FDR < 0,05, was einer nahezu universellen transkriptionellen Unterdrückung im Vergleich der rektalen Mukosa bei IBS-C entspricht. Alle 17 vorhergesagten Zielgene gehörten zu den differentiell exprimierten Genen (beobachtete Überlappung 17/17, 100 %). Angesichts der Hintergrundrate von 94,5 % für differentielle Expression beträgt die erwartete Überlappung für eine zufällig ausgewählte Menge von 17 Genen 16,1 Gene. Der Fishers exakte Test ergab einen p-Wert von 0,384 mit einer kontinuitätskorrigierten Odds Ratio von 2,03 (95-%-Konfidenzintervall 0,12–33,73), was bei α = 0,05 nicht statistisch signifikant war (Abbildung 3A–C).

Dieses Ergebnis zeigt, dass die beobachtete 17/17-Überlappung die durch den Zufall erwartete Überlappung im genomweiten Expressionsprofil dieses Datensatzes nicht übersteigt. Demnach werden diese Befunde als beschreibendes, gerichtetes Muster interpretiert, bei dem alle 17 vorhergesagten Zielstrukturen in der rektalen Mukosa von IBS-C-Patienten konsistent und signifikant herunterreguliert waren, und nicht als Beleg für eine statistische Anreicherung oder eine unabhängige Validierung gegenüber einem genomweiten Hintergrund. Ein formeller Anreicherungstest würde eine Reproduktion in transkriptomweiten Datensätzen mit selektiveren differentiellen Expressionsprofilen erfordern, bei denen deutlich weniger als die Hälfte aller Gene signifikant werden. Es sollte betont werden, dass die einheitliche Herunterregulierung aller 17 überlappenden Gene eine beschreibende Beobachtung und kein separat validiertes statistisches Ergebnis darstellt, da der differentiell exprimierte Hintergrund dieses Datensatzes selbst vorwiegend herunterreguliert ist; eine gemeinsame Abwärtsrichtung unter den überlappenden Genen war daher zu erwarten und wurde keinem formellen Test auf Richtungstendenz unterzogen. Diese einheitliche Richtung sollte folglich nicht als unabhängiger statistischer Beleg für eine koordinierte, metabolitenspezifische Regulation interpretiert werden.

Metabolitspezifische Muster

Propionat wies die größte Anzahl überlappender Gene auf, darunter CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN und TBXA2R, was eine mögliche Beteiligung der auf kurzkettige Fettsäuren ansprechenden und mit Gq assoziierten Signalübertragung nahelegt. Butyrat zeigte Überschneidungen mit HDAC3, was mit der butyratassoziierten Biologie der Histon-Deacetylasen übereinstimmt, obwohl eine alleinige Herunterregulierung der mRNA keine veränderte Butyratempfindlichkeit belegt. Zu den mit Gallensäuren assoziierten Überschneidungen gehörten die nukleären Rezeptoren VDR und NR1H4, die beide als Effektoren der Gallensäuresignalgebung im Darm anerkannt sind^38,39. Tryptamin überlappte mit HTR1B, HTR2A, HTR2B und HTR6, wodurch die serotonerge Signalübertragung als möglicher Modulkandidat identifiziert wurde – ein System mit gut dokumentierten Funktionen in der gastrointestinellen Motilität und Sekretion⁴⁰. Indol-3-milchsäure und Indol-3-propionsäure überlappten mit KYAT1, und Urolithin A überlappte mit CASP3.

Anreicherung von Wegen

Die funktionelle Anreicherungsanalyse der 17 überlappenden Gene ergab, dass sie an Signalwegen beteiligt sind, die mit der downstream-Signalübertragung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR), der Gαq-Signalübertragung, der Ligandenbindung an GPCR, dem serotonergen Synapsen, der Wechselwirkung zwischen neuroaktiven Liganden und Rezeptoren, der Calcium-Signaltransduktion, der cAMP-Signalübertragung und der Sekretion von Peptidhormonen assoziiert sind. Diese Ergebnisse stimmen mit der Zusammensetzung des Gen-Sets überein und untermauern dessen biologische Kohärenz, spiegeln jedoch die funktionelle Annotation der übermittelten Gene wider und keine unabhängigen Belege für eine Aktivität auf Ebene der Signalwege.

Struktur des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks

Die Konstruktion von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken und die Analyse der Anreicherung von Signalwegen wurden anhand von drei komplementären Netzwerken interpretiert. Im kombinierten 17-Gen-Meta-Netzwerk (Netzwerk 1) war die deutlichste, durch Annotation unterstützte Struktur eine GNAQ-zentrierte GPCR/Gαq-Signalübertragungskomponente, die GNAQ mit rezeptorassoziierten Genen verknüpfte, darunter TBXA2R, CASR, HTR2A und HTR2B. Eine begrenzte Verknüpfung der Serotoninrezeptoren blieb ebenfalls erhalten, vor allem zwischen HTR2A und HTR2B, während mehrere andere Gene an der gewählten Vertrauensschwelle isoliert oder schwach verbunden blieben. Das Propionat-spezifische Netzwerk (Netzwerk 2) zeigte eine stärker eingeschränkte Topologie, wobei GNAQ annotierte Verbindungen zu CASR und TBXA2R beibehielt, während FFAR2, GPR68, GCG, GPHN und MLN isoliert oder schwach verbunden waren. Das Tryptamin/Serotonin-Netzwerk (Netzwerk 3) umfasste HTR1B, HTR2A, HTR2B und HTR6; innerhalb dieser Teilmenge zeigten HTR2A und HTR2B die wichtigste, durch Annotation unterstützte Verbindung, während HTR1B und HTR6 an der gewählten Schwelle nicht direkt miteinander verbunden waren (Abbildung 4A–C).

Molekulares Docking

Das molekulare Docking wurde an fünf ausgewählten Metabolit-Protein-Komplexen durchgeführt. Die Paare aus Gallensäure und nuklearem Rezeptor zeigten günstigere Vina-Scores als Urolithin A-CASP3 und Tryptamin-HTR2A. LCA-VDR erzielte den besten Wert mit −10,0 kcal/mol, gefolgt von LCA-NR1H4/FXR (−9,9 kcal/mol) und UDCA-NR1H4/FXR (−9,4 kcal/mol). Urolithin A-CASP3 und Tryptamin-HTR2A wiesen niedrigere, aber dennoch akzeptable Werte von −7,1 kcal/mol auf (Tabelle 2).

Für den LCA-VDR-Komplex (PDB-ID: 1DB1) wurde die vorhergesagte Pose durch eine konventionelle Wasserstoffbrücke zwischen dem LCA-Carboxylatsauerstoff und Ser278 (4,29 Å) sowie umfangreiche hydrophobe Wechselwirkungen mit Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233 und His397 gestützt, zusätzlich zu van-der-Waals-Kontakten mit Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275 und Phe150. Die am höchsten bewertete Pose wies einen Vina-Score von −10,0 kcal/mol, eine Hohlvolumengröße von 2055 ų und ein Rasterzentrum von (10, 19, 33) auf (Tabelle 3, Abbildung 5A,B).

Für den LCA-NR1H4/FXR-Komplex (PDB-ID: 3DCT) ging die Docking-Score von −9,9 kcal/mol mit vorhergesagten Wasserstoffbrückenbindungen an His294 und Ile335, einer π-Sigma-Wechselwirkung mit His294 sowie hydrophoben Alkyl- oder π-Alkyl-Kontakten an Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352 und His447 einher, wobei zusätzliche van-der-Waals-Kontakte die Einlagerung des steroidal strukturierten Gerüsts in der FXR-Bindungstasche unterstützen (Tabelle 4, Abbildung 6A,B).

Die vorhergesagte Bindungsposition des UDCA-NR1H4/FXR-Komplexes (PDB-ID: 3DCT) zeigte eine konventionelle Wasserstoffbrücke mit His447 (3,66 Å), eine weitere Wasserstoffbrücke mit Gly322 (3,46 Å), eine π-Anion-Wechselwirkung mit Val325 (4,96 Å) sowie eine Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung mit Trp469 (4,51 Å). Die Interaktionskarte identifizierte außerdem ungünstige Donor-Donor-Kontakte mit Arg395 (3,89 Å) und Gln396 (3,40 Å), was darauf hindeutet, dass die niedrigere Vina-Bewertung von UDCA im Vergleich zu LCA in derselben Rezeptorbindungstasche auf einer weniger günstigen lokalen Geometrie oder Elektrostatik beruhen könnte (Tabelle 5, Abbildung 7A,B).

