Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

Hallo, ich bin Hillary Kemp aus dem Labor von Cecilia Owens. Und ich bin Cecilia Owens. Hillary und ich arbeiten in der Abteilung für Grundlagenforschung am Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle.

Heute werden wir Ihnen eine Technik zur Herstellung von chimären Zebrafischembryonen zeigen, die auch als genetische Mosaiken bekannt sind. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die zelluläre Grundlage der Genfunktion während der Entwicklung zu untersuchen. Wir können prüfen, ob ein bestimmtes Gen innerhalb der Zellen mit einem mutanten Phänotyp funktioniert – dies wird als zellautonome Funktion bezeichnet – oder ob es in der Umgebung dieser Zellen wirkt – dies wird als zellnichtautonome Funktion bezeichnet.

Wir erstellen diese Mosaiken, indem wir Zellen zwischen Wildtyp- und Mutanten-Embryonen entweder im Blastula- oder im frühen Gastrula-Stadium transplantieren. Anschließend bewerten wir die Genfunktion, indem wir das Phänotyp und Genotyp der spendenderbten Zellen in ihrer Wirtsumgebung beobachten. Beginnen wir also.

In diesem Teil des Protokolls wird ein Linienfarbstoff in das Spenderembryo injiziert, sodass die Schicksale von Spenderzellen nach der Transplantation verfolgt werden können. Mithilfe dieser Technik können auch verschiedene Nukleinsäuren injiziert werden. Wenn jedoch DNA injiziert wird, entfällt der Dekorationsschritt. Bevor mit den Embryonen gearbeitet wird, bereiten Sie eine Injektionsschale vor, indem Sie einen Objektträger in einem Winkel von 45 Grad über den breitesten Teil einer Petrischale einsetzen. Die Schale ist zu drei Vierteln mit 1,2 % Aros in Pen-Strep-Embryomedium gefüllt.

Entfernen Sie die Folie, nachdem sich der Agarosestöpsel gebildet hat, um eine abgeschrägte Rinne zu erzeugen. Füllen Sie die Rinne mit Pen-Strep-Embryomedium. Fahren Sie nun mit der enzymatischen Behandlung von Ein-Zell-Stadium-Embryonen fort.

Die Embryonen im Ein-Zell-Stadium für eine bis fünf Minuten in einer 0,5 Milligramm pro Milliliter Pronase-Lösung inkubieren. Die Entfärbung sorgfältig überwachen.

Sobald das Chorion sichtbar einzufallen beginnt, tauchen Sie die Embryonen in Systemwasser ein, und gießen Sie dabei das gesamte Chorion ab, sodass die Embryonen am unteren Ende der Schnabelkurve zurückbleiben. Es ist sehr wichtig, dass die Embryonen die Wasseroberfläche nicht noch einmal berühren, und die meisten von ihnen haben bereits ihr Chorion verloren. Einige schwirren noch außen herum und haben es nicht abgestreift.

Falls sich etwas noch in seiner Korion befindet, wird durch das Pipettieren auf diese Weise das Eindringen in die Korion verhindert und die Embryonen werden freigesetzt, sodass sie niemals die Wasseroberfläche berühren. Es ist wichtig, beschichtete Embryonen mit einer pipette zu handhaben, deren Ränder durch Anflammen geglättet wurden. Überführen Sie die empfindlichen, entcopten Embryonen vorsichtig mithilfe einer weiträumigen, durch Anflammen geglätteten Glaspipette in die Nut der Injektionsschale.

Dann laden wir eine einzelne Datei in diese Rinne. Nun sind die Embryonen bereit, mit einem genau kalibrierten, feuergezogenen Glasinjektionspipett und einer Druckinjektionsvorrichtung mit einem Linienmarkierungsfarbstoff injiziert zu werden. Wir verwenden eine Schale mit Embryonenmedium, um die Nadel zu brechen, und eine Schale mit Öl, um die Nadel zu kalibrieren.

Dies ist einfach ein handelsübliches Labor-Mineralöl. Wir nehmen ein Paar geschärfte Uhrmacherpinzetten und platzieren die Pinzetten unter Beobachtung durch die Okulare, um die geeignete Größe zu bestimmen, auf beiden Seiten der Nadel an, um dann vorsichtig das Späne abzubrechen, was ich ohne Blick durch das Okular nicht tatsächlich durchführen kann, um das Volumen des injizierten Farbstoffs oder der Ribonukleotide zu bestimmen. Vor Beginn.

