Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss
5. November 2009
Die analytischen Ultrazentrifuge (AUC) Probenzelle hält Probe und Referenz-Puffer und während der Experimente und eine hohe Vakuum-und Rotor-Geschwindigkeiten von bis zu 60.000 Umdrehungen pro Minute ausgesetzt. Dieses Video startet den viel Liebe zum Detail, die für Montage, Be-und Ausrichtung dieses sehr wichtige Komponente einer AUC Experiment demonstrieren.
Hallo, ich bin Andrea Balbo. Ich arbeite in der Gruppe von Peter Schuck am Nationalen Institut für Gesundheit. In diesem Video werden wir Ihnen unsere Verfahren zur Montage, Befüllung und Rotorausrichtung einer Messzelle für die analytische Ultrazentrifuge demonstrieren.
Beginnen wir. Gesammelt. Hier sind die Bestandteile einer Messzelle für die analytische Ultrazentrifuge. In der Zellhalterung gestapelt befindet sich ein 12 Millimeter doppelsektoriges Kohlefeld, ein Epon-Zentrumsteil, das zwischen zwei Fenstereinheiten eingeschlossen wird. Jede Fenstereinheit besteht aus einer Fensterdichtung, einem Fenstereinsatz und einer Scheibe, die in der Fensterhalterung befestigt ist.
Diese Teile werden dann in das Zellengehäuse hineingeschoben, indem ihre Nuten mit der im Gehäusezylinder befindlichen Führungsnut ausgerichtet werden; anschließend wird eine Gehäusedichtung und ein Schraubring verwendet, um die Probenzelle mit einem Drehmoment von 120 bis 140 Zoll-Pfund zu verschließen. Nachdem die Probe geladen wurde, verschließen zwei Gehäusestopfen-Dichtungen und ein Gehäusestopfen die Ladeöffnungen der Zelle, um Scanning-Artefakte, Leckagen und Brüche während der Experimente zu vermeiden. Es ist entscheidend, dass alle Komponenten sauber, trocken, staubfrei und in bestmöglicher Verfassung sind; prüfen Sie sie regelmäßig und ersetzen Sie sie bei Bedarf. Außerdem benötigen Sie Folgendes: einen analytischen Ultrazentrifugen, einen Titan-Vierloch-Rotor, eine Laborwaage, einen Drehmomentschlüssel mit ablesbarer Skala und ein Drehmoment-Stativ, ein Gegengewicht und Gegengewichtsgewichte, einen Schlitzschraubendreher, eine Pinzette, eine 200-Mikroliter-Pipette mit langem konischem Pipettenspitze, Ausrichtwerkzeuge und Schmiermittel für die Spin-Beschichtung.
Wir beginnen die Herstellung der Probenzelle, indem wir zwei Fensterbaugruppen zusammenfügen. Zuerst wird eine Fensterdichtung an der Unterseite des Fensterhalters angebracht. Danach wird der Fenstereinsatz, manchmal auch Fensterkissen genannt, im Fensterhalter so positioniert, dass die Öffnung des Einsatzes gegenüber der Schlüsselweite des Halters unter leichtem Winkel liegt.
Bringen Sie dann das Fenster in der Halterung an, wobei die Markierung am Fenster mit der Nut im Fensterhalter ausgerichtet wird. Drücken Sie vorsichtig an den äußeren Rändern auf beiden Seiten des Fensters nach unten. Um eine ordnungsgemäße Abdichtung und eine genaue Verdrehung der Probenzelle sicherzustellen, bestreichen wir die Dichtung in der Schraubhülse leicht.
Tragen Sie mit dem Spin-Coat-Schmiermittel eine sehr geringe Menge Spin Coat auf Daumen und Zeigefinger auf. Bestreichen Sie die Gewindegänge des Schraubrings mit einem dünnen, unsichtbaren Film aus Spin Coat. Bestreichen Sie ebenso die Gehäusedichtung.
Entfernen Sie sichtbaren Schmierstoff. Um mit dem Zusammenbau der Probenzelle zu beginnen, schieben Sie eine Fensteranordnung mit der Fensterseite nach oben gerichtet in das Zellengehäuse, indem Sie die Nute mit dem Schlüssel des Gehäuses ausrichten.