Im Urolithin A-CASP3-Komplex (PDB-ID: 2DKO) zeigte die vorhergesagte Bindungsart konventionelle Wasserstoffbrücken zu Gln161 (3,78 und 4,19 Å), Ser120 (3,95 Å) und Arg207 (3,05 und 3,77 Å) und wurde zusätzlich durch π-Kation-Wechselwirkungen mit Arg207, eine π-Donor-Wasserstoffbrücke mit Cys163 sowie zusätzliche π-Alkyl- und van-der-Waals-Kontakte, an denen Arg64, Ala162, His121, Ser205 und Trp206 beteiligt sind, stabilisiert (Tabelle 6, Abbildung 8A,B).

Für den Tryptamin-HTR2A-Komplex (PDB-ID: 6A93) wurde die vorhergesagte Bindungsposition durch eine elektrostatische Salzbrücke zwischen dem protonierten Amin des Tryptamins und Asp155 stabilisiert, dem konservierten Aspartat in Helix 3 der Transmembrandomäne (D3.32 in Ballesteros-Weinstein-Nummerierung), das das protonierte Amin aminergischer Liganden in Serotonin- und verwandten Rezeptoren verankert^41,42,43, sowie durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Thr160 und Ser159, aromatische Wechselwirkungen mit Phe340 und Trp336 und π-Alkyl-Wechselwirkungen mit Val156 und Ile163. Weitere van-der-Waals-Kontakte mit Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332 und Leu123 stützten ein Muster der Bindung an die orthostatische Tasche (Tabelle 7, Abbildung 9A,B).

Validierung des Docking-Protokolls

Zur Beurteilung der Zuverlässigkeit des Docking-Protokolls wurden zwei komplementäre Kontrollexperimente durchgeführt. Bei den Redocking-(positiven) Kontrollen wurden ko-kristallisierte Liganden aus ihren Referenz-Röntgenstrukturen extrahiert und erneut in ihre ursprünglichen Bindungsstellen gedockt. Die am höchsten bewertete vorhergesagte Pose des Vitamin-D-Analogs VDX im VDR/1DB1 wies eine Abweichung von 0,87 Å von der kristallographischen Position auf, und der Ko-Kristall-Ligand WAY-362450 im FXR/3DCT wies eine Abweichung von 1,79 Å auf; beide Werte lagen unterhalb der üblichen Akzeptanzschwelle von 2,0 Å, was die geometrische Gültigkeit des Docking-Protokolls für diese Rezeptorsysteme stützt (Abbildung 10A,B). Bei den Cross-Docking-(negativen) Kontrollen wurde Lithocholsäure in Caspase-3 (2DKO), eine Cysteinprotease, für die sie kein bekannter Ligand ist, gedockt, was zu einer vorhergesagten Energie von −8,3 kcal/mol führte – 1,7 kcal/mol schwächer als an ihrem zugehörigen Ziel VDR (−10,0 kcal/mol) –, was mit einer vorhergesagten Selektivität der Bindungsstelle übereinstimmt. Tryptamin, das in VDR gedockt wurde, ergab eine vorhergesagte Energie von −6,4 kcal/mol im Vergleich zu −7,1 kcal/mol an seinem zugehörigen Ziel HTR2A, eine Differenz von 0,7 kcal/mol, die innerhalb der berichteten Unsicherheit von molekularen Docking-Berechnungen für Metabolitliganden an Zielproteine liegt und daher nur eine geringe vorhergesagte Selektivität für diesen kleineren Liganden anzeigt (Abbildung 10C). Insgesamt zeigen diese Kontrollen, dass das Docking-Protokoll bekannte Bindungsgeometrien reproduziert und unter den getesteten Bedingungen zugehörige von nicht zugehörigen Paaren unterscheidet, wobei die vorliegenden rechnergestützten Vorhersagen jedoch keine experimentellen Affinitätsmessungen ersetzen (Tabelle 8).

Simulation der Moleküldynamik

Molekulardynamik-Simulationen wurden für die fünf priorisierten Komplexe über Produktions-Trajektorien von 200 ns durchgeführt. Die vier löslichen und nukleären Rezeptorkomplexe wurden in explizitem wässrigem Lösungsmittel simuliert, während der Tryptamin-HTR2A-Komplex in einer expliziten POPC-Lipiddoppelschicht simuliert wurde, um eine physiologisch angemessene Membranumgebung für diesen G-Protein-gekoppelten Rezeptor bereitzustellen. Analysen überprüften die dynamische Stabilität der gedockten Konformationen unter zeitabhängigen Bedingungen und ermöglichten den Vergleich des relativen strukturellen Verhaltens zwischen den Komplexen (Tabelle 9).

Das RMSD-Profil des LCA-VDR/1DB1-Komplexes zeigte eine kurze Equilibrationphase während der ersten 10 ns, gefolgt von einer stabilen Plateauphase mit Schwankungen hauptsächlich im Bereich von 0,20–0,28 nm (Abbildung 11A). Die RMSF-Werte waren niedrig, und die Backbone-Schwankungen lagen bei den meisten Resten unter < 0,15 nm (Abbildung 11B). Die Wasserstoffbrückenanalyse zeigte ein beständiges Netzwerk von 2–5 Wasserstoffbrücken, gelegentlich mit Anstiegen auf 7 (Abbildung 11C). Der Trägheitsradius (Rg) blieb im Bereich von 1,25–1,75 nm, und die lösungsmittelzugängliche Oberfläche (SASA) lag konstant bei etwa 130 nm² (Abbildung 11D,E).

Der Urolithin A-CASP3/2DKO-Komplex zeigte eine stärkere dynamische Aktivität. Der RMSD stieg zunächst an und oszillierte anschließend zwischen 0,4 und 0,7 nm, mit einem kurzen Ereignis hoher Abweichung um 165 ns herum (Abbildung 12A). Die RMSF-Analyse zeigte eine hohe Mobilität auf Ebene der Aminosäurereste, wobei die größten Schwankungen im flexiblen Loop-Bereich um Rest 175 auftraten (Abbildung 12B). Die Wasserstoffbrückenanalyse ergab zunächst ein umfangreiches Netzwerk von etwa 2–5 Bindungen für die ersten 30–40 ns, gefolgt von meist 0 bis 2 vorübergehenden Bindungen (Abbildung 12C). Die entsprechenden Profile für Trägheitsradius und SASA sind in Abbildung 12D,E dargestellt.

Für die NR1H4/FXR-(3DCT-)Galle-Säure-Systeme blieb das Rückgrat-RMSD-Profil während des größten Teils der Trajektorie in einem relativ engen Bereich (Abbildung 13A), während das RMSF-Profil eine geringere Mobilität in den kernnahen Bereichen und stärkere Schwankungen in den flexiblen Regionen zeigte (Abbildung 13B). Der LCA-3DCT-Komplex wies während der gesamten Trajektorie ungefähr drei bis vier persistente Wasserstoffbrücken auf, während der UDCA-3DCT-Komplex stärkere Schwankungen bei den Wasserstoffbrücken und eine Abnahme der Wasserstoffbrückenbindung nach etwa 125 ns zeigte. Die Trägheitsradiusprofile für die LCA- und UDCA-gebundenen Systeme sind in Abbildung 13C,D beziehungsweise dargestellt, und die entsprechenden SASA-Profile sind in Abbildung 13E,F dargestellt.

Membranmolekulardynamik des Tryptamin-HTR2A-Komplexes

Der Tryptamin-HTR2A/6A93-Komplex wurde 200 ns lang in einer expliziten POPC-Lipiddoppelschicht mit 258 Lipidmolekülen, einem expliziten Drei-Site-Wassermodell und 0,15 M NaCl simuliert, was eine Gesamtsystemgröße von etwa 100.925 Atomen ergibt^33,44,45. Der Rezeptor blieb während der gesamten Trajektorie stabil in der Doppelschicht eingebettet (Abbildung 14). Die Rückgrat-RMSD-Werte stiegen innerhalb der ersten 100 ns von etwa 0,10 nm auf ein stabiles Plateau nahe 0,15–0,20 nm an und blieben danach stabil, wobei alle Werte unter 0,25 nm lagen, was darauf hinweist, dass der Rezeptor im Membranmilieu eine stabile Konformation beibehielt, ohne sich global aufzufalten (Abbildung 15A). Die pro Rest berechnete RMSF zeigte geringe Schwankungen im transmembranen helikalen Kern, während erwartungsgemäß höhere Beweglichkeit in den Schleifen- und terminalen Bereichen beobachtet wurde, was mit der typischen Flexibilität von GPCRs übereinstimmt (Abbildung 15B). Der Trägheitsradius war eng zwischen etwa 2,06 und 2,12 nm begrenzt, und die SASA schwankte innerhalb eines schmalen Bereichs ohne progressive Drift, was beide Parameter die Erhaltung des kompakten transmembranen Bündels bestätigen (Abbildung 15C,D).

