Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Um die Lebensdauer bei C. elegans zu messen, wird eine alterssynchrone Population durch eine zeitlich begrenzte Eiablage reproduktiv erzeugt. Aktive erwachsene hermaphrodite Würmer werden auf Nematoden-Wachstumsmedium-Platten überführt, die mit UV-bestrahltem E. coli beimpft sind, und dürfen sechs bis acht Stunden lang Eier ablegen, danach werden sie entfernt. Innerhalb der nächsten zwei Tage schlüpfen die Würmer aus diesen Eiern und entwickeln sich bis zum L4-Larvenstadium. Die L4-Larven werden auf neue NGM-Platten überführt, die Ampicillin zur Verhinderung von lebenden Bakterienkontaminationen und FUDR zur Unterbindung der Fortpflanzung enthalten, und dürfen sich dort zu erwachsenen Tieren entwickeln.

Von diesem Zeitpunkt an werden die erwachsenen Würmer alle zwei bis drei Tage beobachtet, bis alle Würmer verstorben sind. Zu jedem Zeitpunkt werden tote Würmer von der Platte entfernt und die Anzahl der lebenden und toten Würmer erfasst. Ich bin George Seton aus dem Labor von Matt Capline am Fachbereich Pathologie der University of Washington.

Heute zeigen wir Ihnen, wie man die Lebensdauer misst und unsere Hepatitis-Eleganz beobachtet. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Genetik des Alterns zu untersuchen. Beginnen wir also.

Ein grundlegendes Lebensdauerexperiment erfordert zwei Arten von Platten: Standard-NGM-Platten, die keine Zusatzstoffe enthalten, und AMP-FUDR-Platten, denen sowohl Ampicillin als auch Fluoro-Desoxyuridin zum NGM hinzugefügt wurden. Beide Plattentypen werden mit e coli OP 50-Bakterien besiedelt, die anschließend durch Bestrahlung mit UV-Licht abgetötet werden. Beginnen Sie damit, 10 Milliliter NGM-Lösung herzustellen.

Für jede 60 Millimeter Petrischale das feste NGM durch Mikrowellenbestrahlung auf höchster Stufe in 32er-Pulsen vollständig schmelzen. Zwischen den Pulsen das Medium schwenken, um die Bildung von unter Druck stehenden Gasblasen zu verhindern. Flüssiges NGM in ein Wasserbad mit 55 Grad Celsius oder auf den Laborplatz stellen, um das Medium abkühlen zu lassen. Sobald das Medium auf 55 Grad Celsius abgekühlt ist, wobei man den Glasbehälter mit bloßen Händen noch bequem halten können sollte, ist es bereit zur Zugabe von Wirkstoffen.

Und um die Platten mit Wirkstoffen zu gießen, 33 µL 150 mM FUDR und 100 µL 100 mg/mL Ampicillin pro 100 mL NGM hinzufügen und vorsichtig wirbeln, um das Ampicillin zu vermischen. Ampicillin dient dazu, eine Kontamination durch fremde Bakterien zu verhindern, und FUDR verhindert das Schlüpfen der Eier. Auf diese Weise müssen die Würmer nicht alle paar Tage umgesetzt werden, um sie von wachsenden Larven zu trennen.

Geben Sie nun das Medium dazu und lassen Sie die Platten zwei Tage lang bei Raumtemperatur trocknen. Am Tag vor Abschluss des Trocknungsprozesses der Platten bereiten Sie eine flüssige LB-Kultur mit einer Einzelkolonie von einem frischen Strich von E. coli OP50-Bakterien auf LB-Agar vor. Bereiten Sie pro 60-Millimeter-Platte mindestens 0,5 Milliliter Kultur vor.

Stellen Sie die OP 50-Kultur in einen Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius und lassen Sie die Bakterien über Nacht wachsen. Pelletieren Sie die OP 50-Bakterien am nächsten Tag durch Zentrifugation mit 3.500 × g für 10 Minuten. Dekantieren Sie so viel Überstand, dass die Bakterien in einer 10-fachen Konzentration resuspendiert werden können.