Richten Sie die Nute des Mittelteils mit dem Schlüssel der Hülle aus und lassen Sie es sanft auf die Fensteranordnung innerhalb der Hülle herabfallen. Verwenden Sie niemals irgendein Werkzeug, um das Mittelteil in das Zellgehäuse hineinzudrücken. Dies könnte dauerhafte Beschädigungen am Mittelteil verursachen und zu Leckagen bei Experimenten führen.
Drehen Sie die zweite Fensterbaugruppe so, dass das Fenster zur Mittelachse und von Ihnen weggerichtet ist. Richten Sie die Schlüsselnut mit dem Schlüssel der Hülse aus und schieben Sie sie auf die Mittelachse. Legen Sie die Gehäusedichtung darauf.
Dann eine Schraubfassung so, dass das Wort „out“ sichtbar ist. Mit den Fingern festziehen. Danach ein Ausrichtwerkzeug verwenden und die Schraubfassung per Hand fest anziehen.
Manchmal lässt sich das Mittelstück nicht leicht in den Gehäusezylinder schieben. Sie können es zunächst ausrichten und dann die zweite Fensterbaugruppe daraufsetzen. Durch vorsichtigen, nach unten gerichteten Druck auf die Fensterbaugruppe.
Sie können beide gleichzeitig in das Zellgehäuse schieben. Auf diese Weise vermeiden wir, direkt auf das Zentralelement zu drücken. Jetzt ist ein guter Zeitpunkt, um die Zelle auf Staub, Fusseln und Fingerabdrücke zu überprüfen.
Sie werden auch Newtonsche Ringe bemerken, die darauf hinweisen, dass noch Luft zwischen der Mittelscheibe und den Fenstern vorhanden ist. Diese verschwinden nach dem Anziehen mit dem Schraubring, wobei das Wort deutlich sichtbar ist. Setzen Sie die Probenzelle vollständig in die Zelle ein.
Drehmomentschlüssel des Drehmomentstellers. Halten Sie die Zelle durch Ausüben eines konstanten Drucks auf den Griff des Drehmomentstellers an Ort und Stelle. Ziehen Sie den Schraubring in einer kontinuierlichen Bewegung auf ein Drehmoment zwischen 120 und 140 Zoll-Pfund an.
Lösen Sie den Griff des Drehmomentsständers und entfernen Sie vorsichtig die Probenzelle. Üblicherweise füllen wir ein Volumen von 400 Mikrolitern in jeden Sektor des 12-Millimeter-Mittelteils. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, positionieren Sie die Probenzelle mit den Ladeöffnungen nach oben und stellen Sie sicher, dass das Wort „out“ am Schraubring sichtbar ist.
Schieben Sie die Pipettenspitze bis zur Hälfte in den linken Zentralsektor durch die Ladelöcher und geben Sie langsam 200 Mikroliter Referenzlösung ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal, um insgesamt 400 Mikroliter zu erreichen, wobei dieselbe Pipettenspitze und dieselbe Technik sorgfältig und langsam angewendet werden. Füllen Sie den rechten Zentralsektor mit 400 Mikrolitern Probelösung.
Es ist unerlässlich, die Volumina der Referenz- und Probenlösungen so genau wie möglich anzupassen. Ein fester Sitz der Pipettenspitze auf der Pipette, langsames Aufnehmen und Abgeben der Lösungen, das Vermeiden von Luftblasen beim Aufnehmen sowie die Verwendung derselben Pipettenspitze für beide Lösungen tragen dazu bei, die Volumina gleich zu halten, um die Zelle abzudichten.
Setzen Sie zwei rote Dichtungen für die Gehäusestopfen fest in jedes Lade Loch ein und achten Sie darauf, dass sie sorgfältig zwischen der Mittelplatte und dem Aluminiumgehäuse positioniert sind. Decken Sie jedes Lade Loch mit einem Gehäusestopfen ab und ziehen Sie ihn per Hand mit einem kleinen Schlitzschraubendreher fest. Stellen Sie vor dem Beladen des Rotors sicher, dass das Gegengewicht und die Zelle, die dem Gegengewicht gegenüberliegen wird, in ihrem Gewicht um nicht mehr als 0,5 Gramm voneinander abweichen.
Stellen Sie zunächst die Waage auf Null. Wiegen Sie dann eine Probenzelle, die sich gegenüber dem Gegengewicht befinden wird. Taren Sie die Waage, um das Gewicht der Probenzelle zu subtrahieren.
