Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Einführung. Hallo. Wir stammen vom Institut für Biometrische Wissenschaften der Bundesuniversität Faja in Brasilien. In diesem Video werden wir Chromosomenpräparationen von menschlichen embryonalen Stammzellen anfertigen, um mögliche chromosomale Veränderungen nachzuweisen. Obwohl gezeigt wurde, dass menschliche embryonale Stammzellen einen stabilen diploiden Karyotyp aufweisen, berichteten mehrere Studien, dass sie je nach Kulturbedingungen anfällig dafür werden, chromosomale Anomalien zu erwerben, wie beispielsweise die Zugabe ganzer Chromosomen oder Chromosomenabschnitte.

Die Charakterisierung der genetischen Integrität von HASS in vitro ist unter Berücksichtigung ihrer wesentlichen Rolle für Entwicklungs- und Embryogenesestudien sowie für die Arzneimittelprüfung von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus stellen chromosomale Veränderungen für zukünftige therapeutische Ansätze eine reale Sorge dar, da sie häufig mit der Karzinogenese assoziiert sind. Beginnen wir also.

Behandeln Sie die Zellen mit Ate. In diesem Verfahren verwenden wir es. Die acht bis neun hat eine Linie, die in F 12 mit 20 % No-Count-Serumersatz und 80 bis neun Gramm pro Milliliter Fibroblastenwachstumsfaktor gehärtet wurde. Beginnen Sie damit, den Kulturkolben aus dem Inkubator zu entnehmen, und fügen Sie unter einer laminarer Luftstromhaube eine Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter Coit hinzu.

Die Zugabe von Coit zum Medium induziert Mitoka, Ruhephase und Metaphase. Wenn die Chromosomen gut kondensiert sind und unter dem Mikroskop leichter sichtbar werden, achten Sie darauf, sterile Techniken anzuwenden, um Kontaminationen zu vermeiden. Nachdem Sie Coit hinzugefügt haben, bewahren Sie die Flasche auf und bringen die Zellen zurück in den Inkubator.

Nach der Inkubationszeit die Zellen fixieren, die Zellen sind zu diesem Zeitpunkt noch nicht zur Fixierung bereit. Es ist nicht notwendig, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten. Beginnen Sie damit, das Medium abzusaugen, und wenn Sie damit fertig sind, fügen Sie Trypsin hinzu.

Das DTA beträgt 0,05 % gegenüber dem Kolben. Stellen Sie sicher, dass genügend Trypsin hinzugefügt wird, um die Unterseite der Zellen vollständig zu bedecken. Verschließen Sie den Kolben und schütteln Sie ihn vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.

Das Trypsin ermöglicht es, die Zellen fünf Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Nach den fünf Minuten der Inkubation bei Raumtemperatur sollten die Zellen nicht mehr an der Unterseite des Kolbens haften, und Sie müssen das Trypsin entweder durch Zugabe von Kulturmedium mit Serum oder durch vorsichtiges Hinzufügen von Serum zu den Zellen inaktivieren. Entfernen Sie vorsichtig die Kappe des Kolbens und geben Sie Kulturmedium oder Serum hinzu, wobei die Flüssigkeit langsam an der Unterseite des Kolbens über die Zellen fließen sollte.

Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals auf und ab, um die Zellen vollständig zu dissoziieren. Überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas, aber stellen Sie vorher sicher, dass die Zellen gut dissoziiert sind und die Suspension keine sichtbaren Zellklumpen enthält. Verschließen Sie das Gefäß nach Abschluss des Umpipettierens und zentrifugieren Sie es.

Falten Sie die Suspension fünf Minuten lang. Nach der Zentrifugation bei 800 U/min sollte sich ein Zellpellet am Boden des Röhrchens befinden. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht aufzuwirbeln.

Aspirieren Sie die Probe mit einer P-1000-Pipette, bis nur noch etwa 200 Mikroliter verbleiben. Dieses Volumen ist median für Resus. Suspendieren Sie das Pellet in Resus.

Den Palatum suspendieren. Das Röhrchen mehrmals vorsichtig mit den Fingern anstoßen. Überprüfen Sie, ob die Zellen gut suspendiert sind, indem Sie sicherstellen, dass keine Zellklumpen mehr in der Lösung vorhanden sind.

An dieser Stelle sollte die Lösung trüb sein. Als Nächstes müssen Sie fünf Milliliter einer 75 Millimolar-Lösung von Kaliumchlorid, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, hinzufügen. Die hypotone Lösung sollte sehr langsam entlang der Röhrenwand hinzugegeben werden, während Sie die Röhre rotieren.

Nachdem Sie die ersten drei Milliliter hinzugefügt haben, verschließen Sie das Röhrchen fest und vorsichtig. Homogenisieren Sie die Zellsuspension mit einer hypotonen Lösung, indem Sie das Röhrchen langsam und vorsichtig horizontal drehen.

Es wird fortgesetzt, indem die verbleibenden zwei Milliliter auf die gleiche Weise wie zuvor langsam zugegeben werden. Der Zweck der hypotonen Lösung besteht darin, das Zellvolumen zu vergrößern, um den Chromosomen zu ermöglichen, sich zu entwirren. Daher ist diese Inkubationszeit entscheidend, um gute Chromosomenpräparate zu erhalten. Sobald die gesamten fünf Milliliter zugegeben wurden, wird das Röhrchen verschlossen und die Zellen 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Nach Ablauf der 15-minütigen Inkubationszeit nehmen Sie das Reagenzglas aus dem Wasserbad. An dieser Stelle arbeiten Sie am besten unter dem Abzug, da die Dämpfe, die von der Fixierlösung ausgehen, toxisch sind. Falls kein Abzug zur Verfügung steht, achten Sie darauf, in einem gut belüfteten Bereich zu arbeiten.