Inokulieren Sie nun jede Platte mit 100 Mikrolitern der konzentrierten Kultur. Vermeiden Sie es, die Pipettenspitze mit der Oberfläche des NGM in Berührung zu bringen, da Unebenheiten an der Medienoberfläche es den Würmern ermöglichen, sich einzubuddeln. Wirbeln Sie die Platten, bis die Bakterien den zentralen Bereich des NGM bedecken, ohne in die Nähe der Plattenwände zu gelangen, und lassen Sie die Platten 24 Stunden lang auf dem Laborpult trocknen. Sobald sie trocken sind, setzen Sie die Oberfläche der Platten einer UV-Dosis aus, die ausreicht, um das bakterielle Wachstum zu stoppen; wir verwenden einen Strata-Gene-UV-Straddle-Linker 2,400.

Beginnen Sie damit, die Platten ohne Deckel in den Straddle-Linker einzulegen. Drücken Sie nun auf Energie. Geben Sie auf dem Ziffernfeld 9 9 9 9 ein und drücken Sie Start.

Die Platten werden etwa fünf Minuten lang UV-Licht ausgesetzt. Platten mit durch UV-Licht abgetöteten Bakterien können bis zu einem Monat lang verkehrt herum bei vier Grad Celsius gelagert werden. Dieser Abschnitt beschreibt, wie man eine Population von Würmern mit einem gemeinsamen Schlupfdatum erzeugt.

Überführen Sie zunächst etwa 20 junge adulte Würmer auf eine frische NGM-Platte ohne Wirkstoffe. Belassen Sie die Platte etwa eine Woche lang bei 25 Grad Celsius, damit sich die Würmer vermehren und innerhalb einer Woche die gesamte bakterielle Nahrung verbrauchen können. Neu geschlüpfte Würmer im wachstumsgestoppten Dauerstadium sollten erscheinen; überführen Sie 20 bis 30 Dauerlarven auf eine frische NGM-Platte ohne Wirkstoffe und inkubieren Sie sie bei 25 Grad Celsius in Gegenwart von Nahrung.

Die Dauerlarven werden innerhalb von zwei Tagen zu reproduktionsaktiven Erwachsenen und bleiben danach noch einige Tage reproduktionsfähig. Übertragen Sie nun 10 bis 15 reproduktionsaktive erwachsene Tiere auf eine frische NGM-Platte ohne Wirkstoffe. Diese Platte wird als zeitgesteuerte Eiablage- oder TEL-Platte bezeichnet.

Lassen Sie die TEL-Platte bei 25 Grad Celsius, damit die Würmer Eier legen können. Die aus diesen Eiern schlüpfenden Tiere werden die Versuchstiere sein, und ihre Lebensdauer wird nach sechs Stunden erfasst. Untersuchen Sie die TEL-Platte auf Eier.

Falls noch nicht genügend Eier vorhanden sind, belassen Sie die TEL-Platte bis zu insgesamt 24 Stunden bei 25 Grad Celsius und überprüfen Sie sie regelmäßig auf Eier. Sobald eine ausreichende Anzahl an Eiern abgelegt wurde, entfernen Sie die erwachsenen Tiere von der TEL-Platte.

Ein typisches Lebensdauer-Experiment erfordert 30 bis 90 Eier pro Versuchsgruppe, aber mehrere hundert Eier können auf einer einzigen TEL-Platte erzeugt werden. Etwa 150 Eier werden von 10 bis 15 reproduktiv aktiven erwachsenen Tieren innerhalb von sechs bis acht Stunden abgelegt. Beim Vergleich von Versuchsgruppen kann statistische Signifikanz für große Unterschiede in der Lebensdauer bereits mit nur 30 Tieren erreicht werden.

Es sollten mehr Tiere verwendet werden, um geringfügigere Unterschiede zu erkennen. Stellen Sie nun die TEL-Platte ohne erwachsene Tiere bei 20 Grad Celsius, bis die Eier geschlüpft sind und die Würmer das L4-Larvenstadium erreicht haben. Dies dauert normalerweise zwei Tage für den Wildtyp C. elegans, kann jedoch bei Stämmen mit langsamen Entwicklungsphänotypen länger dauern.

In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie das Leben einer alterssynchronisierten Population verfolgt werden kann. Überführen Sie zunächst die L4-Larven von der TEL-Platte auf sitzende AMP-FUDR-Platten. Für jeden Stamm oder jede Bedingung, die getestet wird, ist es üblich, zwei bis drei Platten mit 25 bis 30 Würmern pro Platte vorzubereiten.