Die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Protein und dem Liganden blieben während der gesamten Trajektorie bestehen (Abbildung 15E), wobei die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen stark schwankte und zwischen 1 und 3 variierte. Um die Persistenz der entscheidenden ionischen Wechselwirkung gezielt zu bewerten, wurde der minimale Abstand zwischen dem protonierten Ammonium-Stickstoff von Tryptamin und den Carboxylat-Sauerstoffatomen von Asp155 (D3.32) über die gesamte Trajektorie hinweg überwacht. Dieser Abstand blieb eng um einen Mittelwert von 0,270 nm verteilt (Minimum 0,247 nm, Maximum 0,424 nm), und der Salzbrücken-Kontakt (< 0,4 nm) wurde für 99,9 % der Simulation aufrechterhalten, mit nur zwei kurzen, vorübergehenden Abweichungen und keinem anhaltenden Dissoziationsereignis (Abbildung 16). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die konservierte ionische Wechselwirkung mit Asp155 ausreichte, um Tryptamin während der gesamten Membransimulation in der orthosterischen Tasche von HTR2A zu stabilisieren.

MM-PBSA-Bindungsenergie und pro-Rest-Zerlegung

Die MM-PBSA-Analyse wurde durchgeführt, um den fünf Komplexen (Tabelle 10) eine zusätzliche energetische Priorisierungsschicht hinzuzufügen. Bei den vier wässrigen Komplexen identifizierte die pro-Rest-Zerlegung die wichtigsten energetischen Beiträge für jeden vorhergesagten Bindungsmodus. Im LCA-VDR/1DB1-Komplex zeigten Ligand und Gln317 einen günstigen Beitrag, während Trp286 einen ungünstigen Beitrag leistete. Im Urolithin A-CASP3/2DKO-Komplex wiesen Arg64 und Arg207 stark negative pro-Rest-Beiträge auf, was auf eine erhebliche polare oder elektrostatische Stabilisierung hinweist; dennoch blieb die entsprechende Trajektorie stark dynamisch, was zeigt, dass günstige energetische Wechselwirkungen auf Ebene einzelner Reste allein keine dauerhafte Komplexstabilität garantieren. Bei den 3DCT-Systemen wurde die LCA-Bindung hauptsächlich durch Arg331 bestimmt, während die UDCA-Bindung ein breiter verteiltes energetisches Netzwerk einschloss, das aus Glu326, Asp394, Arg395, Arg441 und Asp470 bestand. Insgesamt unterstützte die MM-PBSA-Zerlegung bei den vier wässrigen Systemen die relative Priorisierung der LCA-basierten Komplexe.

Für den membrangebundenen Tryptamin-HTR2A/6A93-Komplex wurde eine MM-PBSA-Analyse am Protein-Ligand-Subsystem durchgeführt, das aus der Bilayer-Trajektorie extrahiert wurde^46,47. Günstige Beiträge wurden für das Ligand und Asp155 (D3.32) beobachtet, wobei letzterer bei weitem der dominante restspezifische stabilisierende Beitrag war, was mit der in den Docking- und Trajektorienabstandsanalysen identifizierten Salzbrücken-Wechselwirkung übereinstimmt. Trp137 wies den größten ungünstigen Einzelrest-Beitrag unter den umgebenden Resten der orthosterischen Tasche (Ser86, Phe87, Phe133, Phe140, Phe141, Val156, Ser159, Thr160, Ile163, Val167, Tyr171) auf, die gemeinsam das aromatische und polare Kontakt-Netzwerk bilden, das die Bindungstasche auskleidet. Diese Werte stellen relative rechnerische Schätzungen für die strukturelle Priorisierung dar und entsprechen nicht experimentellen Bindungsaffinitäten.

