Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ

Indem in situ-Hybridisierung und Tetramer-Färbung in einer als ISTH bekannten Technik kombiniert werden, lassen sich die relativen Zahlen und räumlichen Beziehungen zwischen virusantigenspezifischen Immun-Effektorzellen und virusinfizierten Zellen sowie Geweben bestimmen. Bei der ISTH-Methode wird zunächst frisches, mit SIV infiziertes Gewebe in Agar eingebettet. Das Gewebe wird mit einem Vibroschneidemesser in 200 µm dicke Schnitte zerlegt und auf virales Antigen gefärbt.

Spezifische CD8-positive Zellen mithilfe von mit FITC markierten MHC-Tetrameren. Nach dem Einfrieren werden diese gefärbten Schnitte mit einem Kryostaten in acht Mikrometer dicke Schnitte weiter zerschnitten, und eine In-situ-Hybridisierung wird durchgeführt, um virusinfizierte Zellen zu lokalisieren. Die doppelt gefärbten Schnitte werden mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet und schließlich die ursprünglichen dicken Schnitte rekonstruiert, um die Beziehung zwischen Immun-Effektor- und Zielzellen aufzudecken.

Die Anwendung dieses Verfahrens zur Untersuchung einer frühen SIV-Infektion hat sich als guter Prädiktor für die Schwere der anschließenden Erkrankung erwiesen. Hallo, ich bin Chinen Lee aus dem Labornetzwerk von Ashley HA am Department für Mikrobiologie der University of Minnesota. Ich bin Pam Skinner, Assistenzprofessorin am Department für Veterinärmedizinische Wissenschaften der University of Minnesota.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für die In-situ-Tetramer-Hybridisierung, kurz ISTH. Neben der hier demonstrierten Kombination aus In-situ-Tetramer-Färbung und In-situ-Hybridisierung verwenden wir routinemäßig auch die Kombination aus In-situ-Tetramer-Färbung und Immunhistochemie, um Ort, Häufigkeit und Proteinexpressionsprofil antigenspezifischer CD8+-T-Zellen im Gewebe zu bestimmen. Bei der In-situ-Tetramer-Färbung mit Dünnschnitten wird uns heute Dr. Heon Kim und Terry Matala assistieren, und bei der Herstellung dünner Schnitte sowie der In-situ-Hybridisierung wird uns assistieren. Beginnen wir also.

Um dieses Verfahren zu beginnen, kühlen Sie das Vibram-Bad, das sterile PBSH enthält, auf nahezu zwei Grad Celsius ab. Stellen Sie den Neigungswinkel der Vibratormesser auf 27 Grad ein. Lagern Sie frisches Gewebe nach Möglichkeit stets auf Eis und beginnen Sie das Verfahren innerhalb von 24 Stunden nach der Gewebeentnahme.

Um die Degradierungskühlung zu minimieren, erleichtert das Vibram auch das Schneiden eines frischen Gewebes, wobei man das Bindegewebe entfernt, die Probe mit dem Skalpell in kleine Stücke schneidet und die Stücke in ein Wannenboot legt und mit 4 % Low-Melt-Agros in PBS abdeckt, das bei etwa 40 Grad Celsius geschmolzen wurde. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe mit dem Boden der Schale in Kontakt steht, und drücken Sie die Gewebestücke nach unten, falls sie schwimmen, und lassen Sie es drei bis fünf Minuten auf Eis erstarren.

Hier wird Milzgewebe verwendet, aber auch Lymphknoten, Vagina, Zervix, Uterus oder anderes frisches Gewebe können mit einem Skalpell verwendet werden. Schneiden Sie das Agaros um das Gewebe herum ab und überführen Sie mithilfe einer Pinzette vorsichtig das in Agaros eingebettete Gewebe auf den Gewebeklotz. Anschließend beschichten Sie einen Vibram-Gewebeklotz mit Loctite-Kleber.

Bewegen Sie das Gewebestück nicht mehr, sobald es auf dem Gewebetragstück platziert ist. Lassen Sie es etwa 10 Minuten auf Eis trocknen. Befestigen Sie danach das Gewebetragstück im Vibratom und schneiden Sie das Gewebe in 200 Mikrometer dicke Schnitte mit sehr langsamer Vorschubgeschwindigkeit und relativ hoher Amplitude.

