Mikroinjektion Techniken zur Untersuchung Mitose in der Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Dieses Verfahren beginnt mit der Sammlung von Embryonen auf frischen Traubensaftplatten über einen Zeitraum von 30 bis 60 Minuten. Nachdem die Platte aus dem Brutschrank entnommen wurde, heben Sie die Embryonen mit einem angefeuchteten Pinsel auf und legen sie auf doppelseitiges Klebeband. Rollen Sie vorsichtig einen Embryo mit einer Hälfte einer Pinzette über das Band, bis das Chorion aufbricht.

Nehmen Sie das Embryo auf und legen Sie es vorsichtig auf die Deckglasoberfläche. Überziehen Sie es mit einer Schicht HET-Kleber. Wiederholen Sie dies, bis Sie genügend Embryonen haben.

Nach der Dehydrierung sind die Embryonen bereit für die Injektion. Hallo, ich bin Ingrid Bruce Musher aus dem Labor von Dr. Jonathan Sculley in der Abteilung für Molekulare und Zelluläre Biologie an der University of California Davis. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Mikroinjektion von Drosophila-Syncytial-Embryonen.

Wir verwenden dieses Verfahren, um die Rolle von Mikrotubuli und mitotischen Motoren in der Mitose zu untersuchen. Beispielsweise injizieren wir Antikörper oder andere Inhibitoren spezifischer mitotischer Proteine. Durch die Analyse der Wirkung des Inhibitors auf die Mitose können wir die Funktion des Zielproteins bestimmen.

Beginnen wir also. Um die Vorbereitungen zwei bis drei Tage vor dem Experiment zu starten, richten Sie den Legkäfig ein, indem Sie zwei kleine Löcher von etwa einem Quadratzentimeter auf gegenüberliegenden Seiten einer Plastikflasche ausschneiden. Stopfen Sie die Löcher mit Watte, damit Luft zirkulieren kann.

Bringen Sie die Fliegen durch Antippen in die Flasche und bedecken Sie diese anschließend mit einer Traubensaftplatte. Mit Hefe versorgt, werden die Fliegen im Bein-Käfig bei Raumtemperatur bis zu 10 Tage lang Eier legen; dies mindestens einen Tag vor dem Experiment. Ziehen Sie die Nadeln für die Injektion und bewahren Sie sie bei vier Grad Celsius auf.

Am Tag des Experiments bereiten Sie die Kapillaren vor und füllen Sie. Nehmen Sie zunächst das markierte Tubulin aus dem Gefrierschrank und stellen Sie es für fünf bis 15 Minuten auf Eis. Verdünnen Sie es anschließend mit GPEM-Puffer und zentrifugieren Sie es dann 10 bis 15 Minuten bei 13.000 U/min und vier Grad Celsius.

Laden Sie abschließend ein bis zwei Mikroliter in die Nadel und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, um eine temperaturinduzierte Polymerisation in der Nadel zu verhindern. Vor dem Aufsetzen des Deckgläschens stellen Sie Heptan-Kleber her, indem Sie doppelseitiges Klebeband aufrollen und in eine 100-Milliliter-Flasche geben.

Geben Sie etwa 50 Milliliter Heptan hinzu, verschließen Sie die Flasche und schütteln Sie sie mehrere Tage lang. Bevor Sie die Embryonen präparieren, stellen Sie eine Trocknungskammer her, in die die Embryonen vor der Injektion gegeben werden. Legen Sie dazu einen Teil einer 35-Millimeter-Schale in eine 100-Millimeter-Petri-Schale, um einen Tisch zu bilden, und geben Sie rechts Trockenmittel hinzu, und zwar anhydres Calciumsulfat, sodass die Höhe des Trockenmittels nicht höher als die des Tischs ist, und decken Sie ab.

Um mit der Vorbereitung der Embryonen zu beginnen, sammeln Sie diese zunächst aus dem See-Käfig, indem Sie die Traubensaftplatte stündlich mit Hefe wechseln; die Embryonen sollten etwa zwei Stunden nach Beginn der Sammlung abgebildet werden. Um den Deckglaser vorzubereiten, legen Sie ihn auf eine Seite eines Mikroskops, befestigen die vier Ecken mit Klebeband, sodass er nicht verrutscht. Tragen Sie mit einem mit Watte versehenen Applikator eine Schicht Heptan-Kleber in einer Linie auf den Deckglaser auf.

