Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

Dieses Verfahren beginnt mit der Herstellung von Morpholino- und in-vitro-transkribiertem cap-mRNA. Eine Mikropipette wird durch Absaugen der Morpholino-haltigen Lösung gefüllt, und das Injektionsvolumen wird anschließend mithilfe eines Mikrometers an einem Ein-Zell-Stadium kalibriert. Danach werden Zebrafischembryonen gesammelt und in einer Mikroinjektionskammer für Mikroinjektionen in das Eiweiß angeordnet.

Die Arbeitslösung wird in das Eiweiß direkt unterhalb der Zelle injiziert, und zytoplasmatische Bewegungen dienen dazu, die Lösung für mikroinjektionen in die Zelle zu transportieren. Injizieren Sie die Lösung anschließend in das Zellzytoplasma. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius in E3-Medium und bewerten Sie die Phänotypen von Interesse in den nachfolgenden Entwicklungsstadien.

Hallo, ich bin Shiloh Yuen aus dem Labor, Sohn von Dr. Sasha und der Abteilung für Genetik an der Yale University School of Medicine. Heute werden wir eine robuste Mikroinjektionstechnik demonstrieren, mit der mRNA-Überexpression und Gen-Knockdown-Studien mittels morphologischer Oligonukleotide bei Zebrafischen durchgeführt werden können. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Rolle des S-Ziliums bei zystischen Nierenerkrankungen zu untersuchen.

Beginnen wir also. Ein leistungsfähiger Ansatz für Genfunktionsstudien besteht darin, in vitro transkribierte, kapazillerte RNA in Zebrafischembryonen mikroinjizieren. In dieser Demonstration werden wir einen mit EGFP markierten Transkript mikroinjizieren und die lebende, gesamte Embryonal-GFP-Expression als sichtbaren Nachweis einer erfolgreichen Injektion verwenden.

Zunächst führen wir eine in-vitro-Cap-RNA-Transkriptionsreaktion für Ihren Transkript-Strang der Wahl durch. In unserem Labor klonen wir üblicherweise das gewünschte A-C-D-N-A in einen PCs-two-plus-Vektor und führen eine in-vitro-Synthese-Reaktion zur Herstellung großer Mengen kapptierter RNA mit dem M-message-M-machine-SP-sechs-Kit durch. Anschließend reinigen wir die RNA-Probe mithilfe des RN-easy-mini-Kits oder durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Isopropanol-Fällung.

Bestimmen Sie sorgfältig die Konzentration der RNA-Präparation und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie am Tag der Injektion verwendet wird. Tauen Sie die RNA-Probe auf, wirbeln Sie sie vorsichtig um und zentrifugieren Sie sie kurz. Bereiten Sie nun eine Arbeitslösung mit steriler Wasser und einer Endkonzentration von 0,025 bis 0,05 % Phenolrot vor; Phenolrot dient als sichtbarer Marker für die Injektion der Lösung in den Embryo.

Hier bereiten wir eine Arbeitslösung von 100 Nanogramm pro Mikroliter EGFP-mRNA mit 0,05 % Phenolrot vor. Bewahren Sie die Arbeitsprobe schließlich auf Eis auf und stellen Sie die RNA-Grundlösung wieder bei minus 80 Grad Celsius zurück. Fahren Sie mit der Vorbereitung des Morphos fort, sobald Sie bereit sind, diese Probe zu injizieren.

Morpholino-Antisense-Oligonukleotide werden häufig verwendet, um die Genexpression zu modifizieren, indem sie die Translation eines gezielten Proteins blockieren oder die Vorläufer-mRNA-Spleißen beeinflussen. Morpholinos im Zebrafisch dienen als leistungsfähiges Werkzeug der umgekehrten Genetik, indem sie die Genfunktion herunterregulieren. Hier werden wir ein auf die Translationsstartstelle von pkd2 ausgerichtetes Morpholino-oligonukleotid mikroinjizieren. Üblicherweise verwenden wir 300 M eines Morpholino-Oligonukleotids, das speziell für ein Gen von Interesse konzipiert ist und von Gene Tools LLC bezogen wurde.