Messen Sie die Bolusgröße in einer Schale mit Mineralöl. Die Nadel sollte so abgebrochen werden, dass ein Bolus von einem Nanoliter mit einem oder zwei Impulsen des Mikroinjektors abgegeben wird. Das Volumen des Bolus kann aus dem Durchmesser berechnet werden, der mit einem Okularmikrometer gemessen wird.

Injizieren Sie ein Nanoliter einer ein- bis 3%igen Lösung von fluoreszierendem Dextran direkt in das Eiweiß beschichteter Embryonen zwischen dem Ein- und Vierzellstadium. Ich werde den Embryo direkt unter die Nadel positionieren. Ich werde die Nadel vorsichtig in die Mitte des Dotters stechen und das Fußpedal betätigen.

Nach dem Injizieren ist es wichtig, in die Eigelbströme zu injizieren, damit der Farbstoff in die Zellen transportiert wird. Diese Injektion reicht aus, um die Zellen in chimären Embryonen über mehrere Entwicklungstage hinweg zu verfolgen. Idealweise erfolgt dies, bevor die Zellen das Vierzellenstadium erreichen. Kultivieren Sie die injizierten Embryonen bei geringer Dichte in einer beschichteten Petrischale, die mit frischem Pen-Strep-Embryonenmedium gefüllt ist.

Beachten Sie, dass injizierte Embryonen tendenziell eine leicht verlangsamte Entwicklung aufweisen; inkubieren Sie die Embryonen bei unterschiedlichen Temperaturen – 25, 28 und 31 Grad Celsius –, um ihre Entwicklung zeitlich zu versetzen und das Zeitfenster, in dem Transplantationen durchgeführt werden können, zu maximieren. Die Vorrichtung zur Zelltransplantation in der Zebrafisch-Blastula besteht aus einer angetriebenen Hamilton-Spritze, die über einen Dreiweghahn mit einem Reservoir für Mineralsöl und über ein Stück flexibles Schlauchmaterial mit einem Mikropipettenhalter verbunden ist. Entfernen Sie sämtliche Luftblasen aus dem System, da diese Ihre Fähigkeit, Saugkraft und Druck zu kontrollieren, beeinträchtigen würden.

Verwenden Sie ein Stereomikroskop mit hochwertiger Optik mit mindestens einer DX-Vergrößerung. Zur Steuerung der Positionierung des Mikropipettenhalters und der Nadel empfehlen wir einen manuellen Mikromanipulator des Typs NARA shige. Stellen Sie sicher, dass dieser mit einer Magnetbasis am Tisch befestigt ist, um die Übertragung von Vibrationen auf die Transplantation zu verhindern.

Nadeltransplantationsnadeln werden aus Glas-Kapillarpipetten hergestellt, die an einer Elektrodenziehvorrichtung sanft zugespitzt werden. Weitere Einzelheiten zum Ziehen von Pipetten unter einem Stereomikroskop finden Sie im JoVE-Protokoll aus dem Labor von Miriam Goodman; brechen Sie die Spitze der gezogenen Nadel ab. Für Transplantationen im Blastulastadium sollte der Außendurchmesser der Nadel etwa 50 bis 60 Mikrometer betragen, bzw. 30 bis 40 Mikrometer für eine Transplantation im Gastrulationsstadium.

Für eine Magenstadien-Übertragung zur Verbesserung der Penetration muss zunächst mit einem Mikroschweißgerät ein scharfer Widerhaken an der Nadelspitze angebracht werden, indem die Nadelspitze nahe an den Faden des Mikroschweißgeräts herangeführt wird, um die Spitze zu glätten. Drehen Sie dann die Nadel, sodass die Vorderkante der Abschrägung mit dem Faden des Mikroschweißgeräts in Kontakt kommt. Sobald die Vorderkante der Nadel den Faden berührt, ziehen Sie sie schnell zurück, um einen Widerhaken zu erzeugen.