Abbildung 1: Rechnergestützter Arbeitsablauf zur Priorisierung metabolitassoziiierter Wirtsgene bei IBS-C. Schematische Darstellung des achtstufigen Arbeitsablaufs, der die Metabolitauswahl, Zielvorhersage, transkriptomische differentielle Expression, Überlappungsanalyse, Netzwerk- und Pfadverdünnungsanalyse, molekulares Docking, Molekulardynamik-Simulation und MM-PBSA-Bindungsenergieanalyse umfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Analyse der differentiellen Expression und der Überlappung von Metabolitenzielen in der IBS-C-Mukosa. (A) Vulkandiagramm der differentiellen Genexpression auf Genebene in GSE36701. Blaue Punkte, signifikant herunterregulierte Gene; rote Punkte, signifikant hochregulierte Gene; graue Punkte, nicht signifikante Gene. Ausgewählte Gene, die mit Metaboliten überlappen, sind beschriftet. (B) Mengendiagramm, das die Überlappung zwischen 330 eindeutigen vorhergesagten Metabolitenzielen und herunterregulierten Genen in GSE36701 zeigt; 17 Gene waren gemeinsam. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Statistische Bewertung der 17 vorhergesagten Metabolit-Zielgene gegenüber GSE36701. (A) Log2-Fold-Change pro Gen für alle 17 Gene, farbcodiert nach Signifikanzklasse. (B) Rate differentieller Expression von Hintergrundgenen im Vergleich zu vorhergesagten Zielgenen, analysiert mit Fishers exaktem Test. (C) Eine 2×2-Kontingenztafel wird für Fishers exakten Test verwendet. Alle 17 Zielgene waren signifikant herunterreguliert; die Überschneidung wird als beschreibendes, gerichtetes Muster interpretiert, nicht als statistische Anreicherung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Konstruktion eines zusammengesetzten Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks und pfadverstärkte Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke überlappender, metabolitenassoziiierter Gene. (A) Netzwerk 1: kombiniertes Metanetzwerk aller 17 Gene. (B) Netzwerk 2: propionatspezifisches Netzwerk aus acht Genen (CASR, FFAR2, GCG, GNAQ, GPHN, GPR68, MLN, TBXA2R). (C) Netzwerk 3: Tryptamin/Serotonin-Netzwerk aus vier Genen (HTR1B, HTR2A, HTR2B, HTR6). Die Netzwerke wurden mindestens für Homo sapiens erstellt, unter Verwendung einer Vertrauenswürdigkeit von ≥ 0,700 für die Konstruktion von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken und die Anreicherung von Pfaden. Kanten stellen funktionelle Assoziationen dar, die durch Annotationen gestützt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Dreidimensionale und zweidimensionale strukturelle Darstellung von Lithocholsäure im Komplex mit VDR (PDB-ID: 1DB1). (A) Dreidimensionale Oberflächen- und Strichrasterdarstellung mit Lithocholsäure als Kugeln. (B) Zweidimensionale Interaktionskarte, die die Wasserstoffbrücke zu Ser278 sowie umgebende hydrophobe und van-der-Waals-Kontakte zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6. Dreidimensionale und zweidimensionale strukturelle Darstellung von Lithocholsäure im Komplex mit NR1H4/FXR (PDB-ID: 3DCT). (A) Dreidimensionale Oberflächen- und Strichrasterdarstellung. (B) Zweidimensionale Interaktionskarte, die Wasserstoffbrückenbindungen mit His294 und Ile335, eine π-Sigma-Wechselwirkung sowie umgebende Kontakte zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Dreidimensionale und zweidimensionale Strukturdarstellung von Ursodeoxycholsäure im Komplex mit NR1H4/FXR (PDB-ID: 3DCT). (A) Dreidimensionale Oberflächen- und Strichrasterdarstellung. (B) Zweidimensionale Interaktionskarte, die Wasserstoffbrückenbindungen mit His447 und Gly322, eine π-Anion-Wechselwirkung mit Val325, eine Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung mit Trp469 sowie ungünstige Donor-Donor-Kontakte mit Arg395 und Gln396 zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Dreidimensionale und zweidimensionale Strukturdarstellung von Urolithin A im Komplex mit CASP3 (PDB-ID: 2DKO). (A) Dreidimensionale Oberflächen- und Strichrasterdarstellung. (B) Zweidimensionale Interaktionskarte, die Wasserstoffbrückenbindungen mit Gln161, Ser120 und Arg207, π-Kation-Wechselwirkungen mit Arg207, eine π-Donor-Wasserstoffbrücke mit Cys163 sowie umgebende Kontakte zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 9: Dreidimensionale und zweidimensionale Strukturdarstellung von Tryptamin im Komplex mit HTR2A (PDB-ID: 6A93). (A) Dreidimensionale Oberflächen- und Strichrasterdarstellung, erzeugt mit einem dreidimensionalen molekularen Visualisierungsprogramm. (B) Eine zweidimensionale Interaktionskarte, erzeugt mit einem Werkzeug für molekulare Visualisierung und zweidimensionale Interaktionsdiagramme, welche die Salzbrücke mit Asp155 und zusätzliche Bindungsstellen-Wechselwirkungen veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 10: Validierung des Docking-Protokolls. (A,B) Re-Docking kovalent kristallisierter Liganden in VDR/1DB1 (RMSD 0,87 Å) und FXR/3DCT (RMSD 1,79 Å); kristallographische und re-dockende Positionen sind überlagert, beide unterhalb der 2,0-Å-Akzeptanzschwelle. (C) Cross-Docking-Selektivität: eigenständige versus nicht-eigenständige Vina-Scores für Lithocholsäure und Tryptamin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 11. Analyse der Molekulardynamik-Trajektorie des LCA-VDR/1DB1-Komplexes über 200 ns. (A) RMSD-Verlauf. (B) RMSF-Verlauf. (C) Anzahl der Wasserstoffbrücken. (D) Trägheitsradius-Verlauf. (E) SASA-Verlauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 12: Analyse der Molekulardynamik-Trajektorie des Urolithin A-CASP3/2DKO-Komplexes über 200 ns. (A) RMSD-Verlauf mit breiten konformationellen Schwankungen und einem vorübergehenden Ereignis mit hoher Abweichung nahe 165 ns. (B) RMSF-Verlauf mit ausgeprägter Flexibilität auf Restebene nahe Rest 175. (C) Anzahl der Wasserstoffbrücken. (D) Trägheitsradius-Verlauf. (E) SASA-Verlauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 13: Analyse der Molekulardynamik-Trajektorie der NR1H4/FXR (3DCT) Gallensäure-Systeme über 200 ns. (A) Rückgrat-RMSD-Profil für den 3DCT-Komplex. (B) Rückgrat-RMSF-Profil. (C) Trägheitsradius-Profil für 3DCT-LCA. (D) Trägheitsradius-Profil für 3DCT-UDCA. (E) SASA-Profil für 3DCT-LCA. (F) SASA-Profil für 3DCT-UDCA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 14: Der Tryptamin-HTR2A-Komplex in einer expliziten POPC-Lipiddoppelschicht eingebettet. Der Rezeptor ist als Cartoon dargestellt, der die Doppelschicht durchzieht, die POPC-Lipide als Linien mit hervorgehobenen Phosphat-Kopfgruppen, und Tryptamin befindet sich in der orthosterischen Tasche. Wasser ist oberhalb und unterhalb der Membran dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 15: Analyse der Molekulardynamik-Trajektorie des Tryptamin-HTR2A/6A93-Komplexes über 200 ns in einer expliziten POPC-Lipiddoppelschicht. (A) Rückgrat-RMSD-Profil. (B) Pro-Rest-RMSF-Profil. (C) Trägheitsradius-Profil. (D) SASA-Profil. (E) Anzahl der Protein-Ligand-Wasserstoffbrücken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 16: Beständigkeit der ionischen Wechselwirkung zwischen Tryptamin und Asp155 (D3.32) entlang der 200-ns-Membrantrajektorie. Der minimale Abstand zwischen dem Ammonium-Stickstoff des Tryptamins und den Carboxylat-Sauerstoffatomen von Asp155 ist über die Zeit aufgetragen; die gestrichelte Linie markiert die Schwelle für einen Salzbrücken-Kontakt bei 0,4 nm. Der Kontakt wurde während 99,9 % der Simulation aufrechterhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Gen-Symbol	Metabolitenursprung	Funktionelle Kategorie	log2FC	FDR (adj. P-Wert)	Signifikanzstufe
GCG	Propionat	Peptidhormon-bezogenes Protein	−1,342	1,97e−7	FDR <0,001 & |logFC > 1
HDAC3	Butyrat	Enzym	−1,234	2,44e−6	FDR <0,001 & |logFC| > 1
CASP3	Urolithin A	Enzym	−1,198	6,66e−7	FDR <0,001 & |logFC| > 1
GPR68	Propionat	Membranrezeptor	−1,137	4,35e−6	FDR <0,001 & |logFC| > 1
GNAQ	Propionat	Intrazelluläres Signalprotein	−1,122	1,05e−6	FDR <0,001 & |logFC| > 1
GPHN	Propionat	Anderes intrazelluläres Protein	−1,109	1,13e−6	FDR <0,001 & |logFC| > 1
TBXA2R	Propionat	Membranrezeptor	−1,104	4,04e−7	FDR <0,001 & |logFC| > 1
HTR6	Tryptamin	Membranrezeptor	−0,967	2,17e−5	FDR <0,001
VDR	Lithocholsäure	Nuklearrezeptor	−0,942	5,73e−7	FDR <0,001
HTR2A	Tryptamin	Membranrezeptor	−0,937	4,99e−6	FDR <0,001
FFAR2	Propionat	Membranrezeptor	−0,889	1,44e−4	FDR <0,001
NR1H4	Lithocholsäure / Ursodeoxycholsäure	Nuklearrezeptor	−0,861	3,68e−6	FDR <0,001
HTR2B	Tryptamin	Membranrezeptor	−0,702	1,29e−4	FDR <0,001
MLN	Propionat	Peptidhormon-bezogenes Protein	−0,605	7,39e−5	FDR <0,001
KYAT1	Indol-3-milchsäure / Indol-3-propionsäure	Enzym	−0,530	3,61e−4	FDR <0,001
CASR	Propionat	Membranrezeptor	−0,483	4,05e−4	FDR <0,001
HTR1B	Tryptamin	Membranrezeptor	−0,455	3,18e−2	FDR <0,05

Tabelle 1: Vorhergesagte metabolitassoziierte Zielgene, die mit differenziell exprimierten Genen im IBS-C-Rektalmukosa-Datensatz überlappen. Alle aufgeführten überlappenden Gene waren herunterreguliert. Tabelle 1 wird separat als Tabellendatei eingereicht und listet für jedes Ziel den bzw. die Ursprungs-Metaboliten, die funktionelle Kategorie, die Quelle der Zielvorhersage (eine chemisch-proteinische Interaktionsvorhersage, ein molekulares Docking-Programm oder beides), einen kombinierten Interaktionsscore aus der chemisch-proteinischen Interaktionsvorhersage sowie – wo verfügbar – die Vorhersagesicherheit des molekularen Docking-Programms, die Vorhersagestufe, die log2-Fold-Change, den FDR-Wert und die Expressionssignifikanzstufe auf. Quelle: Genexpressionwerte wurden aus der genverdichteten differentiellen Expressions-Tabelle GSE36701 entnommen (Probe mit niedrigstem FDR-Wert pro Gen). Quellen und Konfidenzwerte der Zielvorhersage wurden aus der Ausgabe einer chemisch-proteinischen Interaktionsvorhersage und eines molekularen Docking-Programms zusammengestellt, wobei Schwellenwerte von ≥ 0,700 für den kombinierten Interaktionsscore der chemisch-proteinischen Interaktionsvorhersage und ≥ 0,70 für die Vorhersagewahrscheinlichkeit des molekularen Docking-Programms angewandt wurden. Die Scores der chemisch-proteinischen Interaktionsvorhersage sind kombinierte Werte auf einer Skala von 0 bis 1; STP steht für die Vorhersagewahrscheinlichkeit des molekularen Docking-Programms. Stufe 1 = strikte Unterstützung durch die chemisch-proteinische Interaktionsvorhersage; Stufe 1+ = strikte Unterstützung durch die chemisch-proteinische Interaktionsvorhersage, zusätzlich durch ein molekulares Docking-Programm bestätigt.

