Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

Der schrittweise Prozess zur Einschließung von Zellen beginnt mit der Vorbereitung und Sterilisation von Hydrogel-Formen und anderem Material, gefolgt von der Isolierung der Zellen in einzelne Populationen in Röhrchen für jeden Gel-Set. Anschließend erfolgt die Vernetzung in Gegenwart der Zellen, gefolgt von einer Inkubationsphase in vitro oder in vivo. Die nachgeschaltete Analyse des Zellverhaltens kann Tests auf Vitalität, Morphologie, Proliferation und Differenzierung umfassen.

Hallo, ich bin Amidio Kahan aus dem Labor von Dr. Jason Burdick am Department für Bioingenieurwesen der University of Pennsylvania. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur zellulären Einschließung in 3D-Hydrogelen für das Gewebeengineering. Mithilfe dieses Verfahrens untersuchen wir die Auswirkungen der Zusammensetzung und Struktur von Hydrogelen auf das Verhalten eingeschlossener Zellen.

Beginnen wir also. Bereiten Sie zunächst eine 0,5-%-Gewichtslösung des Photoinitiators Air-Cure 2 9 5 9 oder I 2 9 5 9 in PBS vor. Mischen Sie die Lösung und inkubieren Sie sie zwei bis drei Tage im Dunkeln bei 37 Grad Celsius.

Wenn fertig, die Lösung mit einem Spritzenfilter sterilisieren und bei Raumtemperatur lagern. Anschließend mithilfe eines Tabellenkalkulationsprogramms wie Microsoft Excel die benötigte Menge an Polymer und Vernetzer berechnen, wie gezeigt. Hier ist Hyaluronsäure dargestellt, die mit Acrylat-reaktiven Gruppen funktionalisiert wurde.

Berechnen Sie außerdem die Menge des Peptids mit der funktionellen adhäsiven Domäne, das die Aminosäuren Cystin, Arginin, Glycin und Aspartat enthält. Das Cystin dient der Verankerung am Polymer. Nachdem nun die erforderlichen Mengen an Polymer, Vernetzer und Pent bestimmt wurden, wiegen Sie diese ab und geben Sie jede Komponente in ein Eppendorf-Röhrchen.

Passe die Berechnungstabelle entsprechend an. Für die tatsächliche Masse des erhaltenen Polymers fortfahren, um Giele zu präparieren. Verwende eine Rasierklinge, um die Spitzen einzeln verpackter steriler Materialien abzuschneiden.

Eintausend-Milliliter-Einwegspritzen. Stellen Sie sicher, dass ein ebener Schnitt für Formen angefertigt wird, die zur Fotomusterung von Gele verwendet werden sollen. Sterilisieren Sie abschließend die Spritzenformen, EOR-Röhrchen mit geöffneten Verschlüssen und alle weiteren erforderlichen Materialien, indem Sie diese 30 Minuten lang unter eine keimabtötende Lichtquelle im biologischen Sicherheitswerkbank stellen.

Nach Abschluss der Sterilisation fahren Sie mit der Zellpräparation unter Verwendung des sterilisierten Versuchsgeräts fort. Arbeiten Sie im Sicherheitswerkbank und geben Sie steriles TEA zum Polymer, das bei der mical-Typ-Vernetzung verwendet wird, sowie steriles PBS zum Polymer, das bei der Vernetzung durch freie Radikale verwendet wird. Geben Sie passenden Puffer zu den Röhrchen mit den seitlich gebundenen Moiety-Resten hinzu und wirbeln Sie sie im Vortex.

Um die hängende Gruppe aufzulösen, die über ein Thiol einer INE-Gruppe am Peptid an die alkylierte Hyaluronsäure bindet, um die hängende Gruppe an das Polymer zu heften, wird diese zur Polymerslösung gegeben und mit Parafilm abgedichtet. Kurz vortexen und bei 37 Grad Celsius unter Rühren inkubieren. Während der Zellpräparation, während die hängende Gruppe anbindet, bereiten Sie die zu umhüllenden Zellen vor, entweder Tryis, humane mesenchymale Stammzellen oder HMCs, indem Sie sie mit PBS waschen.

Anschließend mit Trypsin eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren, das Trypsin entfernen und weitere fünf Minuten bei 37 Grad inkubieren. Danach HMSC-Wachstumsmedium hinzufügen, um das Trypsin zu neutralisieren und die Zellen von der Oberfläche der Platte zu lösen. Die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.

Trennen Sie die gezählten Zellen in Portionen auf, die die geeignete Anzahl für jeden Satz Gele enthalten. Für einen Satz von drei 50-Mikroliter-Gele mit einer Dichte von 10 Millionen Zellen pro Milliliter trennen Sie 1,5 Millionen Zellen in ein einzelnes kegelförmiges Reagenzglas ab. Bereiten Sie aufgrund der zeitlichen Abfolge nicht mehr als vier Gele in einem einzelnen Satz vor.

Zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 500 RCF für sechs Minuten. Während die Zellen bei Raumtemperatur abzentrifugieren, bereiten Sie die Polymerisationsmischung für die mical edition-Vernetzung vor. Geben Sie Puffer zum Vernetzer hinzu, um die geeignete Konzentration zu erreichen.

Fügen Sie für die lichtinduzierte radikalische Vernetzung die zuvor hergestellte I 2 9 5 9-Lösung der Polymerlösung hinzu. Verwenden Sie 10 % des Gesamtvolumens der Gelzubereitung, um eine endgültige Initiator-Konzentration von 0,05 % Gewicht zu erreichen. Nun sind die Zellen und das Polymerisationsgemisch bereit für die Einschließung im Hydrogel.