Verwenden Sie einen Pinsel, um die geschnittenen Schnitte in eine spezielle Gewebekammer zu überführen, die in der Vertiefung einer 24-Loch-Gewebekulturplatte platziert ist und mit einem Milliliter kaltem PBSH vorgefüllt wurde. Geben Sie bis zu vier Gewebeschnitte in jede Gewebekammer. Kennzeichnen Sie die Proben und befestigen Sie den Deckel der Platte mit einem Gummiband, um die Gewebeschnitte für virus-spezifische T-Zellen anzufärben.

ZI-konjugierte Tetramere werden zunächst in Blockierpuffer auf etwa 0,5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt. Die Lösung wird mit je einem Milliliter pro Vertiefung in eine 24-Loch-Platte pipettiert. Das frisch geschnittene Gewebe wird in die Gewebekammern der Platte überführt und über Nacht bei vier Grad Celsius unter Schütteln inkubiert.

Halten Sie eine leere Vertiefung zwischen den Gewebe-Kammern mit verschiedenen Proben ein, um eine Kreuzkontamination der Lösungen in den nachfolgenden Schritten zu vermeiden. In diesem Schritt können Antikörper hinzugefügt werden, die gegen extrazelluläre oder Zelloberflächenproteine gerichtet sind. Zum Waschen bereiten Sie eine 24-Loch-Zellkulturplatte vor, die gekühltes PBSH enthält, nach der primären Inkubation.

Zweimaliges Waschen durch Übertragung der Gewebekammern in eine vorab befüllte Platte, jeweils 20 Minuten lang; stellen Sie sicher, dass vor der Übertragung die meiste Flüssigkeit aus den Gewebekammern abgegossen wird. Achten Sie beim Bewegen der Gewebekammern darauf, dass kein Inhalt einer Probe in eine andere tropft, und überwachen Sie die Schnitte in den Gewebekammern, um sicherzustellen, dass sie nicht an den Seiten haften bleiben. Fixieren Sie die Schnitte nach der Fixierung zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit frischer 4 % Paraformaldehyd-Lösung in PBS.

Zweimal mit kaltem PBSH je fünf Minuten lang waschen, um das Signal der Tetramere zu verstärken. Die Schnitte mit Kaninchen-Anti-Fitzy-Antikörpern im Verdünnungsverhältnis 1:10.000 in Blockierpuffer für ein bis drei Tage inkubieren. In diesem Schritt können Antikörper gegen intrazelluläre Epitope hinzugefügt werden.

Dafür sorgen, dass die Zellen permeabilisiert und unspezifische Bindungsstellen blockiert werden, bevor der Antikörper hinzugefügt wird. Gegebenenfalls ist auch eine Antigen-Retrieval-Behandlung nach der zweiten langen Inkubation zur Signalverstärkung erforderlich. Die Schnitte dreimal in PBSH waschen, jeweils mindestens 20 Minuten und bis zu mehreren Stunden.

Führen Sie eine abschließende Inkubation mit geeigneten fluoreszenzmarkierten Antikörpern durch. Beispielsweise kann man einen Ziegen-Anti-Kaninchen-SI-3 verwenden, um die Kaninchen-Anti-Fitzy-Antikörper zu binden und so die Tetramer-Färbung rot fluoreszierend zu machen. Wenn Maus-Antikörper zur Gegenfärbung von interessierenden Proteinen wie CD8 verwendet wurden, um Killer-T-Zellen sichtbar zu machen, kann man Ziegen-Anti-Maus-Alexa-488 verwenden, um an die Maus-Antikörper zu binden und so die Antikörper-Färbung grün fluoreszierend zu machen. Die Verdünnungen jedes Antikörpers müssen empirisch bestimmt werden.

Inkubieren Sie einen bis drei Tage lang und schützen Sie die Schnitte während dieser Inkubation und danach vor Licht, indem Sie die Platten mit Aluminiumfolie umwickeln, da Licht die Fluoreszenz löscht. Fixieren Sie die Schnitte abschließend erneut, um die Tetramere und Antikörper an ihrem Platz zu fixieren. Waschen und montieren Sie sie auf einem Objektträger mit Glycerin-Gelatine, das vier Milligramm pro Milliliter N-Propylgallat enthält, zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius, bis dünne Schnitte für die In-situ-Hybridisierung vorbereitet werden.

