Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

Um stabile elektrophysiologische Ableitungen von den neuromuskulären Verbindungen von Joof-Larven zu erhalten, öffnen Sie zunächst eine Larve, um die Körperwand, die Muskulatur und das Nervensystem vor der Ableitung freizulegen. Die Axone an der Basis des zentralen Nervensystems werden hinter dem ventralen Ganglion durchtrennt.

Anschließend wird eine Ableitelektrode auf dem Muskel von Interesse platziert und eine Stimulations­elektrode in der Nähe der versorgenden motorischen Neuronen angebracht. Die durchtrennten Axone der motorischen Neuronen werden in die Stimulations­pipette hineingesaugt. Danach können erregende Endplatten­potentiale aufgezeichnet werden.

Hallo, ich bin Wendy MLA aus dem McCabe-Labor der Abteilung für Physiologie und zelluläre Biophysik an der Columbia University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Messung der tic-Übertragung an der neuromuskulären Verbindung von GE lava. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um synaptische Physiologie und Neurotransmission zu untersuchen.

Beginnen wir also. Zerlegen Sie wandern­de Larven im dritten Stadium und Star-Larven, um die Körperwand freizulegen. Dieses Protokoll ist für elektrophysiologische Experimente angepasst und verwendet kurze Dissektionsnadeln.

Sie sind etwa zwei bis vier Millimeter lang und stoßen während des Experiments weniger wahrscheinlich mit dem Objektiv des Mikroskops an den Elektroden an. Nachdem die Körperwand freigelegt wurde, halten Sie das ZNS mit einer Pinzette fest und heben Sie es leicht an. Schneiden Sie dann die motorischen Axone der peripheren Nerven durch und entfernen Sie das Gehirn.

Nachdem das Gehirn entfernt wurde, die präparierte Probe zweimal mit HL 3.1-Puffer mit einem Millimolar Calcium waschen. Nun, da die Dissektion abgeschlossen ist, können intrazelluläre Ableitungen von den Muskelzellen der Larve durchgeführt werden. Die Dissektionsplatte auf das Elektrophysiologie-Mikroskop stellen und die Probe mit HL 3.1-Puffer plus Calcium überdecken.

Danach fixieren Sie die Bad-Elektrode, sodass sie mit der Lösung in Kontakt steht. Die Saug-Elektrode dient zur Stimulation der peripheren Nerven, die den Muskel versorgen. Positionieren Sie die Saug-Elektrode zuerst in der Schale, um Vibrationen zu vermeiden, wenn die intrazelluläre Elektrode auf dem Muskel platziert wird.

Bringen Sie die Elektrode in die Schale ein und positionieren Sie sie nahe am Motoneuron, das den Muskel sechs innerviert. Im dritten Bauchsegment sanften Sog ausüben, bis der durchtrennte Nerv in der Glaspipette ist. Achten Sie darauf, die Nerven beim Anlegen des Sogs nicht zu dehnen.

Heben Sie die Pipette leicht an, sodass sie den Muskel nicht mehr berührt. Positionieren Sie sie anschließend so, dass keine Zugkraft auf die durchtrennten Nervenfasern ausgeübt wird. Sobald die Saugnadelelektrode richtig platziert ist, positionieren Sie die Ableitelektrode für die intrazellulären Ableitungen.

Verwenden Sie eine scharfe Mikroelektrode, die mit dreimolarer Kaliumchloridlösung gefüllt ist. Positionieren Sie die Ableitelektrode über dem Zentrum des Muskels sechs. Stellen Sie den Eingangs-Offset so ein, dass sie für die Badlösung null anzeigt.

Senken Sie die Elektrode langsam ab und nähern Sie sich unter hoher optischer Vergrößerung dem Muskel, bis sie die Muskelfläche berührt. Um zu bestätigen, dass der Muskel penetriert wurde, beobachten Sie das Oszilloskop. Das Ruhepotential der Membran sollte mindestens minus 60 Millivolt betragen.

Gelegentliche Miniatur-Endplattenpotentiale sollten nun sichtbar sein. Sobald die Aufnahmeelektrode positioniert ist, lassen Sie die Zellen eine Minute lang stabilisieren. Vor Beginn der Aufnahmen verwenden Sie einen Axon HS-2-Kopfverstärker in einem Axon Clamp 2B-Verstärker, um Änderungen im Membranpotenzial zu detektieren.

Die Achsspannvorrichtung Zwei B ist über die Digit-Daten 1322 A, die das Signal digitalisiert, mit einem Computer verbunden, auf dem die P-Clamp-Software läuft. Nehmen Sie das Membranpotential auf einem PC auf. Mit der Clamp-X-Software geben Sie Reize an das motorische Axon ab, um erregende Membranpotentiale oder EJS zu erzeugen.

Nachdem die ejps erzeugt wurden, nehmen Sie die miniaturartigen ejps über einen Zeitraum von drei Minuten ohne stimulierte Synapse auf. Die Software Mini Analysis kann verwendet werden, um die Spuren zu analysieren und die Amplitude sowie Frequenz der mini-ejps zu bestimmen. Um ejps zu erzeugen.

Verwenden Sie einen Master-Acht-Puls-Generator, um das abgetrennte Ende eines motorischen Neurons zu stimulieren. Der Generator gibt 0,3 Millisekunden lange Rechteckspannungsimpulse aus. Ein Zeitintervall von fünf Sekunden zwischen den Reizen ermöglicht die synaptische Erholung.

Notieren Sie am neuromuskulären Junction (NMJ) mindestens 10 evozierte Potentiale von jedem Muskel und mitteln Sie die Amplituden. Diese Abbildung zeigt eine typische Aufzeichnung vom Muskel sechs einer wildtypischen Sal-Larve mit evozierten EJP-Antworten und spontanen Mini-EJPs. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Aktionspotentiale von der neuromuskulären Verbindung von Drosophila-Larven aufzeichnet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Präparation innerhalb von drei bis zehn Minuten abzuschließen und die elektrophysiologischen Aufzeichnungen unverzüglich zu beginnen, solange die Zellen noch gesund und reaktionsfähig sind.

Wenn die Dissektion zu lange dauert, liegt das Ruhepotential der Muskelzellen unter minus 60 Millivolt, was zu niedrig ist, um es aufzeichnen zu können. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.