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Der adoptive Zelltransfer ist eine Methode, um interessante Zellen in einen Organismus einzuführen. Es ist eine leistungsstarke Technik, um verschiedene biologische Mechanismen zu untersuchen, einschließlich der Wirkung bestimmter Klassen von Immunzellen. Darüber hinaus ist der adoptive Transfer eine vielversprechende neuartige Behandlung für zahlreiche Erkrankungen, wie z. B. solche, die Knochenmarktransplantationen erfordern, oder Krebsbehandlungen, bei denen die eigenen T-Zellen eines Patienten extrahiert, verändert werden können, um die Krebszellen zu erkennen und zu zerstören, und dann in den Körper zurückgeführt werden können, um Tumore zu bekämpfen.
Im Labor werden häufig Tiermodelle verwendet, um den Adoptionstransfer zu untersuchen. Zum Beispiel fehlen CD45.1 Rag gamma-c Knockout-Mäusen grundlegende Rezeptoren für viele Zytokine, die für die normale Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen in Lymphozyten essentiell sind. Infolgedessen haben die Knockout-Mäuse eine beeinträchtigte Lymphozytenentwicklung und keine natürlichen Killer- oder NK-Zellen, T-Zellen oder B-Zellen.
Der adoptive Transfer kann verwendet werden, um die fehlenden Immunzellen in diese kompromittierten Mäuse einzuführen, indem zunächst Spendergewebe von Mäusen entnommen wird, das hohe Konzentrationen von Immunzellen enthält, wie z. B. die Milz. Anschließend wird das Gewebe dissoziiert und eine Vielzahl von Milzzellen, darunter auch die Immunzellen, isoliert. Als nächstes können unerwünschte Erythrozyten oder rote Blutkörperchen durch Zugabe von Ammoniumchlorid-Kalium-Lysingpuffer lysiert werden, und die verbleibenden weißen Blutkörperchen oder Splenozyten werden dann durch Zentrifugation von den Zelltrümmern getrennt.
Schließlich werden die gereinigten Splenozyten in die immungeschwächten Mäuse injiziert, was eine detaillierte Untersuchung der Funktionen dieser Zellen ermöglicht. Einige Tage später kann der Erfolg des adoptiven Immunzelltransfers bestätigt werden, indem zunächst die Wirtssplenozyten isoliert und auf die gleiche Weise wie das Spendergewebe präpariert werden. Anschließend werden diese Zellen mit markierten Antikörpern gegen die Immunzellmarker des Spenders gefärbt, damit sie mit FACS verifiziert und sortiert werden können.
Ziehen Sie zunächst Laborhandschuhe und die entsprechende Schutzausrüstung an. Waschen Sie anschließend eine Pinzette und eine Präparierschere zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70 % Ethanol und trocknen Sie sie dann mit einem sauberen Papiertuch ab. Bereiten Sie 50 Milliliter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) mit 2 % fötalem Kälberserum (FCS) vor, indem Sie einen Milliliter FCS mit 49 Millilitern HBSS in einer 50-Milliliter-Tube kombinieren. Mischen Sie, indem Sie die Lösung etwa 10 Mal vorsichtig auf und ab pipettieren.
Präparieren Sie die euthanasierte Maus und entfernen Sie ihre Milz, wie in der FACS-Technologie des JoVE-Videoprotokolls für die Trennung von Milz-B-Lymphozyten demonstriert. Um Immunzellen zu isolieren, legen Sie die Milz zunächst auf ein 40-Mikrometer-Zellsieb in einer Petrischale. Zerdrücke die Milz mit einem Kolben, um sie in die Schale zu dissoziieren. Gewinnen Sie die anhaftenden Zellen zurück, indem Sie den Kolben und das Sieb mit 1 Milliliter HBSS 2% FCS spülen. Pipettieren Sie dann die dissoziierte Milz und die Flüssigkeit aus der Petrischale in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Petrischale mit 5 Millilitern HBSS 2% FCS und geben Sie die Flüssigkeit in das 15 Milliliter Röhrchen.
Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 370 mal g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius und nehmen Sie dann das Röhrchen vorsichtig heraus, um das Pellet nicht zu stören. Entfernen Sie nun den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und entsorgen Sie die Flüssigkeit in einem geeigneten Abfallbehälter. Geben Sie dann zwei Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Lysingpuffer in das Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie auf und ab, um das Pellet zu resuspendieren und die Erythrozyten zu lysieren. Warten Sie zwei Minuten und fügen Sie dann HBSS 2% FCS zu dem resuspendierten Pellet hinzu, um einen Gesamtwert von 14 Millilitern zu erhalten. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig heraus und entsorgen Sie den Überstand. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 5 Millilitern HBSS 2% FCS, indem Sie auf und ab pipettieren. Zählen Sie als Nächstes die Zellen in Suspension. Geben Sie fünf Mikroliter Trypanblau zu fünf Mikrolitern Zellsuspension und mischen Sie es durch Pipettieren gut. Geben Sie dann vorsichtig einen fünf Mikroliter Tropfen verdünnter Zellsuspension zwischen das Deckglas und den Malassez-Objektträger. Wenn das Mikroskop auf 40-fache Vergrößerung eingestellt ist, zählen Sie die Anzahl der Zellen. Passen Sie die Zellkonzentration auf 10 bis sieben Zellen pro Milliliter an, indem Sie das entsprechende Volumen HBSS 2% FCS hinzufügen.
