Zebrafisch Gehirn Ventrikel Injection

Dieses Verfahren beginnt mit der Stadieneinteilung von Zebrafischembryonen. Wenn die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, entfernen Sie sie aus der Corion. Anschließend werden mit einer Pipettenspitze Löcher in eine aros-beschichtete Schale gestochen, um die Embryonen darin zu positionieren, und die Embryonen werden vorsichtig mit dem Schwanz nach unten in die Löcher eingesetzt.

Nachdem die Embryonen montiert wurden, wird ein fluoreszierender Farbstoff vorsichtig durch das Hinterhirn in den Ventrikelraum des Embryos injiziert. Nach der Ventrikelinjektion werden die Embryonen abgebildet und die Daten mithilfe von Photoshop verarbeitet. Hallo, ich bin Jennifer Gutman aus dem Labor von Dr. Hazel Sieve am Whitehead Institute for Biomedical Research am MIT in Cambridge, Massachusetts.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Injektion in die Gehirnventrikel von Zebrafischen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die Bildung der Gehirnventrikel und die morphogenetische Entwicklung des neuroepithelialen Gewebes in lebenden Zebrafischen zu untersuchen. Aufgrund der Transparenz der Zebrafischembryonen kann die Charakterisierung der Form der Gehirnventrikel schwierig sein.

Diese Technik ist eine nützliche und einfache Methode, um den flüssigkeitsgefüllten Raum von dem umgebenden Gewebe zu unterscheiden und um mutierte Embryonen zu charakterisieren, die möglicherweise Defekte in der Bildung der Gehirnventrikel aufweisen. Beginnen wir also. Um die Injektion in den Gehirnventrikel von Zebrafischen vorzubereiten, stellen wir zunächst die Injektionsnadeln her.

Ein Nadelpolarisator des Instruments von Sutter wird verwendet, um die Kapillarnadeln zu ziehen. Die Kapillarnadel wird anschließend mit einem fluoreszierenden Farbstoff, wie beispielsweise Texas-Red-Dextrin, gefüllt. Danach wird die gefüllte Nadel in einem Mikromanipulator der Mikroinjektionsapparatur befestigt.

Schneiden Sie die Nadel in einem Winkel auf die geeignete Größe zu. Um eine abgeschrägte Spitze herzustellen, messen Sie die Tropfengröße der Nadel und prüfen Sie, ob sie zwischen ein und zwei Nanolitern pro Injektion in Öl liegt. Um diese Verfahrensstufe zu beginnen, sollten die Embryonen gemäß Kimmel 30 Minuten früher als der interessierende Entwicklungsstadium injiziert werden.

Beispielsweise, um die Ventrikel 24 Stunden nach der Befruchtung zu untersuchen, injizieren Sie die Embryonen 23,5 Stunden nach der Befruchtung. Der Embryo im interessierenden Entwicklungsstadium wird unter das Stereomikroskop gelegt, und die Chorionhülle wird vorsichtig mit einer Pinzette vom Embryo entfernt. Anschließend wird eine aros-Schale für die Embryonen mithilfe einer Plastikschale hergestellt, die mit 1 % aros beschichtet ist; bohren Sie mit einer Plastikpipettenspitze für 1–200 µL Löcher in die aros-Schicht.

Entfernen Sie die Aros-Stopfen vorsichtig mit einer Pinzette aus den Löchern. Überführen Sie das Embryo und das Embryomedium in die Aros-Schale mit Löchern. Geben Sie Trica zum Medium hinzu, um das Embryo zu betäuben und Bewegungen zu verhindern.

Während des Experiments legen Sie den Embryo vorsichtig mit dem Schwanz nach unten in die Öffnung und richten ihn so aus, dass die Injektionsvorrichtung an der dorsalen Seite des Embryos liegt. Da der Embryo nun korrekt in der Petrischale positioniert und ausgerichtet ist, können wir mit der Injektion in die Gehirnventrikel beginnen. Richten Sie zunächst die Mikromanipulationsanlage so ein, dass die Nadelspitze im gleichen Sichtfeld wie der Embryo bei hoher Vergrößerung liegt.

Führen Sie die Nadel vorsichtig durch das dünne Dachplättchen des Hinterhirns unmittelbar hinter dem Scharnierpunkt R null R eins, ohne das darunterliegende Hirngewebe zu verletzen, und injizieren Sie gerade so viel Farbstoff, dass die Ventrikel vollständig gefüllt werden. Je nach Entwicklungsstadium des Embryos können mehrere Injektionen erforderlich sein, um den Ventrikelfortsatz vollständig zu füllen. Sobald der Embryo injiziert wurde und zur Bildgebung bereitsteht, wird eine neue aros-Schale für den Embryo vorbereitet.