Anschließend geben wir 100 Mikroliter sterilem Wasser hinzu, um eine dreimolare Stammlösung herzustellen, portionieren die Lösung anschließend und lagern sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie am Tag der Injektion verwendet wird. Wir erhitzen die Morino-Lösung fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius. Danach kühlen wir die Lösung sofort auf Eis ab und zentrifugieren kurz. Dieser Schritt denaturiert sämtliche sekundären Strukturen im Oligo und stellt sicher, dass die Lösung vollständig gelöst ist.

Danach stellen wir eine Arbeitslösung her, indem wir die Morpho-Lösung in sterilem Wasser verdünnen und eine Endkonzentration von 0,025 bis 0,05 % Pinalrot erreichen. In dieser Demonstration werden wir eine Arbeitslösung von 0,5 Millimolar PKD zwei Morino mit 0,05 % Phenolrot herstellen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bei Raumtemperatur auf und füllen Sie die Mikropipette, sobald Sie bereit sind, diese Probe zu injizieren.

Zunächst müssen Mikropipetten für die Injektionen hergestellt werden. Dazu werden BOS-Silikat-Glaskapillaren in einer Mikropipettenziehvorrichtung erhitzt und auseinandergezogen. Nach dem Ziehen werden die Nadeln in einer Petrischale auf einer kleinen Menge Klebeton oder Klebeband aufbewahrt.

Danach bereiten wir Mikroinjektionskammerplatten vor, indem wir 1,5 % Agarose in eine XE-three-Medium-Platte gießen, die mit keilförmigen Rillen geformt ist. Dies dient als einfache Methode, um die Embryonen während der Injektion zu fixieren. Die Agar-Kammerplatten werden anschließend gerinnen lassen und bei vier Grad Celsius gelagert, bis sie verwendet werden.

Um mit dem Befüllen der Mikropipette zu beginnen, schneiden Sie die distale Spitze mit einer Pinzette oder einer chirurgischen Rasierklinge ab, um eine Öffnung zu erzeugen, die unter einem Stereomikroskop bei 50-facher Vergrößerung gerade noch sichtbar ist. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter Ihrer Arbeitslösung hinein.

Als Tropfen auf einen Deckgläser, befestigen Sie die Rückseite einer Mikropipette an einer Fünf-Milliliter-Spritze, die mit Schlauch an einer Kanüle befestigt ist, und tauchen Sie die distale Spitze der Mikropipette leicht in Ihren Tropfen der Arbeitslösung ein. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette nicht zu beschädigen. Saugen Sie die Arbeitslösung durch das distale Ende der Mikropipette, indem Sie den Kolben der Spritze ziehen.

Als Nächstes kalibrieren wir das Injektionsvolumen der Mikropipette. Geben Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerschlitten und schalten Sie die Strom- und Luftzufuhr zum Druckpuls-Mikroinjektorgerät ein. Befestigen Sie anschließend die Mikropipette am Mikropipettenhalter des Mikroinjektorgeräts.

Der Mikroinjektor ist druckgeregelt, und die Ausstöße werden durch Betätigen des Fußpedals unter dem Präparationsmikroskop ausgelöst. Prüfen Sie das Injektionsvolumen, indem Sie mit dem Mikroinjektor einen Tropfen Ihrer Arbeitslösung auf das Mikrometeröl bringen. Messen Sie den Durchmesser des Tropfens, während er als Kugel auf der Oberfläche des Öls schwimmt.

Passen Sie Dauer und Druck der Injektion an, um das Injektionsvolumen sorgfältig zu kalibrieren. Dieser Schritt trägt zur Reproduzierbarkeit des Mikroinjektionsexperiments bei. In dieser Demonstration erfolgen alle Mikroinjektionen mit einem Tropfendurchmesser von 0,15 Millimetern.