Wiegen Sie dann das Ausgleichsgewicht. Hier stellen wir fest, dass das Ausgleichsgewicht 4,193 Gramm leichter ist als die Probenzelle. Wählen Sie ein vier Gramm schweres Ausgleichsgewicht aus und schrauben Sie es in die Befestigungslöcher des Ausgleichsgewichts ein, wobei sicherzustellen ist, dass es sich nicht nach oben hinaus erstreckt.
Wiegen Sie das Gegengewicht, um sicherzustellen, dass das endgültige Gewicht innerhalb von 0,5 Gramm liegt. Platzieren Sie bei Verwendung eines Vierlochrotors das Gegengewicht in Position vier, sodass der weiße Pfeil sichtbar ist und in Richtung der Zentrifugalkraft zeigt. Stellen Sie mithilfe eines Ausrichtwerkzeugs sicher, dass es vollständig in den Rotor eingeschoben ist.
Platzieren Sie die Wägeprobenzelle so, dass die Gehäusestopfen zur Mitte des Rotors zeigen und das Wort „out“ am Schraubring sichtbar ist. Verwenden Sie erneut ein Ausrichtwerkzeug, um sicherzustellen, dass die Zelle vollständig in den Rotor eingeschoben ist, wenn man von unten auf den Rotor blickt.
Richten Sie das Innere aus. Markieren Sie mit einem Griffel die Markierung, die der Mitte des Rotors am nächsten liegt, anhand der Sollstrichmarkierung am Gegengewicht unter Verwendung eines Ausrichtwerkzeugs. Richten Sie auf dieselbe Weise die Probenzelle in Position zwei aus.
Nachdem alle Zellen ausgerichtet sind, ist der Rotor bereit, in die Zentrifugenkammer eingesetzt zu werden.
Übersicht
Dieses Video zeigt den Zusammenbau, das Befüllen und die Ausrichtung einer Messzelle für die analytische Ultrazentrifugation (AUC), was für AUC-Experimente entscheidend ist. Es wird besonders auf die sachgemäße Handhabung und Vorbereitung der Komponenten der Messzelle hingewiesen, um genaue Ergebnisse sicherzustellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Analytische Ultrazentrifugation
- Biophysikalische Methoden
- Probenpräparationstechniken
Hintergrund
- Die AUC-Probenzelle ist entscheidend für Experimente bei hohen Rotorgeschwindigkeiten.
- Sie besteht aus mehreren Komponenten, die präzise zusammengebaut werden müssen.
- Die Einhaltung von Sauberkeit und korrekter Ausrichtung ist entscheidend, um experimentelle Artefakte zu vermeiden.
- Das Verständnis des Montagevorgangs ist für Forscher, die AUC verwenden, von wesentlicher Bedeutung.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Montage und Befüllung einer AUC-Messzelle bereitzustellen.
- Die Bedeutung einer sorgfältigen Vorbereitung bei AUC-Experimenten hervorzuheben.
- Sicherzustellen, dass Forschende den Prozess genau replizieren können.
Verwendete Methoden
- Montage der Fenstereinheiten und der Mittelplatte in der Messzelle.
- Aufbringen von Drehmoment zur Befestigung der Komponenten der Messzelle.
- Befüllen der Zelle mit Referenz- und Probelösungen.
- Ausbalancieren der Messzelle mit einem Gegengewicht für genaue Messungen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreicher Zusammenbau der AUC-Probenzelle, wie im Video gezeigt.
- Richtige Beladetechniken gewährleisten minimale Blasenbildung und gleiche Volumina.
- Die Anpassung des Gegengewichts ist entscheidend für eine genaue Rotorenleistung.
- Visuelle Indikatoren wie Newtonsche Ringe helfen, die Qualität der Montage zu beurteilen.
Schlussfolgerungen
- Die Beachtung von Details beim Zusammenbau der Probenzelle ist entscheidend für AUC-Experimente.
- Die Einhaltung der beschriebenen Verfahren kann die experimentelle Zuverlässigkeit verbessern.