Die Schnitte mit der In-situ-Tetramer-Färbung können nun mit einem konfokalen Mikroskop analysiert werden, um die Lokalisation, Häufigkeit und den Proteinexpressionsmuster antigenspezifischer CD8+-T-Zellen zu bestimmen. In dem gezeigten Bild wurden Schnitte von Milzgewebe aus einem mit SIV infizierten Rhesusmakaken mit Gag-Tetrameren zur Markierung SIV-spezifischer CD8+-T-Zellen sowie mit CD20- und CD3-Antikörpern gefärbt. Da die Gegenfärbung mit Antikörpern im nächsten Schritt verlorengeht, ist es wichtig, die In-situ-Tetramer-Färbung vor dem Fortfahren zu analysieren.

Beginnen Sie den Dünnschnittprozess, indem Sie die 200 µm dicken Schnitte fünf Minuten lang bei 70 °C auf einem Wärmeblock erhitzen, um die dicken Schnitte vom Objektträger zu lösen. Sobald die Schnitte gelöst sind, betten Sie sie in OCT auf Trockeneis ein, indem Sie zunächst den Boden der Kunststoffform mit OCT füllen. Dann platzieren Sie das Gewebe auf dem OCT und bedecken es mit OCT.

Verwenden Sie einen Kryostaten, um acht Mikrometer dicke Schnitte aus den in OCT eingebetteten Proben zu schneiden, und bringen Sie die acht Mikrometer dicken Schnitte auf silanisierten Objektträgern auf. Die Objektträger können anschließend bei minus 80 Grad Celsius in einer verschlossenen Box für die spätere In-situ-Hybridisierung gelagert werden. Eine Standard-In-situ-Hybridisierung wird verwendet, um virusinfizierte Zellen mittels mit S 35 markierten, virus-spezifischen Riboproben nachzuweisen.

Das Verfahren umfasst außerdem das Beschichten von Schnitten mit Kernspuremulsion und das Aufbringen von Deckgläsern. In einem fluoreszenzkompatiblen PVA-basierten Medium werden konfokale Bilder mit einem BioRad MRC 1000-Konfokalmikroskop aufgenommen, das mit einer Epi-Tube-Blau-Reflexionseinrichtung ausgestattet ist. Die In-situ-Tetramer-Färbung wird mithilfe von EPI 1 605 für den roten Tetramer-Fluorochrom und EPI 2 522 DF 32 für den grünen CD8-Fluorochrom zur In-situ-Hybridisierung sichtbar gemacht.

Verwenden Sie die EPI zwei blau Reflexion für die Silberkörner, die aus dem Signal der In-situ-Hybridisierung in den entwickelten Radioautographien resultieren. Beginnen Sie die Bildaufnahme, indem Sie die Bilder von jedem Schnitt von links nach rechts und von oben nach unten aufnehmen, und stellen Sie sicher, dass jedes Bild mit einer Überlappung von etwa 20 % zu den benachbarten Bildern erfasst wird. Um Lücken im rekonstruierten Montagebild zu vermeiden, benennen Sie jedes Bild entsprechend seiner Zeile und Spalte in einer Excel-Datei.

Wenn die Datensammlung von den Objektträgern abgeschlossen ist, verwenden Sie die Confocal-Assistenten-Software, um die Z-Serienbilder für jeden Kanal mithilfe eines von den Autoren verfügbaren Photoshop-Sieben-Schritte-Verfahrens in ein einzelnes Bild zu projizieren und die projizierten Bilder der drei Kanäle automatisch zu einem RGB-Bild zusammenzufügen. Anschließend verketten Sie die zusammengefügten Bilder in Schichten, um ein Montagebild des gesamten Schnitts zu erzeugen. Ordnen Sie einzelne Silberpartikel und Tetramer-Färbungen mit Zellen in der Montage mithilfe von Metamorph oder Photoshop zu.