Schließlich, nachdem das Injektionsvolumen kalibriert wurde, verwenden Sie den Halteknopf am Mikroinjektor, um ein Rückfüllen und Austreten aus der Mikropipette zu verhindern. Nun ist es an der Zeit, die Zebrafischembryonen vorzubereiten. Zebrafische paaren sich zufällig in den ersten Stunden jedes Morgens; um mit der Vorbereitung zu beginnen, sammeln Sie die Embryonen im Ein-Zell-Stadium und bringen Sie in 1× E3-Medium.

Ordnen Sie die Embryonen mit einer dreimilliliter-Transferpipette entlang der keilförmigen Rillen in den Mikroinjektionskammernplatten an. Entfernen Sie das Medium, sodass die Embryonen flach untergetaucht und nicht überflutet sind. Dieser Schritt erleichtert das Absinken der Embryonen auf den Boden der Rillen sowie das Eindringen der Mikropipette durch die Chorionhülle.

Jetzt beginnen wir mit den Injektionen. Zunächst manipulieren wir die Embryonen mit der Mikropipette, sodass das Zytoplasma des Embryos im Ein-Zell-Stadium unter dem Stereomikroskop sichtbar ist. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette nicht zu beschädigen, durchdringen Sie mit der Mikropipette zuerst die Chorionhülle und dann das Eiweiß, um in den Embryo hinein zu injizieren.

In dieser Demonstration injizieren wir zunächst direkt in das Eiweiß unmittelbar unterhalb der Zelle und lassen den Wirkstoff durch zytoplasmatische Strömung und Diffusion in die Zelle gelangen. Dieser Fluss ist aufgrund des dem Wirkstoff zugesetzten Phenolrots sichtbar. Da es sich um einen Einzelzellembryo handelt, kann er freihand oder mit einem Manipulator injiziert werden.

Wir werden außerdem die direkte Injektion in das Zellzytoplasma demonstrieren. Die direkte Mikroinjektion in die Zelle ist zwar robuster, aber zeitaufwändiger, da eine korrekte Ausrichtung des Embryos und eine präzise Mikroinjektionstechnik erforderlich sind. Da die Zellmembran widerstandsfähiger ist als die Dottmembran, ist es oft schneller, die Mikropipette durch den Dott zu führen, um die Zelle zu erreichen.

Die Ausrichtung des Cytoplasmas mit der Animalpole nach unten in der Rille und das Arbeiten mit ruhigen Händen können bei dieser Injektionsmethode hilfreich sein. Nach der Mikroinjektion die Embryonen in eine Petrischale mit E3-Medium überführen und zur normalen Entwicklung bei 28,5 Grad Celsius inkubieren. Während der nächsten Stunden und Tage der Embryonalentwicklung die Embryonen auf die gewünschten Phänotypen hin beobachten.

Um den Erfolg der Mikroinjektion zu überprüfen, werden wir die Expression von GFP in den sich entwickelnden Embryonen ab dem Schild-Stadium mittels in-vivo-Gesamtembryo-Fluoreszenzmikroskopie überwachen. Die Expression des Konstrukts ist während der frühen Ereignisse der embryonalen Entwicklung am stärksten und nimmt häufig im Verlauf der Entwicklung ab, da die injizierte cappierte RNA allmählich abgebaut wird und die Stabilität des exprimierten Proteins abhängt. Basierend auf zuvor veröffentlichten Ergebnissen erwarten wir, dass das PKD2-Morpholino die dorsale Körperachsenkrümmung nachahmt, wie sie bei PKD2-Mutanten-Zebrafischen beobachtet wird, und dass sich etwa zwei bis drei Tage nach der Befruchtung Nierenzysten bilden.

Wir haben Ihnen soeben eine robuste Mikroinjektionstechnik gezeigt, mit der man mRNA-Überexpression und Gen-Knockdown-Studien mittels Morpholino-Oligonukleotiden bei Zebrafischen durchführen kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, mit einer ruhigen Hand zu injizieren. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.