Entfernen Sie die Kappe des Röhrchens und geben Sie drei Tropfen der Fixierungslösung hinzu. Dabei handelt es sich um ein 3:1-Verhältnis von Methanol und Essigsäure, das am Tag der Verwendung frisch hergestellt werden sollte. Verschließen Sie das Röhrchen fest und drehen Sie es vorsichtig horizontal, wobei es langsam zuerst im Uhrzeigersinn, dann gegen den Uhrzeigersinn gedreht wird.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang mit 800 U/min ohne Bremse. Es ist sehr wichtig, dass der Spindelzyklus langsam auslaufen kann, um Verluste von Material durch Zellabrieb nach der Zentrifugation zu vermeiden. Dieser Cardio-Sate lebt in etwa bei 200.

Um das Sediment lediglich aufzulösen, klopfen Sie vorsichtig mehrmals mit den Fingern leicht gegen das Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig suspendiert sind, indem Sie prüfen, ob keine Zellklumpen mehr vorhanden sind. Die Lösung mit drei Millilitern Fixierungslösung geben Sie langsam entlang der Röhrchenwand hinzu, während Sie das Röhrchen danach rotieren, nachdem Sie die ersten drei Milliliter zugegeben haben.

Schließen Sie das Reagenzglas T fest und homogenisieren Sie die Zellsuspension vorsichtig, indem Sie das Reagenzglas horizontal drehen und es langsam rotieren lassen. Achten Sie darauf, mindestens eine volle Umdrehung durchzuführen. Um diesen Mischvorgang zu optimieren, fügen Sie mehr hinzu.

2 mL der Fixierlösung an der Tubuswand entlang geben, um die Zellen abzusenken. Die Zellsuspension über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. So fixierte Zellen können monatelang in der Fixierlösung bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden.

Am nächsten Tag die Zellen waschen, indem die Zellen fünf Minuten bei 800 U/min zentrifugiert werden, ohne Bremse. Den Überstand verwerfen und in etwa 200 Mikrolitern resuspendieren. Den Pellet durch mehrmaliges Aufstoßen des Röhrchens mit den Fingern suspendieren.

Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut assoziiert sind und die Suspension keine sichtbaren Zellklumpen enthält. Geben Sie langsam fünf Milliliter frische Fixierlösung an der Röhrenwand entlang hinzu. Verschließen Sie die Röhre und homogenisieren Sie die Zellen, indem Sie die Röhre vorsichtig horizontal drehen, während sie sich langsam rotiert.

Außer dem Schutz der Zellen wird in dem Zustand die Fixierlösung angegeben, entfernt Lipide und danach Aist-Proteine, wodurch die Chromosomen leichter ausbreiten können. Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten bei 800 RRP M ohne Bremse. Vorbereitung der Objektträger: Lassen Sie nach dem Zentrifugationsschritt eine ausreichende Menge an Lösung zurück, um das Zellpräparat zu homogenisieren.

Diese Menge an Flüssigkeit kann von der Anzahl der Zellen abhängen. Schlagen Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig mit den Fingern an. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut dispergiert sind, indem Sie überprüfen, ob keine sichtbaren Zellklumpen vorhanden sind.

Zu diesem Zeitpunkt sollte die Zielprobe hinzugefügt werden, indem 20 bis 30 Mikroliter Zellsuspension mittels Pipette parallel zu dieser leichten Oberfläche auf einen sauberen, trockenen Objektträger gegeben werden. Während die Fixierlösung verdunstet, wird die Oberfläche der Platte sofort körnig. Halten Sie diese Seite nach oben gerichtet 30 Sekunden lang in den Dampf von heißem Wasser, um die Zellen aufquellen zu lassen.

Analysieren Sie diese Präparate. Nachdem Sie diese Objektträger vorbereitet haben, untersuchen Sie sie unter einem Phasenkontrastmikroskop mit den 10x- und den behaarten Objektiven, um festzustellen, ob die Zelldichte für eine weitere Analyse geeignet ist. Dieser Objektträger ist ein Beispiel für einen zu konzentrierten Präparat.

Beachten Sie, dass die Zellkerne zu dicht an den Metaphaseausstrichen liegen. Wenn Sie eine Objektträgerplatte haben, bei der die Zelldichte zu hoch ist, verdünnen Sie die Zellsuspension, indem Sie mehr Fixierungslösung hinzufügen. Auf dieser Platte ist die gewünschte Zelldichte dargestellt.

Beachten Sie, dass die Metaphasepräparate gut verteilt und isoliert sind. Sobald ein Objektträger mit einer optimalen Zelldichte erhalten wurde, kann er nicht mehr angefärbt und analysiert werden. Vermeiden Sie es, Metaphasen in der Nähe des Zellkerns auszuwählen, da Chromosomen verdeckt oder von der Sicht behindert sein könnten.

Suchen Sie nach Metaphasen, die abgerundet sind, achten Sie jedoch darauf, dass keine Chromosomen von der Metaphase abweichen. Wählen Sie zwei abgerundete und gut isolierte Metaphasen aus. Wie auf der folgenden Folie dargestellt, sollten Sie vermeiden, falsche IES als Gewinn von Chromosomen aufgrund von zwei weiteren Ausstrichen zu melden, oder den Verlust von Chromosomen, der durch abweichende Chromosomen verursacht wird.

Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen bei Ihren weiteren Experimenten helfen wird. Wenn Sie Fragen haben, zögern Sie nicht, uns zu kontaktieren. Viel Spaß und viel Erfolg.