Weisen Sie die XY-Koordinaten der Zentren oder OID der virus-RNA-positiven und Tetramer-positiven Zellen zu. Exportieren Sie die OID-Daten als numerische Werte für jede Zelle in Excel-Dateien, und verwenden Sie die in den Excel-Dateien gesammelten Daten, um die Verhältnisse von Immun-Effektor- oder E-Zellen zu virusbedingten Ziel- oder T-Zellen aus der Gesamtanzahl der Tetramer-positiven und virus-RNA-positiven Zellen im Schnitt zu ermitteln, um die räumlichen Beziehungen zwischen Tetramer-positiven und RNA-positiven Zellen abzubilden. Kopieren und fügen Sie die entsprechenden Diagramme aus den Excel-Dateien in ein Photoshop-Dokument in Photoshop ein.

Verringern Sie die Deckkraft einer Ebene, um die Gitter auszurichten und zu skalieren, sodass sie übereinstimmen; wählen Sie dann die Farbe aus und kopieren und fügen Sie sie in eine neue Ebene ein. Die Positionen der blauen RNA-positiven Zellen – verwerfen Sie die Ebene, die zum Ausrichten der Gitter verwendet wurde – und die Positionen der Tetramer-positiven und viral-RNA-positiven Zellen werden im vereinheitlichten Bild sichtbar. Mithilfe der hier gezeigten ISTH-Methode können wir die Immunantwort auf eine SIV-Infektion nach intravaginaler Inokulation an dieser Eintrittsstelle sowie in den lymphatischen Geweben verfolgen, in die sich die Infektion ausbreitet.

Es gibt große Mengen infizierter Zellen an diesen Gewebestellen zehn Tage nach der Infektion, aber noch bis zu drei Tage später sind grün angefärbte, CD8-positive Zellen vorhanden, jedoch noch keine rot angefärbten, SIV-spezifischen Tetramer-positiven Zellen. Die Immunantwort setzt somit zu spät ein, um die Infektion zu beseitigen.

Jedoch ist drei Wochen nach der Infektion eine Abnahme der infizierten Zellen deutlich sichtbar, insbesondere am Eintrittsportal. Wir verwendeten ISTH, um zu zeigen, dass das Ausmaß der Reduktion mit der räumlichen Nähe und den relativen Zahlen tetramerpositiver immunvermittelter Effektorzellen korreliert war. N-S-I-V-R-N-A-positive Zielzellen, wir nennen dies das in-vivo-E-zu-T-Verhältnis.

Die räumlichen Beziehungen lassen sich mit dieser Methode leicht veranschaulichen, wobei Effektorzellen rot und virale Zielzellen blau dargestellt werden, wie hier im infizierten Lymphknoten gezeigt. Viele Effektor- und Zielzellen befinden sich in unmittelbarer Nähe zueinander; es gibt Bereiche, in denen mehrere Effektorzellen eine einzelne S-I-V-R-N-A-positive Zelle umgeben, während in anderen Bereichen eine S-I-V-R-N-A-positive Zelle allein steht. Das Verhältnis von ETT wird einfach berechnet, indem die Positionen der Zellen bestimmt und die Anzahlen jeder Zellart in der Excel-Datei erfasst werden.

Die beste Kontrolle der Virusinfektion korreliert mit einem großen Überschuss an roten Effektorzellen gegenüber grünen Zielzellen im Verhältnis von 43 zu eins. In diesem Fall waren im Gebärmutterhals und in der Vagina, wo die Infektion begann, die E:T-Verhältnisse in den Lymphknoten niedriger. Die positive Korrelation zwischen hohen E:T-Verhältnissen und der Verringerung der Viruslast ab dem Höhepunkt zeigt, dass eine stärkere Immunantwort am Eintrittsort zu einer besseren Kontrolle der Infektion führt.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man spezifische CDAT-Zellen und virusinfizierte Zellen gleichzeitig *in situ* nachweisen kann. Diese Technik ermöglicht es uns, antigenspezifische T-Zellen und virusinfizierte Zellen in Geweben simultan zu visualisieren. Diese Methode kann angewendet werden, um vakzininduzierte CD8-positive T-Zellen sowie andere Wechselwirkungen zwischen Pathogenen und Wirt zu bewerten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

Es ist wichtig, alle Reagenzien vor der Hybridisierung RNA-frei zu halten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.