Um die Zellen nicht zu beschädigen, sollte der Haken gerade sein und die Nadelspitze darf nicht gebogen sein. Wenn das Mikromanipulationsgerät und die Transplantationsnadeln vorbereitet sind, können Sie chimäre Embryonen herstellen. Bei Blastulatransplantationen werden Zellen zwischen Embryonen verpflanzt, wenn keine detaillierten Fate-Map-Informationen erforderlich sind. Mit Ausnahme der primordialen Keimzellen sind die meisten Zellen zu diesem Zeitpunkt im Allgemeinen noch nicht in ihrer Entwicklungsfähigkeit festgelegt.

Die Fate-Map der Blastula ist so beschaffen, dass wir zwischen Zellen unterscheiden können, die sich zum Ektoderm entwickeln werden, und Zellen, die sich zum Mesoderm entwickeln werden. Das mesodermale und endodermale Gewebe liegt nahe dem Rand des Embryos im Blastulastadium, während die dermalen Vorläuferzellen, die sich zum Nervensystem und zur Oberflächendermis entwickeln werden, weiter vom Rand des Embryos entfernt liegen. Wenn wir daher Zellen in Embryonen im Blastulastadium transplantieren, können wir diese gezielt in das presumptive Mesoderm oder das presumptive Ektoderm einbringen.

Doch wir können Zellen nicht gezielt in einen bestimmten Bereich des Ektoderms oder des Mesoderms lenken, da wir dies nicht wissen. Bereiten Sie Injektionsschalen im Voraus vor, indem Sie eine Kunststoffform mit gepaarten Reihen keilförmiger Vorsprünge in eine Petrischale geben, die zur Hälfte mit geschmolzenem 1,2 % Aros in Embryomedium gefüllt ist. Sobald das Aros erstarrt ist, entfernen Sie die Form, wodurch Reihen dreieckförmiger Vertiefungen entstehen, von denen jede gerade groß genug ist, um ein Embryo aufzunehmen.

Füllen Sie die Transplantationsform mit Pen-Strep-Embryonenmedium und geben Sie Blastula-Stage-Embryonen einzeln mit einer feuerpolierten Glaspipette in jede Vertiefung. Überführen Sie nun die Embryonen in die Transplantationsvertiefungen und lassen Sie sie zunächst seitlich liegen. Ordnen Sie die Embryonen so an, dass die Donor-Embryonen entlang einer Spalte und die Empfänger-Embryonen entlang der benachbarten Spalte platziert werden.

Platzieren Sie die Petrischale so auf dem Objekttisch, dass die Transplantationsnadel, wenn sie in einen Embryo eindringt, diesen gegen die hintere Wand seiner Vertiefung drückt. Senken Sie mithilfe des Mikromanipulators die Transplantationsnadel in einem ziemlich steilen Winkel in die Schale ab. Ideal ist ein Eintrittswinkel der Transplantationsnadel in den Embryo von etwa 45 Grad.

Sobald sich die Nadelspitze unterhalb der Oberfläche des Embryomediums befindet, ziehen Sie durch Drehen des Mikrometerantriebs, der die Hamilton-Spritze steuert, eine kleine Menge Embryomedium in die Nadel ein. Für die präziseste Kontrolle sollte die Grenzfläche zwischen dem Mineralöl und dem Embryomedium im dünnen, konisch zulaufenden Teil der Nadel verbleiben und nicht zu nahe an der Spitze liegen. Positionieren Sie den Donorembrion vorsichtig mit der Nadel, ziehen Sie die Nadel dann leicht zurück und führen Sie sie an der gewünschten Stelle in die Blastulakappe des Embryos ein.

Ein schneller, harter Stoß dringt in das Embryo ein, ohne dass es sich dreht. Saugen Sie die Donorzellen langsam und vorsichtig in die Nadel auf, um eine Schädigung der Zellen zu vermeiden. Vermeiden Sie es, nach dem Aufsaugen der gewünschten Zellanzahl Eigelb in die Nadel aufzusaugen.