Komplex	Protein (PDB-ID)	Ligand	Vina-Score (kcal/mol)	Hohlvolumen (A^3)	Gittermittelpunkt X,Y,Z (A)	Suchbox (A)
LCA-VDR	VDR (1DB1)	Lithocholsäure	−10.0	2055	10, 19, 33	25 x 25 x 25
LCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	Lithocholsäure	−9.9	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
UDCA-NR1H4/FXR	NR1H4/FXR (3DCT)	Ursodeoxycholsäure	−9.4	3395	137, 31, 78	25 x 25 x 25
Urolithin A-CASP3	CASP3 (2DKO)	Urolithin A	−7.1	233	37, 34, 32	25 x 25 x 25
Tryptamin-HTR2A	HTR2A (6A93)	Tryptamin	−7.1	3238	12, −1, 61	25 x 25 x 25

Tabelle 2: Ergebnisse der molekularen Docking-Analyse: am höchsten bewertete Docking-Ergebnisse von Metabolit-Liganden an Zielproteine sowie Hohlraumparameter für die fünf priorisierten Protein-Ligand-Komplexe. Die Hohlraumgröße ist in ų angegeben. Quelle: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx, Blatt 'Original_Docking_Scores'. Molekulares Docking von Metabolit-Liganden an Zielproteine; Exhaustiveness = 8, Seed = 42 (festgelegt), num_modes = 9 für alle Komplexe; berichtet ist die am höchsten bewertete Konformation (Modus 1).

Interaktionstyp	Reste	Abstand (A)	Anmerkungen
Konventionelle Wasserstoffbrücke	Ser278	4,29	LCA-Carboxylatsauerstoff
Hydrophober / Pi-Alkyl-Kontakt	Leu230, Val234, Trp286, Val300, His305, Tyr295, Leu233, His397	-
Van-der-Waals-Kontakt	Met272, Leu313, Ile271, Ile268, Leu309, Phe422, Val418, Ala231, Ala303, Cys288, Ser275, Phe150	-

Tabelle 3: Bindungsmodi für die Docking-Simulation von Lithocholsäure mit VDR (PDB-ID: 1DB1). Quelle: molekulare Visualisierung und zweidimensionales Interaktionsdiagramm-Tool 2D-Ligand-Rest-Interaktionsdiagramme, wie im Ergebnisteil der Veröffentlichung beschrieben (Molekulares Docking). „–“ zeigt an, dass für diesen Kontakt kein individueller Distanzwert angegeben wurde.

Interaktionstyp	Rest(e)	Abstand (A)	Anmerkungen
Wasserstoffbrücke	His294	-
Wasserstoffbrücke	Ile335	-
Pi-Sigma-Interaktion	His294	-
Alkyl-/Pi-Alkyl-(hydrophob)	Met290, Met328, Ala291, Leu287, Ile352, His447	-
Van-der-Waals-Kontakt	Zusätzliche Taschenreste (in der Quelle nicht einzeln angegeben)	-	Unterstützt die Aufnahme des steroidalen Gerüsts

Tabelle 4: Bindungsmodi, die für das Docking von Lithocholsäure mit NR1H4/FXR (PDB-ID: 3DCT) generiert wurden.

Quelle: molekulare Visualisierung und zweidimensionales Interaktionsdiagramm-Tool 2D-Ligand-Rest-Interaktionsdiagramme, wie im Abschnitt Ergebnisse (Molekulares Docking) des Manuskripts berichtet. „–“ weist darauf hin, dass für diesen Kontakt kein individueller Abstandswert angegeben wurde.

Interaktionstyp	Rest(e)	Abstand (A)	Anmerkungen
Konventionelle Wasserstoffbrücke	His447	3.66
Wasserstoffbrücke	Gly322	3.46
Pi-Anion-Wechselwirkung	Val325	4.96
Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindung	Trp469	4.51
Ungünstiger Donor-Donor-Kontakt	Arg395	3.89
Ungünstiger Donor-Donor-Kontakt	Gln396	3.40

Tabelle 5: Bindungsmodi für die Docking-Studie von Ursodesoxycholsäure mit NR1H4/FXR (PDB-ID: 3DCT). Quelle: Molekülvisualisierung und zweidimensionale Interaktionsdiagramm-Software 2D-Ligand-Rest-Interaktionsdiagramme, wie im Ergebnisteil der Veröffentlichung beschrieben (Molekulares Docking). „–“ zeigt an, dass für diesen Kontakt kein individueller Distanzwert angegeben wurde.

Interaktionstyp	Rest(e)	Abstand (Å)	Anmerkungen
Konventionelle Wasserstoffbrücke	Gln161	3,78
Konventionelle Wasserstoffbrücke	Gln161	4,19	zweiter Kontakt
Konventionelle Wasserstoffbrücke	Ser120	3,95
Konventionelle Wasserstoffbrücke	Arg207	3,05
Konventionelle Wasserstoffbrücke	Arg207	3,77	zweiter Kontakt
Pi-Kation-Wechselwirkung	Arg207	-
Pi-Donor-Wasserstoffbrücke	Cys163	-
Pi-Alkyl- / van-der-Waals-Kontakt	Arg64, Ala162, His121, Ser205, Trp206	-

Tabelle 6: Bindungsmodi für das Docking von Urolithin A mit CASP3 (PDB-ID: 2DKO). Quelle: molekulare Visualisierung und zweidimensionales Interaktionsdiagramm-Tool 2D-Ligand-Rest-Interaktionsdiagramme, wie im Ergebnisteil der Arbeit berichtet (Molekulares Docking). „–“ zeigt an, dass für diesen Kontakt kein Einzelabstandswert angegeben wurde.

Interaktionstyp	Rest(e)	Abstand (A)	Anmerkungen
Elektrostatische Salzbrücke	Asp155 (D3.32)	-	protonierte Aminogruppe von Tryptamin
Wasserstoffbrücke	Thr160	-
Wasserstoffbrücke	Ser159	-
Aromatischer Kontakt	Phe340, Trp336	-
Pi-Alkyl-Wechselwirkung	Val156, Ile163	-
Van-der-Waals-Kontakt	Tyr370, Phe339, Ser242, Phe243, Phe332, Leu123	-

Tabelle 7: Bindungsmodi für das Docking von Tryptamin mit HTR2A (PDB-ID: 6A93). Quelle: molekulare Visualisierung und zweidimensionale Interaktionsdiagramm-Software 2D-Ligand-Rest-Interaktionsdiagramme, wie im Ergebnisteil der Veröffentlichung beschrieben (Molekulares Docking). „–“ zeigt an, dass für diesen Kontakt kein Einzelabstandswert angegeben wurde.

(A) Re-Docking-Validierung (positive Kontrollen)
PDB-ID	Protein	Kokristallisiertes Ligand	Vina-Score (kcal/mol)	RMSD (Å)	Schwellenwert (Å)	Ergebnis
1DB1	VDR	VDX (Vitamin-D-Analogon)	−13,0	0,87	2,0	BESTANDEN
3DCT	FXR	WAY-362450 (064)	−11,9	1,79	2,0	BESTANDEN
(B) Cross-Docking-Validierung (negative Kontrollen)
Ligand	Kognitives Ziel (PDB)	Kognitiver Score (kcal/mol)	Nicht-kognitives Ziel (PDB)	Nicht-kognitiver Score (kcal/mol)	Delta (kcal/mol)	Selectivität
Lithocholsäure	VDR (1DB1)	−10,0	CASP3 (2DKO)	−8,3	1,7	Bestätigt
Tryptamin	HTR2A (6A93)	−7,1	VDR (1DB1)	−6,4	0,7	Deutlich (innerhalb der Vina-Unsicherheit +/−0,5–1,0)

Tabelle 8: Ergebnisse der Validierung des Docking-Protokolls: Redocking-RMSD-Werte (positive Kontrollen) und Cross-Docking-Scores (negative Kontrollen). Quelle: Docking_Validation/Results/Docking_Validation_Results.xlsx und Docking_Validation/Logs/*.log (ein molekulares Docking von Metabolit-Liganden an Zielproteine, Exhaustiveness = 8, Seed = 42, 25 Å × 25 Å × 25 Å Box). RMSD berechnet anhand von schweren Atomen und Übereinstimmung der Atomnamen (keine Überlagerung).