Inkubieren Sie die AMP FUDR-Platten bei 20 Grad Celsius für 24 Stunden. Danach bewerten Sie visuell die Würmer, das Medium und den Bakterienrasen, und transferieren die Würmer auf frische AMP FUDR-Platten. Wenn die Würmer den größten Teil der bakteriellen Nahrung aufgenommen haben, erfolgt dies typischerweise ein- bis zweimal pro Woche.

Zu Beginn des Experiments deutet eine beträchtliche Anzahl an Larven normalerweise darauf hin, dass die Würmer nicht als L4-Stadien, sondern als junge Erwachsene auf die AMP-FUDR-Platten übertragen wurden. Junge erwachsene Würmer können Eier legen, bevor FUDR wirksam wird, und gelegentlich entgehen Larven den Wirkungen von FUDR und entwickeln sich zu erwachsenen Tieren. Diese Larven verfälschen in diesem Fall das Experiment; übertragen Sie die erwachsenen Würmer auf frische Platten und entsorgen Sie die alten Platten, die die Larven enthalten.

Die Würmer sollten ebenfalls auf frische Platten übertragen werden, wenn lebende, wachsende Bakterien beobachtet werden. Im Allgemeinen stellt die Kombination aus AMP und UV-Bestrahlung sicher, dass keine lebenden Bakterien das Experiment verunreinigen, gelegentlich tritt dies jedoch auf. Übertragen Sie außerdem die Würmer.

Wenn ein Pilzwachstum auf dem Medium beobachtet wird. Falls früh genug erkannt, kann der Pilz mit einer Pipettenspitze oder Spatel entfernt werden. Sobald er größer als einige Millimeter im Durchmesser geworden ist, ist es gewöhnlich einfacher, die Würmer auf eine neue Platte zu übertragen.

Bewerten Sie alle Würmer alle zwei bis drei Tage hinsichtlich ihrer Lebensdauer. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um zu bestimmen, ob sich jeder Wurm noch am Leben befindet oder tot ist.

Tippen Sie vorsichtig auf die Platte. Der Wurm ist lebendig, wenn er als Reaktion auf das Anklopfen eine Bewegung zeigt. Wenn der Wurm nicht auf das Anklopfen der Platte reagiert, betrachten Sie den Kopfbereich vergrößert und tippen Sie vorsichtig mit einem Platindraht auf den Kopf des Wurms.

Bewerten Sie den Wurm als tot. Wenn er nicht durch Bewegung seines Kopfes reagiert, entfernen Sie den toten Wurm von der Platte. Nachdem Sie alle Würmer überprüft haben, notieren Sie das Datum sowie die Anzahl der lebenden und toten Würmer.

Würmer, die auf festem Medium gehalten werden, verlassen gelegentlich die Plattenoberfläche, indem sie graben oder an der Wand hinaufkriechen. Würmer, die entkommen, werden vollständig von der Studie ausgeschlossen. Gehen Sie wie folgt vor: Geben Sie die Platten nach Beendigung in den Inkubator bei 20 Grad Celsius zurück.

Warten Sie weitere zwei bis drei Tage und überprüfen Sie die Platten erneut. Setzen Sie dieses Vorgehen fort, bis alle Würmer verstorben sind. Die Anzahl der an jedem Tag verendeten Würmer wird üblicherweise invertiert, um den Anteil der an jedem Tag lebenden Würmer zu berechnen; diese Daten werden grafisch als Überlebenskurve dargestellt, wobei der Tag der zeitlich gesteuerten Eiablage berücksichtigt wird.

Tag null. Die typische mittlere Lebensdauer von N. two. Die Wildtyp-Stamm der Sea elgan, der auf UV-getöteten Bakterien bei 20 Grad Celsius gehalten wird, beträgt ausgehend vom Ei etwa 25 Tage.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man die Lebensdauer misst und Eleganz beobachtet. Sie können dieses grundlegende Verfahren anpassen, um eine Vielzahl von Umweltbedingungen zu testen, einschließlich diätetischer Einschränkung und RNA-Interferenz, die im begleitenden Text erläutert werden. Damit ist alles gesagt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg mit Ihrem Experiment.