Drehen Sie den Druck leicht um, um die Absaugung zu stoppen, und entfernen Sie die Nadel, um den Wirtsembryo in Position zu bringen. Durch Bewegen der Transplantationsschale können kleine Anpassungen der Position des Wirtsembryos vorgenommen werden, indem diese vorsichtig mit der Transplantationsnadel gedreht wird, wobei darauf geachtet werden muss, den Dotter nicht zu berühren. Wenn die Donorzellen in den Wirtsembryo injiziert werden, vermeiden Sie es, Dotter in den Embryo aufzunehmen, da dies die Donorzellen schädigen und töten würde. Zellen aus einem einzelnen Donorembryo können nach Abschluss der Zellübertragungen in mehrere Wirte transplantiert werden.

Überführen Sie die Donator-Wirt-Paare in die beschichteten Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, um die Entwicklung fortzusetzen. Die einzige Ausnahme von der Regel, dass Zellen im Blastulastadium noch nicht für bestimmte Zelllinien festgelegt sind, sind die ursprünglichen Keimzellen. Die ursprünglichen Keimzellen werden bereits sehr früh in der Entwicklung festgelegt und sind bereits auf ihr Schicksal als ursprüngliche Keimzellen verpflichtet.

Bereits in einem sehr frühen Stadium liegen die ursprünglichen Keimzellen nahe dem Rand einer Blastula und eines Gastrula-Stadiums-Embryos. Wenn daher das Ziel des Transplantationsexperiments darin besteht, ursprüngliche Keimzellen zu transplantieren, ist es sehr wichtig, woher die Zellen im Spenderembryo stammen, aber nicht wichtig, wohin sie im Wirtsembryo gelangen. Die Regel lautet daher, dass für somatische Zellen entscheidend ist, wohin sie im Wirtsembryo gelangen – dies bestimmt ihr Schicksal.

Im Fall von primordialen Keimzellen ist es wichtig, woher sie im Spenderembryo stammen, da ihr Schicksal bereits festgelegt ist. Wenn das Ziel darin besteht, primordiale Keimzellen zu transplantieren, müssen diese Zellen am Rand der Keimhöhe des Spenderembryos entnommen werden. Sie befinden sich direkt am Rande des Embryos in vier kleinen Ansammlungen, jeweils bestehend aus drei oder vier Zellen, in diesem Blatt- oder Speerstadium beziehungsweise im hohen Entwicklungsstadium. Man muss sie sehr vorsichtig aufnehmen, um versehentlich nicht das Eigelb anzusaugen.

Okay, und das habe ich dort durchgeführt und wechsle nun zu einem Wirtsembryo. Die primordialen Keimzellen werden in die Keimwulst-Region des jeweiligen Embryos wandern. Daher ist es nicht notwendig, diese primordialen Keimzellen in den Randbereich zu transplantieren – sie erreichen diesen Bereich von selbst.

Ich transplantiere sie also einfach wieder an beliebige Stellen in das Post-Embryo. Der entscheidende Punkt bei Keimzelltransplantationen, die sich in dieser Hinsicht deutlich von allen anderen Transplantationsarten unterscheiden, ist der Ursprung der Spenderzellen. Die Transplantation von Zellen in einen Gastropoden-Entwicklungsstadium-Wirt ermöglicht es dem Experimentator, die bei Zebrafischen auftretende Fate-Map zu nutzen, die sich zeigt, sobald der embryonale Schild sichtbar wird.

Es wird möglich, verschiedene Gewebetypen sowie die Bereiche innerhalb des angenommenen zentralen Nervensystems zu unterscheiden. Beim Übertragen von Zellen zwischen Embryonen im Gastrulastadium gibt es einige Variationen im Protokoll, aber die allgemeine Vorgehensweise ähnelt der Arbeit mit Blastulae, um Gastrulae zu montieren. Zuerst wird ein vertikaler Streifen aus Methylcellulose in der Vertiefung eines Glasobjektträgers aufgetragen, anschließend wird großzügig mit Pen-Strep-Embryomedium mithilfe einer feuerpolierten Pipette überspült.

Ein Spender und drei Schild-Stadium-Wirte für die Depressionsplatte. Wählen Sie Spenderembryonen aus, die geringfügig jünger sind als die Wirte. Ein neues Werkzeug ist erforderlich, um den Gastros-Kleber zu manipulieren: die Enden eines kurzen Stückes zweipfundigen Angelschnurs in das Ende eines Kapillarrohrs einzuführen.