Komplex	RMSD (nm), Mittelwert + / – SD (Bereich)	Rg (nm), Mittelwert + / – SD (Bereich)	SASA (nm^2), Mittelwert + / – SD (Bereich)	Wasserstoffbrücken, Mittelwert + / – SD (Bereich)	RMSF (nm), Mittelwert (max)
LCA-VDR/1DB1	0.230 + / – 0.025 (0.167–0.296)	1.889 + / − 0.009 (1.863–1.919)	130.4 + / − 2.3 (122.3–137.4)	1.9 + / − 0.9 (0–7)	0.093 (max 0.600 bei Rest 120)
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.824 + / − 0.008 (1.804–1.849)	129.7 + / − 2.3 (121.9–138.1)	3.8 + / − 0.7 (1–6)	0.113 (max 0.298)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	0.190 + / – 0.020 (0.135–0.281)	1.834 + / − 0.013 (1.809–1.921)	131.0 + / −3.4 (121.6–143.5)	1.1 + / − 1.1 (0–5)	0.113 (max 0.298)
Urolithin A-CASP3/2DKO	0.521 + / – 0.058 (0.244–0.755)	1.892 + / − 0.024 (1.839–1.984)	134.9 + / − 3.0 (126.4–146.4)	0.6 + / − 0.7 (0–3)	1.172 (max 2.532 bei Rest 175)
Tryptamin-HTR2A/6A93 (Membran)	0.177 + / –0.017 (0.131–0.227)	2.089 + / − 0.007 (2.070–2.116)	165.1 + / − 2.7 (156.–172.7)	1.7 + / − 0.7 (0–4)	0.090 (max 0.319)

Tabelle 9: Zusammenfassung des Verhaltens aus 200 ns langen molekulardynamischen Simulationen für die fünf priorisierten Protein-Ligand-Komplexe, einschließlich des membrangebundenen Tryptamin-HTR2A-Systems. Quelle: Analyse-Tools für Molekulardynamik-Trajektorien (.xvg-Dateien) — gmx rms, gmx gyrate, gmx sasa, gmx hbond, gmx rmsf — berechnet über die letzten 150 ns (50–200 ns) jedes 200 ns langen Produktionslaufs gemäß Protokollschritt 8.8. RMSD/Rg an Hauptkette angepasst; SASA-Sondenradius 0,14 nm; H-Brücken Donor-Akzeptor-Grenzwert 0,35 nm / 30 °. LCA-3DCT und UDCA-3DCT teilen sich eine Protein-Hauptketten-Trajektorie (RMSD, RMSF) mit ligandspezifischem Rg/SASA/H-Brücken.

Tryptamin-HTR2A/6A93 (Membran) — quantitative Zerlegung pro Rest
Rest	Gesamte ddG-Beitrag (kcal/mol), Mittelwert + / − SD	Richtung
Asp155 (D3.32)	−89.94 + / − 6.81	Stabilisierend (dominant)
Tryptamin (Ligand)	−13.01 + / − 6.22	Stabilisierend
Tyr171	13.62 + / − 4.54	Destabilisierend
Val167	23.32 + / − 3.96	Destabilisierend
Val156	20.03 + / − 3.81	Destabilisierend
Thr160	4.86 + / − 3.64	Destabilisierend
Ser159	24.16 + / − 3.48	Destabilisierend
Ser86	24.48 + / − 3.65	Destabilisierend
Phe87	35.18 + / − 4.04	Destabilisierend
Phe133	32.80 + / −3.70	Destabilisierend
Phe140	30.63 + / − 3.84	Destabilisierend
Phe141	35.25 + / − 3.55	Destabilisierend
Ile163	27.64 + / − 3.71	Destabilisierend
Trp137	53.77 + / − 4.32	Destabilisierend (größter ungünstiger Beitrag)
Weitere vier Komplexe — in der Zerlegung pro Rest identifizierte Reste (qualitativ)
Komplex	Rest	Richtung
LCA-VDR/1DB1	Ligand (LCA)	Günstig
LCA-VDR/1DB1	Gln317	Günstig
LCA-VDR/1DB1	Trp286	Ungünstig
LCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg331	Günstig (dominant)
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Glu326	Gemischtes/verteiltes Netzwerk
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp394	Gemischtes/verteiltes Netzwerk
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg395	Gemischtes/verteiltes Netzwerk
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Arg441	Gemischtes/verteiltes Netzwerk
UDCA-NR1H4/FXR/3DCT	Asp470	Gemischtes/verteiltes Netzwerk
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg64	Stark günstig (polar/elektrostatisch)
Urolithin A-CASP3/2DKO	Arg207	Stark günstig (polar/elektrostatisch)

Tabelle 10: Per-Rest-MMPBSA-Zerlegung KURZE ZUSAMMENFASSUNG: stabilisierende und destabilisierende Reste (≥ 0,5 kcal mol⁻¹ absoluter Beitrag) für jedes der fünf priorisierten Protein-Ligand-Komplexe, einschließlich des membrangebundenen Tryptamin-HTR2A-Systems. Quelle: Membrane Simulation/03_MMPBSA/results/FINAL_DECOMP_MMPBSA.dat (Werkzeug zur Berechnung der Bindungsenergie mittels Molekularmechanik/Kontinuumslösungsmittel, Generalized Born (GB), per-Rest-Zerlegung, „Komplex: Gesamtenergie-Zerlegung“). Restnummern wurden von der internen Nummerierung des CHARMM-GUI-erstellten Systems (Offset +68) in die ursprüngliche 6A93-PDB-Nummerierung umgerechnet, die ansonsten in dieser Arbeit verwendet wird.

Quelle: Vorherige_MD-Simulationsdaten/1DB1,2KD0, LCA & UDCA_3DCT}/mmpbsa_*/Decomposition_NORMAL_GB_Complex_TDC*.svg und Manuskript-Ergebnisse (MM-PBSA-Bindungsenergie und pro-Rest-Aufteilung). Für diese vier Komplexe liegen im Projektverzeichnis keine numerischen pro-Rest .dat/.csv-Ausgabedateien vor (lediglich gerenderte SVG-Diagramme mit vektoriellen Textpfaden, die nicht maschinell extrahierbar sind); es werden nur die Restidentität sowie die günstige bzw. ungünstige Richtung gemäß dem Manuskripttext berichtet. Exakte kcal/mol-Beiträge für diese vier Komplexe sind im Quell-Repository nicht verfügbar.

Diskussion

Diese explorative computerbasierte Studie demonstriert einen integrierten, reproduzierbaren Workflow zur Priorisierung mikrobieller Metabolit-assoziierter Wirtsgene und Protein-Ligand-Komplexe, der hier auf einen öffentlichen Transkriptomdatensatz der rektalen Mukosa aus IBS-C angewandt wurde. Mithilfe dieses Workflows überlappte eine Teilmenge vorhergesagter, mikrobiellen Metaboliten zugeordneter Gene mit konsistent herunterregulierten Genen im Datensatz und gruppierte sich innerhalb von GPCR-, serotonergen, Calcium-Signalweg-, neuroaktiven Ligand-Rezeptor- und nukleären Rezeptor-assoziierten Signalwegen, Systeme, die zunehmend in die Kommunikation zwischen Mikrobiota und Wirt einbezogen werden^48,49. Diese Ergebnisse sollten strikt als hypothesengenerierend betrachtet werden: Die Analyse misst weder Konzentrationen mikrobieller Metaboliten, noch die Häufigkeit von Rezeptorproteinen, Ligandenbindung, Rezeptoraktivierung, downstreamer Signalübertragung, Motilität, Sekretion, Schmerzreaktionen oder klinische Endpunkte. Die stärkste zulässige Schlussfolgerung ist, dass die identifizierten Gene und Signalwege Kandidaten für eine experimentelle Validierung darstellen, jedoch keine bestätigten Krankheitsmechanismen darstellen.

Die entscheidende Bedeutung dieses Protokolls im Vergleich zu früheren Arbeiten, die einzelne Metabolit-Rezeptor-Paare isoliert untersuchten, liegt in der Integration von Zielvorhersage, öffentlichen Transkriptomdaten, Netzwerkanalyse, Docking mit Validierungskontrollen, Molekulardynamik und MM-PBSA in eine einzige sequenzielle Priorisierungspipeline. Jede Phase verkleinert und kontextualisiert die von der vorhergehenden Phase erzeugte Kandidatenliste, und diese schrittweise Filterung macht die endgültige Kandidatenliste experimentell handhabbar. Das GNAQ-zentrierte GPCR-Modul und das mit Serotoninrezeptoren assoziierte Modul, die hier identifiziert wurden, sind biologisch plausibel angesichts der Rolle der Gq-Signalübertragung bei der Aktivierung von Phospholipase C, der Produktion von Inositol-1,4,5-trisphosphat, der Mobilisierung von Calcium, Sekretion und enteroendokriner Funktion sowie der etablierten Funktionen der von kurzkettigen Fettsäuren und aus Tryptophan abgeleiteten Signalübertragung bei der Schleimhaut-Homöostase und der serotonergen Signalübertragung bei der gastrointestinellen Motilität, Sekretion, viszeralen Sensitivität und der Kommunikation zwischen Darm und Gehirn^10,18,50,51.