Um den adoptiven Transfer zu beginnen, überführen Sie zwei Milliliter der Zellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Sammelröhrchen. Das Röhrchen wird bei 370 mal g sieben Minuten lang bei 10 Grad Celsius zentrifugiert und dann der Überstand verworfen. Als nächstes resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung und zentrifugieren Sie das Röhrchen sieben Minuten lang bei 10 Grad Celsius bei 370 mal g. Entsorgen Sie den Überstand. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Injizieren Sie der Versuchsmaus mit einer 0,5-Milliliter-Spritze mit einer 29-Gauge-Nadel 200 Mikroliter Zellsuspension intravenös in den retroorbitalen Blutsinus.
Vier Tage nach dem Adoptivtransfer die Mäuse einschläfern und die Milz entfernen. Ernten Sie dann die Immunzellen, wie in Abschnitt drei beschrieben. Übertragen Sie als Nächstes 100 Mikroliter Zellsuspension von jeder Maus in zwei FACS-Röhrchen mit der Bezeichnung "Kontrolle" und "Transfer". Die Röhrchen werden bei 370 mal g sieben Minuten lang bei 10 Grad Celsius zentrifugiert und dann die Überstände verworfen. Bereiten Sie nun eine Mischung vor, die die vier Antikörper in der in Tabelle eins aufgeführten Verdünnung enthält. Geben Sie 100 Mikroliter der Mischung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie dann 20 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Geben Sie anschließend einen Milliliter HBSS 2% FCS in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen dann drei Minuten lang bei 10 Grad Celsius bei 370 mal g. Die Überstände werden verworfen und die Pellets in 200 Mikrolitern HBSS 2 % FCS wieder suspendiert. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in neu markierte FACS-Röhrchen. Verwenden Sie nun die Durchflusszytometrie, wie sie im FACS-Protokoll gezeigt wird, um das Vorhandensein von CD45 zu bewerten. 2 positive Lymphozyten.
Nun werden wir das Vorhandensein von CD45.2-Lymphozyten bestimmen, die aus dem CD45 isoliert wurden. 1 Wirtsmilz. Um zu beginnen, doppelklicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie die Dateien für jede Röhre in das Fenster für alle Proben. Doppelklicken Sie dann auf die übertragene Datei, um die aus dieser Stichprobe aufgezeichneten Zellen in einem Punktdiagramm anzuzeigen, das die Vorwärtsstreuung FSCA auf der X-Achse und die Seitenstreuung SSCA auf der Y-Achse anzeigt. Klicken Sie auf das Polygon, um die Lymphozytenpopulationen einzukreisen. Ein neues Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation wird angezeigt. Klicken Sie auf OK. Legen Sie nun die y-Achse auf FSC-W und die x-Achse auf FSC-A fest. Wählen Sie die einzelne Zellenpopulation mit dem Polygonwerkzeug aus, wie zuvor gezeigt.
Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Population, um ein neues Fenster für die ausgewählten Zellen zu erstellen. Wählen Sie im neuen Fenster CD45.2 auf dem Y und CD45.1 auf dem X. Klicken Sie auf das T-Symbol und passen Sie die Achse an, um das Diagramm zu vergrößern. Klicken Sie anschließend auf das Polygon, um die CD45.2-positiven Zellen einzukreisen. Benennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation die übertragene Zellpopulation und klicken Sie auf OK. Klicken Sie im selben Fenster auf das Rechteck, um die CD45.2-negativen Zellen auszuwählen. Benennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Subpopulation die Wirtszellen der Zellpopulation und klicken Sie auf OK. Doppelklicken Sie anschließend auf die CD45.2-eingekreiste Population, übertragene Population, um ein neues Fenster für die ausgewählten Zellen zu erstellen. Wählen Sie im neuen Fenster CD3 auf dem Y und CD4 auf dem X aus.
Klicken Sie anschließend auf das Polygon, um die CD4 CD3-positiven Zellen einzukreisen. Benennen Sie in diesem Fenster zur Identifizierung der Subpopulation Ihre übertragene Zellpopulation in CD4-Zellen. Wiederholen Sie dann die vorherigen Analyseschritte mit der Steuermausdatei. Um schließlich Ihre Zellpopulationen zu visualisieren, klicken Sie auf Layout-Editor. Ziehen Sie die übertragenen Zellen und die übertragene CD4-Zellbestückung aus den übertragenen Dateien und den Steuerdateien auf die Registerkarte Layouteditor. Es erscheint ein Punktdiagramm, das CD45.2-positive Zellen und CD4-Lymphozyten darstellt. CD45. 2 übertragene Zellen sollten nur im übertragenen Mauspunktdiagramm erscheinen.