So wird eine kleine Schleife gebildet. Mit Hilfe der Schleife die Donor- und Wirtsembryonen vorsichtig auf die Oberseite des Methylcellulose-Streifens rollen und in die Methylcellulose hineinschieben, bis sie sicher sitzen. In Position rollen, sodass der Zielbereich oben liegt.

Da während der Transplantation die Nadel tangential in das Embryo eindringt, um die Spenderzellen zu übertragen, ohne das Eiweiß zu beschädigen, sollten Transplantationen im Gastro-Entwicklungsstadium am besten an einem feststehenden Objektmikroskop durchgeführt werden. Bringen Sie die Spitze der Transplantationsnadel mithilfe der Steuerung des Mikromanipulators in den Fokus.

Positionieren Sie den Mikropipettenhalter und die Nadel in einem ziemlich flachen Winkel, sodass die Nadel so nahe wie möglich an der Horizontalen liegt, wie es die Kante der Vertiefung auf dem Objektträger zulässt. Durchstechen Sie anschließend das Donorembryo. Wenn es richtig befestigt ist, wird es sich nicht drehen, wenn die Transplantationsnadel eindringt, es sei denn, das Embryo ist zu alt, um ein leichtes Eindringen der Nadel zu ermöglichen.

Um zu vermeiden, dass die Eigelbmasse (ylk) durchbohrt wird, sollte die Nadel in einer Fokusebene in den Embryo eindringen, die geringfügig tiefer liegt als die der EDL. Sobald die Nadel eingedrungen ist, können einer Spenderin eine große Anzahl von Zellen entnommen werden, um bis zu drei Wirtszellen zu injizieren. Beim Aufsaugen der Zellen sollte vermieden werden, dass Eigelb mit aufgesogen wird, gegebenenfalls kann die Nadel bewegt werden, während die Zellen aufgenommen werden.

Zusätzliche Embryonen können zur Gewinnung weiterer Zellen mit derselben Nadel entnommen werden, bevor die Zellen in den Wirt injiziert werden. Beim Ausstoßen der Zellen in den Wirtsembryonen sollten die Zellen abgegeben werden, während die Nadel durch den Zielbereich gezogen wird, anstatt die Zellen als einzelnen Klumpen abzulagern. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Spenderzellen zum gewünschten Gewebe beitragen. Sobald die Zellübertragungen abgeschlossen sind, das gesamte Objektträger in eine Petrischale legen und vorsichtig mit Pen-Strep-Embryo.Medium überfluten.

In den nächsten Stunden löst sich die Methylcellulose auf und setzt die Embryonen frei. Die Anzahl der übertragenen Zellen hängt vom spezifischen Versuchsziel ab. Zellen eines einzelnen Spenders können am Morgen nach der Transplantation in drei oder vier Wirtstiere übertragen werden.

Wirtstiere können untersucht werden, um festzustellen, ob die gezielte Übertragung der Donorzellen erfolgreich war. Eine erfolgreiche Transplantation von primordialen Keimzellen aus dem Blastula-Stadium führt zu fluoreszenzmarkierten Zellen, die ventral in der Nähe der Grenzfläche zwischen dem ylk und der ylk-Erweiterung positioniert sind. Soeben haben wir Ihnen die Durchführung von Transplantationen im Gastrula- und Blastula-Stadium gezeigt.

Bei Anwendung dieser Technik ist es wichtig, die geeignete Transplantationsmethode für das Zielgewebe auszuwählen, das Sie mit Ihren Zellen ansprechen möchten. Die Transplantation im Blastulastadium ist daher ausreichend, um zu bestimmen, ob die Zellen in das Mesoderm oder in das Ektoderm gelangen. Mit dieser Technik können Sie außerdem urkeimzellen gezielt ansprechen.

Wenn Sie eine genauere Kartierung durchführen möchten, ist es besser, eine Transplantation im Gastros-Stadium zu verwenden, bei der die dorsale Seite bereits bestimmt ist. Mit dieser Technik können Sie Zellen gezielt auf verschiedene Bereiche des Nervensystems, insbesondere auf das Vorderhirn, Mittelhirn, Hinterhirn und Rückenmark, übertragen. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei all Ihren Experimenten.