Ein zentrales methodisches Merkmal dieser Studie ist die Behandlung des membrangebundenen Rezeptors HTR2A. Da eine Simulation in der Lösungsphase die lipidreiche Umgebung nicht reproduzieren kann, die das konformationelle Verhalten eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors bestimmt, wurde der Tryptamin-HTR2A-Komplex in einer expliziten POPC-Doppelschicht simuliert. In dieser membranären Umgebung blieb der Rezeptor über die gesamte 200-ns-Trajektorie strukturell stabil, und die Salzbrücke zwischen dem Tryptamin-Ammonium und Asp155 (D3.32) wurde im Wesentlichen während der gesamten Simulation aufrechterhalten. Dass drei unabhängige Beweislinien – die Docking-Position, der anhaltende Kontaktabstand über die Trajektorie hinweg und der dominante beitragsbasierte MM-PBSA-Wert pro Rest – auf dieselbe konservierte D3.32-Wechselwirkung hindeuten, unterstreicht die innere Kohärenz des vorhergesagten Tryptamin-Bindungsmodus, der die kanonische Bindungsgeometrie aminerger Liganden an Serotoninrezeptoren widerspiegelt.

Bei der Reproduktion dieses Workflows sind bestimmte methodische Aspekte zu berücksichtigen. Fehler in der kanonischen Struktur oder Pan-assay Interferenzverbindungen ((PAINS)-markierte Verbindungen) pflanzen sich über die Zielvorhersage und das Docking fort und erfordern daher eine genaue Auswahl der Metaboliten sowie eine sorgfältige chemoinformatische Aufbereitung. Zielproteingruppen, die durch Rauschen entstehen, sollten durch konsequente Anwendung der Vertrauenskriterien minimiert werden (Vorhersage chemischer Protein-Wechselwirkungen: ≥0,700; molekulares Docking-Programm: ≥0,70; Konstruktion von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken und Pfadverknüpfungsanalyse: ≥0,700). Vorhergesagte Zielstrukturen sollten nach funktionellen Kategorien gruppiert werden, um Fehlinterpretationen zu vermeiden, die entstehen, wenn alle metabolitassoziierten Gene als Rezeptoren klassifiziert werden. Eine präzise Vorverarbeitung der PDB-Strukturen, die Minimierung der Ligandenenergie sowie die Platzierung des Rasters um bekannte Bindungsreste sind entscheidende Aspekte des Dockings; die hier eingeführten Kontrollen durch Redocking und Cross-Docking liefern ein objektives Maß für die Korrektheit der Docking-Methodik. Die Reproduzierbarkeitsgrenzen in der molekularen Dynamik ergeben sich aus einer Kombination aus Kraftfeld-Parametrisierung, korrekter Solvatisierung oder Membranmodellierung, gestufter Äquilibration sowie ausreichender Produktions-Sampling-Dauer.

Zu den typischen Anpassungen und Problembehebungsschritten gehören die Absenkung der Schwellenwerte, falls die Zielvorhersage keine Treffer liefert, die Überprüfung der Richtungskonsistenz auf Ebene der Sonden für Gene mit mehreren Sonden sowie die Interpretation isolierter Knoten in der Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk-Konstruktion und der Pfadverdünnung als schwellenwertabhängig und nicht als biologisch irrelevant. Für Membranrezeptoren sollte eine explizite Simulation der Lipiddoppelschicht anstelle einer wässrigen Simulation verwendet werden, wie durch die hier beschriebene HTR2A-Methode veranschaulicht. Wo eine energiespezifische Zerlegung pro Rest erforderlich ist, muss die Berechnung mit einer dafür geeigneten Engine durchgeführt werden, und die angegebene Restnummerierung sollte mit der nativen Rezeptornummerierung abgeglichen werden, um Mehrdeutigkeiten zu vermeiden. Wir schlagen vor, die Ergebnisse der Pfadverdünnung am besten als organisatorischen Kontext für die Kandidatenliste zu betrachten, anstatt als validierende Aussage auf Pfadebene. Mechanisch gesehen treten Vergrößerungen der Begriffe GPCR, serotonerge Signalübertragung oder Calcium-Signalisierung immer dann auf, wenn die Genliste mehrere Serotoninrezeptorgene enthält, unabhängig von einer koordinierten Regulation auf Proteinebene. RMSD-, Rg- und RMSF-Werte für das in die Membran eingebettete HTR2A-System sollten unter Berücksichtigung der Lipiddoppelschicht interpretiert werden: Eine Abnahme des Rg-Werts in der späteren Trajektorie kann eine durch die Doppelschicht verursachte konformationelle Anpassung des transmembranen Bündels widerspiegeln und nicht eine globale Entfaltung; persistente Wasserstoffbrücken zwischen Ligand und Protein sollten zusammen mit der Gesamtstabilität des RMSD bewertet werden.

Die Einschränkungen dieser Studie sind erheblich und beeinträchtigen die Interpretation. Die Forschung basierte auf einem relativ kleinen öffentlichen Datensatz, und eine Suche in den wichtigsten öffentlichen transkriptomischen Datenbanken (webbasiertes Werkzeug zur differentiellen Genexpressionsanalyse und ArrayExpress) ergab zum Zeitpunkt der Analyse keinen unabhängigen Transkriptom-Datensatz der rektalen Mukosa bei IBS-C vergleichbaren Designs und Plattform, der als Replikationskohorte hätte dienen können. Das Fehlen einer unabhängigen transkriptomischen Replikation stellt eine wesentliche Einschränkung dar, und keiner der Aussagen in dieser Arbeit sollte als externe Validierung der Ergebnisse aus dem Einzeldatensatz interpretiert werden. Der Datensatz zeigt eine nahezu universelle differentielle Expression (etwa 94,5 % der Gene sind signifikant, wobei die überwiegende Mehrheit herunterreguliert ist), eine Eigenschaft, die herkömmliche Anreicherungsstatistiken uninformative macht und Schlussfolgerungen über die Spezifität der Zielgen-Herunterregulierung im Vergleich zum genomischen Hintergrund verhindert; die Übereinstimmung wird daher als beschreibendes, gerichtetes Muster und nicht als statistische Anreicherung angegeben. Die transkriptomische Analyse der gesamten Mukosa kann keine Unterscheidung zwischen tatsächlicher Genregulation und Veränderungen in der Zellzusammensetzung treffen. Die mRNA-Expression bestimmt nicht die Proteinkonzentration oder die funktionelle Reaktion. Vorhersagedatenbanken für Zielstrukturen leiden unter einer Annotationsverzerrung, und die Ergebnisse von Docking, MD und MM-PBSA hängen von der Wahl des Kraftfelds, der Liganden-Parametrisierung, der Startposition, der Simulationsdauer und der Angemessenheit der Stichprobenziehung ab. Exakte Minor-/Build-Kennungen einiger Webserver- und Paketkomponenten, einschließlich des CHARMM-kompatiblen Dienstes zur Liganden-Parametrisierung, CHARMM-GUI und der Umgebung für statistisches Rechnen,

Paketversionen und Unterversionen des Werkzeugs zur Berechnung der Bindungsenergie nach der Molekularmechanik/Kontinuumslösungsmethode waren aus dem archivierten Projektbestand nicht vollständig rekonstruierbar und sollten daher als in der separaten Tabelle der Materialien verfügbar angegeben werden. Die MM-PBSA-Werte sind relative Schätzungen, enthalten keinen expliziten Term für die konfigurative Entropie und dürfen nicht als experimentelle Affinitäten interpretiert werden. Die Studie umfasst keine metabolomischen Daten und kann daher nicht bestimmen, ob die Ligandenverfügbarkeit bei IBS-C verändert ist oder ob die beobachteten Expressionsänderungen Ursachen, Folgen, kompensatorische Reaktionen oder irrelevante Korrelationen darstellen.