Unter Verwendung einer sauberen mit 1 % Aros beschichteten Petrischale, stiche Löcher in die Schale und entferne die Stopfen. Überführe das Embryo in die Schale und gebe Trica zu, um das Embryo zu betäuben und Bewegungen zu verhindern. Platziere den Schwanz des injizierten Embryos in die Öffnung, sodass ein dorsales Bild entsteht.

Das Embryo ist nun bereit für die Bildaufnahme. Nehmen Sie ein Bild mit durchgehendem Licht auf. Es ist äußerst wichtig, das Embryo oder das Mikroskop nicht zu bewegen.

Als Nächstes ändern Sie die Einstellungen am Mikroskop und nehmen ein Bild mit Fluoreszenzlicht auf. Positionieren Sie das Embryo neu, um seitliche Aufnahmen sowohl mit Durchlicht als auch mit Fluoreszenzlicht anzufertigen. Speichern Sie alle Bilder als Dateien zur Bildverarbeitung in Photoshop.

Um die Bilder in Photoshop zu bearbeiten, öffnen Sie die Transmissionslicht- und Fluoreszenzbilder desselben Embryos, die in derselben Position aufgenommen wurden. Stellen Sie sicher, dass alle Einstellungen identisch sind. Ziehen Sie für jedes Bild das Fluoreszenzbild auf das Transmissionslichtbild und richten Sie beide exakt aus, wobei das Fluoreszenzbild ausgewählt sein muss. Wählen Sie Bildanpassungen und anschließend Farbe ersetzen aus, und ändern Sie den schwarzen Hintergrund in weiß.

Passen Sie im Fenster „Farbe ersetzen“ den Unscharfheitsfaktor nach rechts an, bis das fluoreszierende Bild farblich einheitlich erscheint. Wählen Sie im Fenster „Ebenen“ die Option „Multiplizieren“. Um die überlagerten Bilder anzusehen, sollte Ihr Bild des Ventrikulärraums exakt mit dem Transmissionslichtbild übereinstimmen.

Speichern Sie diese Datei und wiederholen Sie den Vorgang für alle weiteren Bilder. Wenn die Ventrikelinjektion korrekt durchgeführt wurde, sollten die Bilder scharfe Ränder aufweisen und die Farbstoffverteilung nicht diffus sein, wie hier in diesen Aufnahmen von 25 Stunden nach der Befruchtung gezeigt. Die Aufnahmen von Wildtyp-Embryonen zeigen in Panel A das Hellfeldbild, in Panel B das Fluoreszenzbild und in Panel C das Überlagerungsbild.

Die Seitenansicht des Überlagerungsbildes ist in Panel D dargestellt. Wenn andererseits während der Ventrikelinjektion die Nadel zu tief eingeführt wird, dringt sie in das Gehirngewebe unterhalb des Ventrikels ein und führt zu einer fehlerhaften Injektion. Dies hat zur Folge, dass Farbstoff außerhalb des Ventrikels und im Dottersack sichtbar ist, wie hier gezeigt. Panel E zeigt das Helligkeitsfeldbild.

Panel F zeigt das fluoreszierende Bild und Panel G das überlagerte Bild. Eine Seitenansicht des überlagerten Bildes ist in Panel H dargestellt. Die Pfeile zeigen Bereiche an, in denen der Farbstoff über den Ventrikelflußraum des Gehirns hinausgedrungen ist. In diesem Video haben wir demonstriert, wie man fluoreszierenden Farbstoff in die sich entwickelnden Ventrikel des Zebrafischgehirns injiziert.

Diese Methode dient dazu, den Ventrikulärraum des Gehirns im Kontrast zum umgebenden neuroepithelialen Gewebe sichtbar zu machen, und ist äußerst nützlich zur Bestimmung der Form des Ventrikulärraums sowie der Gestalt des umliegenden Hirngewebes. Mithilfe dieser Technik können wir den Vorgang der Ventrikelausbildung und die Gehirnmorphogenese im lebenden Embryo über die Zeit besser verstehen. Sie stellt ein hervorragendes Werkzeug zur Untersuchung von Fehlbildungen der Gehirnventrikel und zur ersten Charakterisierung von Mutanten mit Störungen der Gehirnmorphogenese dar.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.