- Regelmäßige Wartung und Überprüfung der Komponenten wird empfohlen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Die korrekte Montage und Ausrichtung der Messküvetten für die analytische Ultrazentrifuge ist entscheidend für die Erzeugung zuverlässiger biophysikalischer Daten über die Größe, Form, Reinheit und Oligomerisierungszustände von Proteinen. Eine sorgfältige Vorbereitung der Messküvetten minimiert experimentelle Artefakte und gewährleistet die Datenintegrität für die Zielvalidierung und mechanistische Untersuchungen im frühen Stadium der Wirkstoffentwicklung. Diese methodische Sorgfalt unterstützt das Vertrauen in die Vorhersagekraft nachgeschalteter Screening- und Lead-Optimierungsprozesse.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die präzise Bestimmung von Protein-Oligomerisierungszuständen und Protein-Protein-Wechselwirkungen und liefert damit direkte Hinweise für Target-Validierungshypothesen.
- Operationaler Wert: Bietet eine markierungsfreie, lösungsbasierte Analyse makromolekularer Eigenschaften unter nahezu nativen Bedingungen.
- Prädiktiver Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei der Entschärfung von Targets, indem quantitative Sedimentationskoeffizienten und Formparameter bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert hydrodynamische Größen- und Formdaten, die für die Formulierung von Assaypuffern und die Stabilitätsprüfung unerlässlich sind.
- Operativer Wert: Gewährleistet Probenechtheit und Monodispersität, was für reproduzierbare biochemische und zellbasierte Assays entscheidend ist.
- Plattformintegration: Unterstützt die biophysikalische Charakterisierung gereinigter Zielstrukturen vor Hochdurchsatz-Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Beurteilung der Bildung von Protein-Komplexen und konformationellen Veränderungen, die für Krankheitsmechanismen relevant sind.
- Operativer Wert: Unterstützt die Überprüfung der Chargenkonsistenz rekombinanter Proteine, die in präklinischen Modellen verwendet werden.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die biophysikalische Zielstrukturcharakterisierung mit funktionellen Assays in krankheitsrelevanten Systemen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Probennahmeablauf für die analytische Ultrazentrifuge ist in den Entdeckungsprozess von der Zielvalidierung bis zur Leitsubstanzidentifizierung integriert und liefert biophysikalische Messwerte, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch auf Grundlage des Verhaltens und der Stabilität des Targets unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Oligomerisierung des Zielmoleküls und dessen Interaktionsnetzwerken und ermöglicht so eine biologische Entrisikung vor der Assay-Entwicklung.
- Screening: Stellt die Monodispersität und Stabilität des Zielmoleküls sicher, was direkten Einfluss auf die Assay-Einsatzbereitschaft und Datenqualität in Screening-Kampagnen hat.
- Analytik: Erzeugt quantitative Messungen des Sedimentationskoeffizienten und des Molekulargewichts, die den Vergleich von Proteinzuständen unter verschiedenen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Verbindet die biophysikalischen Eigenschaften des gereinigten Zielmoleküls mit der funktionellen Validierung in präklinischen Modellen durch konsistente Materialqualität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine standardisierte, wiederverwendbare Kapazität für die biophysikalische Charakterisierung mehrerer Zielmoleküle und Projekte dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bezüglich Zielstruktureigenschaften, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten und verbesserte stringente Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Standardisierte Probenvorbereitung, Reproduzierbarkeit zwischen Durchläufen und Skalierbarkeit über verschiedene Labore hinweg.
- Strategischer Wert: Besser informierte Go/No-Go-Entscheidungen, reduzierte Fehlschlagraten aufgrund von Zielinstabilität und verbesserte Kapitalnutzungseffizienz in der frühen Entdeckungsphase.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf biophysikalischen Entwicklungsrisikodaten.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Fachkenntnisse in biophysikalischen Techniken und präzises Handling optischer Komponenten.
- Ist abhängig von der Instrumentierung der analytischen Ultrazentrifuge, Drehmomentschlüsseln, Justagewerkzeugen und der handhabung von Proben unter Bedingungen, die mit Reinräumen kompatibel sind.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Teams hinweg bei Reinigungs-, Montage- und Anzugsdrehmomentprotokollen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Probentypen, Pufferbedingungen und Geometrien der Zentrifugenmitteile.
- Ist durch die Zerbrechlichkeit der Komponenten begrenzt; Fenster und Mitteile sind empfindlich gegenüber Partikeln, falschem Drehmoment oder Fehlausrichtung.