Zukünftige Anwendungen dieser Methode sollten eine unabhängige transkriptomische Reproduktion, Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) und Validierung auf Proteinebene, Lokalisierung der Zelltypen mittels Einzelzell- oder räumlicher Transkriptomik, Metabolom-Profilierung der relevanten Metabolitenklassen sowie funktionelle Liganden-Antwort-Assays in kolonoiden Zellkulturen, Schleimhaut-Explantaten oder vergleichbaren Modellen umfassen. Vergleiche mit Kollektiven von Patienten mit diarreisch-dominiertem Reizdarm, gemischtem Reizdarm, entzündlichen Darmerkrankungen und nicht-IBS-bedingter Verstopfung^1,2 würden dazu beitragen, die Krankheitsspezifität zu etablieren. Für den strukturellen Teil würde die Reproduktion der MD-Trajektorien, die Durchführung von Sensitivitätsanalysen mit alternativen Startpositionen sowie die vollständige Dokumentation der Ablage der Topologie, Trajektorien und MM-PBSA-Eingabe- und -Ausgabedateien die Reproduzierbarkeit weiter stärken. Experimentelle Liganden-Antwort-Assays bleiben notwendig, um festzustellen, ob die priorisierten Komplexe funktionell relevant sind; die vorliegenden Ergebnisse stützen keine klinischen oder therapeutischen Aussagen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AutoDock Vina	Scripps Research / Open-Source	v1.2.7; https://vina.scripps.edu/	Molekulares Docking von Metabolit-Liganden an Zielproteine.
CGenFF/ParamChem	SilcsBio / University of Maryland	v4.6; https://cgenff.com/	Parameterisierung von Ligand-Kraftfeldern für die Molekulardynamik.
CHARMM36m-Kraftfeld	CHARMM-Entwickler / Open-Source	CHARMM36m; https://www.charmm.org/charmm/resources/charmm-force-fields/	Proteinkraftfeld, verwendet für Molekulardynamik-Simulationen.
CHARMM-GUI Membrane Builder	CHARMM-GUI / Lehigh University	Web-Server; genaue Version nicht rekonstruierbar; https://www.charmm-gui.org/?doc=input/membrane	Erstellung und Einrichtung der Gleichgewichtszustände für das explizite POPC-Membransystem.
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA (Dassault Systèmes)	2021; https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download	Zweidimensionale Analyse der Wechselwirkungen zwischen Ligand und Aminosäureresten.
GEO2R	NCBI Gene Expression Omnibus	Web-Tool; Zugriff Jan–Mai 2026; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/	Differenzielle Expressionsanalyse von GSE36701.
GeneCards	Weizmann Institute of Science	Web-Datenbank; Zugriff Jan–Mai 2026; https://www.genecards.org/	Überprüfung von Gen-Symbolen und Geninformationen während der Zielstandardisierung.
gmx_MMPBSA	Open Source (Valdés-Tresanco et al.)	1.5.x; https://valdes-tresanco-ms.github.io/gmx_MMPBSA/	MM-PBSA-Methode zur Schätzung der Bindungsenergie und zur Zerlegung nach Resten.
GROMACS	GROMACS-Entwicklungsteam / Open-Source	2024.2; https://www.gromacs.org/	Simulations-Engine für Molekulardynamik.
Transkriptomisches Datenset GSE36701	NCBI Gene Expression Omnibus	GSE36701; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE36701	Öffentliches Expressionsdatenset aus rektaler Mukosa bei IBS-C.
Open Babel	Open Source	3.2.0; https://openbabel.org/	Konvertierung chemischer Dateiformate, Generierung dreidimensionaler Liganden und Ligandenpräparation.
OPM-Datenbank	University of Michigan	Web-Datenbank; Zugriff Jan–Mai 2026; https://opm.phar.umich.edu/	Koordinaten zur Orientierung von Proteinen in Membranen, verwendet zur Ausrichtung von HTR2A.
ParmEd	ParmEd-Entwickler / Open-Source	4.x; https://parmed.github.io/ParmEd/html/index.html	Umfestlegung der Wasserstoffmassen und Verarbeitung von Topologien für Molekularsimulationen.
PyMOL	Schrödinger / Open-Source	2.x; https://www.pymol.org/	Dreidimensionale Strukturvisualisierung und Abbildungen von Rezeptor-Ligand-Komplexen.
RCSB Protein Data Bank	RCSB PDB	Web-Datenbank; Zugriff Jan–Mai 2026; https://www.rcsb.org/	Quelle experimenteller Proteinstrukturen und PDB-Koordinaten.
STITCH	STITCH-Konsortium (EMBL)	v5.0; https://stitch.embl.de/	Vorhersage chemischer Proteinwechselwirkungen und Zielstrukturen.
STRING	STRING-Konsortium / ELIXIR	v12.0; https://version-12-0.string-db.org/	Erstellung von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken und Pfad-Anreicherungsanalysen.
SwissADME	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / University of Lausanne	Web-Tool; Zugriff Jan–Mai 2026; https://www.swissadme.ch/	Cheminformatische Deskriptoren, Vorhersagen zur Pharmakokinetik und PAINS-Bewertung.
SwissTargetPrediction	SIB Swiss Institute of Bioinformatics / University of Lausanne	Web-Tool; Zugriff Jan–Mai 2026; https://www.swisstargetprediction.ch/	Ligandenbasierte Vorhersage menschlicher Proteinziele.
UniProt ID Mapping	UniProt-Konsortium	Webdienst; Zugriff Jan–Mai 2026; https://www.uniprot.org/id-mapping	Zuordnung von Proteinidentifikatoren zu standardisierten, von HGNC genehmigten Gen-Symbolen.
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; CUDA/Treiber-Version im Manuskript nicht angegeben	CUDA-fähige Grafikverarbeitungseinheit für Molekulardynamik-Simulationen.
CUDA-kompatible GPU	NVIDIA Corporation	CUDA-Toolkit-Version im Manuskript nicht angegeben; ≥8 GB VRAM	CUDA-fähige GPU mit ≥8 GB VRAM; die Workstation benötigte außerdem ≥32 GB RAM und eine 6-Kern-CPU.
Ubuntu Linux	Canonical Ltd. / Open-Source	22.04 LTS	64-Bit-Linux-Betriebssystem.
Python 3.9	Python Software Foundation	3.9	Allgemeine Programmierumgebung für Workflow-Skripting und Analyse.
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI / U.S. National Library of Medicine	Öffentliches Web-Repository; Softwareversion im Manuskript nicht angegeben	Öffentliches Funktionsgenomik-Daten-Repository.
AutoDockTools/MGLTools	Molecular Graphics Laboratory, Scripps Research	1.5.7	Werkzeugkasten zur Vorbereitung molekularer Strukturen und Docking-Eingaben.
GROMACS-Analysewerkzeuge	GROMACS-Entwicklungsteam / Open-Source	2024.2	Dienstprogramme zur Analyse von Molekulardynamik-Trajektorien.
Sechsschritt-Protokoll von CHARMM-GUI	CHARMM-GUI / Lehigh University	Web-Protokoll; genaue Version nicht rekonstruierbar	Mehrstufiger, webbasierter Workflow zur Vorbereitung und Gleichgewichtseinstellung molekularer Systeme.
cgenff_charmm2gmx_py3.py	Open-Source-Konvertierungsskript; Quelle im Manuskript nicht angegeben	Version im Manuskript nicht angegeben	Skript zur Konvertierung von Kraftfeld-Topologien.
Python	Python Software Foundation	3.9	Allgemeine Programmierumgebung.
SciPy	SciPy-Community / Open-Source	Version im Manuskript nicht angegeben	Wissenschaftliche Rechenbibliothek.
scipy.stats.fisher_exact	SciPy-Community / Open-Source	SciPy-Version im Manuskript nicht angegeben	Implementierung des exakten Fisher’schen Tests.
R	R Foundation for Statistical Computing	4.3.x	Statistische Rechenumgebung.
Bioconductor	Bioconductor-Projekt / Open-Source	3.18	Bioinformatisches Software-Framework.
limma	Bioconductor-Projekt / Open-Source	Version im Manuskript nicht angegeben	Paket zur Analyse differentieller Genexpression.
Benjamini–Hochberg-Verfahren	Statistische Methode	Nicht zutreffend (statistisches Verfahren)	Methode zur Anpassung der Falsch-Entdeckungs-Rate (FDR).
NVIDIA RTX 3080	NVIDIA Corporation	RTX 3080; ≥8 GB VRAM; CUDA/Treiber-Version im Manuskript nicht angegeben	Grafikverarbeitungseinheit mit mindestens 8 GB Videospeicher.
CUDA-kompatible GPU	NVIDIA Corporation	CUDA-Toolkit-Version im Manuskript nicht angegeben; ≥8 GB VRAM	Grafikverarbeitungseinheit zur Unterstützung allgemeiner paralleler Berechnungen.
Ubuntu Linux 22.04 LTS	Canonical Ltd. / Open-Source	22.04 LTS	64-Bit-Linux-Betriebssystem.
TIP3P	CHARMM-Kraftfeld-Entwickler / Open-Source	TIP3P; keine Softwareversion anwendbar	Drei-Ort-Modell für explizites Wasser.
MM/PBSA	gmx_MMPBSA-Entwickler / Open-Source	gmx_MMPBSA 1.5.x	Molekularmechanik/Poisson–Boltzmann-Oberflächenenergie-Methode zur Bestimmung der Bindungsenergie.