Der Kleber sollte nicht viskos sein und innerhalb weniger Sekunden trocknen. Falls er zu dickflüssig ist, geben Sie mehr Heptan hinzu. Bringen Sie abschließend ein Stück doppelseitiges Klebeband neben die Deckglasstelle auf den Objektträger an.

Rutschen Sie mit einem angefeuchteten Pinsel. Heben Sie die Embryonen vorsichtig von der Traubensaftplatte auf und platzieren Sie sie auf dem doppelten Klebeband auf dem Objektträger. Verwenden Sie anschließend eine Hälfte einer Pinzette, um die Embryonen über das doppelte Klebeband zu rollen, bis das Chorion aufbricht.

Nehmen Sie das Embryo vorsichtig auf, indem Sie es über die Corian-Oberfläche rollen, sodass es an der Pinzette haftet, und legen Sie es auf den Heptan-Kleber auf dem Deckglas. Achten Sie darauf, dass die lange Seite des Embryos parallel zur langen Seite des Deckglases liegt. Platzieren Sie 10 bis 20 Embryonen in einer Reihe.

Entfernen Sie die Deckglas und legen Sie es für drei bis acht Minuten in die Dehydratisierungskammer. Die Dauer hängt von der lokalen Luftfeuchtigkeit und der Menge ab, die injiziert werden soll. Anschließend legen Sie das Deckglas auf eine Metallkammer mit Vakuumfett.

Decken Sie die Embryonen abschließend mit Halocarbon-Öl ab, um weitere Austrocknung zu vermeiden. Die Embryonen sind nun bereit für die Injektion. Suchen Sie zunächst die Embryonen unter einem 16x-Objektiv.

Bewegen Sie die Embryonen beiseite und suchen Sie die Nadel, ohne die Fokusebene zu verändern. Zentrieren Sie die Nadel und bewegen Sie sie nach oben, ohne sie in X- oder Y-Richtung zu verschieben. Um die Nadel zu öffnen, bringen Sie die Kante der Deckglasplatte ins Sichtfeld, jedoch nicht an die Stelle, an der sich die Nadel befindet.

Senken Sie die Nadel auf dieselbe Fokusebene ab. Bewegen Sie die Deckglas vorsichtig, bis es die Nadel berührt und diese sanft öffnet. Bewegen Sie die Nadel nach oben.

Bringen Sie nun die Embryonen in den Sichtbereich. Senken Sie die Nadel in das Öl ab, um sicherzustellen, dass sich saubere Flüssigkeitstropfen an der Nadel bilden. Bewegen Sie den Embryo kontrolliert in Richtung der Nadel, injizieren Sie einen Tropfen in den Embryo und ziehen Sie diesen anschließend wieder zurück.

Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, können sie mit einem 60- oder 100-fachen Objektiv am konfokalen Mikroskop beobachtet werden. Ein Kontrollembryo sollte wie der in diesem Film gezeigte aussehen. Dies ist ein Embryo, der GFP-Tubulin und RFP-Histon exprimiert und mit einem 100-fachen Objektiv an einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop aufgenommen wurde.

Die angezeigte Gesamtzeit beträgt acht Minuten. Diagramme des Abstands von Pol zu Pol sind sehr reproduzierbar und stellen ein zuverlässiges Maß für den Erfolg in Kontrollembryonen dar. Sie sollten wie die hier für die Zyklen 11 bis 13 gezeigten aussehen.

In diesem Film ist ein weiteres Kontrollembryo zu sehen. Dieser exprimiert KLP61F-GFP und wurde mit rhodaminmarkiertem Tubulin injiziert. Die Aufnahme erfolgte ebenfalls mit einem 100x-Objektiv an einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop, und die Gesamtaufnahmezeit beträgt sieben Minuten.

Dieses Video wurde unmittelbar nach der Mikroinjektion aufgenommen, und der Konzentrationsgradient von rDomine-Tubulin ist zu Beginn des Videos deutlich sichtbar. Diese Embryonen können verwendet werden, um die Hemmung von Klp61F nach Mikroinjektion von Klp61F-Antikörpern zu untersuchen. Man kann den Verlust von Klp61F-GFP von den Spindeln beobachten.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Einschnitt-Embryonen von Drosophila mikroinjiziert. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, Kontrollen durchzuführen, zunächst das Injizieren von Puffer oder Rutin allein zu üben und sicherzustellen, dass die Mitose normal durch die zelluläre Phase verläuft. Sobald alle Ihre Injektionen zuverlässig sind und keine Schäden verursachen, können Sie einen Inhibitor injizieren und die Wirkung dieser spezifischen Hemmung untersuchen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.