Beginnen Sie damit, die Flüssigkeit von den Zellen nach der Zentrifugation abzusaugen. Warten Sie, bis die Flüssigkeit nach dem ersten Absaugen abgesetzt hat, und saugen Sie erneut ab, um so viel Medium wie möglich zu entfernen, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit der Polymerslösung, um Luftblasenbildung zu vermeiden.

Pipettieren Sie die Lösung langsam etwa 10 Mal auf und ab, was ausreichen sollte, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Verwenden Sie für die Mical-Typ-Additionsreaktion eine Pipettenspitze mit großem Öffnungsdurchmesser, um das entsprechende Volumen der Vernetzungslösung zur Polymerzelle hinzuzufügen. Mischen Sie. Stellen Sie die Pipette auf das gewünschte individuelle Gelvolumen ein.

Pipettieren Sie die Lösung mehrmals auf und ab, um sie zu homogenisieren, und füllen Sie sie in die Spritzenkopfformen. Führen Sie diesen Schritt zügig durch, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, und lassen Sie 10 bis 30 Minuten im Kulturschrank zur Vernetzung inkubieren. Für die lichtinduzierte radikalische Vernetzung.

Geben Sie das geeignete Volumen in Spritzenformen ab. Setzen Sie die Spritzen einer UV-Bestrahlung für eine radikalische Vernetzung mit einer Expositionszeit von 10 Minuten bei 365 Nanometern aus. Eine UV-Lichtintensität von vier Milliwatt pro Quadratzentimeter ist üblich für ACRL-funktionalisierte Polymere.

Führen Sie den Schritt schnell durch, um das Absinken der Zellen vor der Bestrahlung mit UV-Licht zu minimieren. Nach der Vernetzung tauchen Sie die Gele in die Vertiefungen einer Zellkulturplatte, die Kulturmedium zur Inkubation und Analyse enthält. Die Vernetzung des Hydrogels kann auch nacheinander erfolgen.

Zunächst wird der funktionalisierte Farbstoff metholierter Rumine in die Gelmatrix bis zu einer Endkonzentration von 20 Nanomolar zugegeben. Der Farbstoff ermöglicht die Visualisierung der Musterung, da er bevorzugt in radikal vernetzten Bereichen des Gels eingebaut wird. Anschließend wird die Mikrotyp-Polymerisationsreaktion gestartet, die einen Bruchteil der theoretischen Vernetzungen für das Folgende ergibt.

Bei der vernetzenden Einwirkung von freien Radikalen muss eine mit einem Programm wie Adobe Photoshop oder Illustrator entworfene Maske verwendet und direkt auf Transparenzmasken gedruckt werden. Die Maßangaben der Maske müssen der runden Spritzenoberseite entsprechen. Mit sterilisierten Pinzetten wird eine sterile Maske direkt auf die Geloberfläche aufgebracht und anschließend dem Licht ausgesetzt, um das Gel zu vernetzen.

Weiterhin gezeigt sind hier HMCs in auf HA basierenden Hydrogelen eine Stunde nach der Einschließung. Da synthetisierte Hydrogele typischerweise transparent sind, können Zellen mittels Lichtmikroskopie auf ihre Morphologie hin untersucht werden. Dieselben Zellen wurden 24 Stunden nach der Einschließung mittels eines fluoreszierenden Live-Dead-Färbekits auf ihre Vitalität hin analysiert.

Wir verwendeten Calcium M, um lebende Zellen nachzuweisen, und Atherium-Homodimer für tote Zellen und beobachteten eine Vitalität von über 95 %. Außerdem verwendeten wir den Alamar-Blue-Assay, um das Ausmaß der Zellproliferation zu bestimmen, das anhand der Stoffwechselaktivität der Zellen gegenüber dem Assayreagenz gemessen wird, was zu einer Farbänderung führt. Die Zellfärbung wurde an H-HMCs sieben Tage nach der Einschließung in ein abbaubares und adhäsives, auf HA basierendes Hydrogel unter Anwendung standardmäßiger Fixierungs- und Permeabilisierungsverfahren durchgeführt.

Das zelluläre Aktin ist mit fluoresceinmarkiertem Phalloidin sichtbar und die Kerne sind mit DAPI angefärbt. Die Immunfärbung gegen Cullin dient der Visualisierung von fokalen Adhäsionen innerhalb der Hydrogel-Matrix. Die histologische Färbung wird nach Dehydrierung, Paraffin-Einbettung und Schnittung der Hydrogels nach Standardprotokollen an radikalpolymerisierten, HMSC-enthaltenden HA-Hydrogelen durchgeführt.

Nach einer Woche in Kultur wurden die Proben mit Hämatoxylin zur Markierung der Zellkerne, mit ASIN zur Markierung des Bindegewebes A sowie mit blauen Farbstoffen für Glykosaminoglykane gefärbt. Echtzeit-PCR wird verwendet, um die Differenzierung eingekapselter Stammzellen zu quantifizieren. Nach Subtraktion des Hintergrundsignals wird die Expressionsstärke eines Zielgens anhand der Zyklenzahl bestimmt, bei der die Schwellenfluoreszenz im Vergleich zu einem passiven Referenzsignal erreicht wurde, das ein konstitutiv aktives Housekeeping-Gen darstellt. So haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie man Zellen in 3D-Hydrogelen einbettet und das Verhalten von Zellen in solchen Gele untersucht.

Bei Verwendung dieser Verfahren ist es wichtig, die vollständige Sterilität der Materialien sicherzustellen, entweder indem sterile Pufferlösungen und Reagenzien langfristig aufbewahrt werden oder durch Sterilisation mit der keimabtötenden UV-Lampe. Das war's. Vielen Dank fürs Mitmachen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.