Engineering zellpermeablen Protein

Die gezielte Beeinflussung der zellulären Funktion kann über die klassischen Ansätze der DNA-Transfektion oder der viralen Transduktion erfolgen, die in den letzten 15 Jahren etabliert wurden. Eine weitere Methode hat sich entwickelt: Biologisch aktive Proteine können mithilfe kleiner Peptide, die an das Protein der Interesse fusioniert sind und die zelluläre Aufnahme fördern, direkt in Säugetierzellen eingebracht werden.

Da keine DNA verwendet wird, wird das Risiko einer Exertionsagenese vermieden. Im Gegensatz zu den oben genannten klassischen Methoden ermöglicht die Proteintransduktion die dosierbare Zufuhr von Proteinen.

Außerdem können kleine Zellpopulationen sowie nicht teilende Zellen, wie postmitotische Neuronen, moduliert werden. Um rekombinantes Protein effizient zu exprimieren, empfehlen wir die Verwendung des Paciz-Vektorsystems. Dabei handelt es sich um ein modulares Vektorsystem, das aus einer endterminalen und einer C-terminalen Variante besteht.

Beide Vektoren ermöglichen die einfache Einfügung Ihres Gens von Interesse zur Zwecken der Reinigung. Ein Histidin-Tag sowie eine Protein-Transduktionsdomäne sind integriert. Im vorliegenden Fall sorgt die Berührung durch das HI-Virus für die Förderung der zellulären Aufnahme und Verteilung innerhalb der Zelle.

Ein nuklearer Lokalisierungssignal vervollständigt den Vektor aus Kontrollgründen, wobei Fusionstags einfach entfernt werden können. Zudem kann die Anordnung dieser Tags einen erheblichen Einfluss auf die Eigenschaften der Fusionsproteine haben. Die Auswirkungen auf Ausbeute und Reinheit sowie Verkaufsfähigkeit und biologische Funktion sind nicht vorhersehbar.

Hallo, mein Name ist Bernard Mus und ich arbeite in der Gruppe für Stammzell-Engineering am Institut für Rekonstruktive Neurobiologie in Bonn, Deutschland. Hallo, mein Name ist Christoph P und ich bin ebenfalls Mitglied des Hoover-Labors. Unsere Arbeitsgruppe nutzt die Proteintransduktionstechnik intensiv, um biologisch aktive Proteine direkt in verschiedene Säugetierzellen einzubringen, und heute möchten wir Sie durch den Prozess der Expression und Reinigung in und aus E. coli führen.

Danach möchten wir Ihnen zeigen, wie man ein zellständiges Fusionsprotein in der Zellkultur anwendet, um den gesamten Prozess der Expression, Reinigung und Anwendung zu veranschaulichen. Wir nutzen die ortsspezifische Rekombinase Cre, um genetisch mausische Stammzellen zu modifizieren. Okay. Okay. Beginnen wir.

Um die Übernachtkultur zu impfen, verwenden wir bereits transformierte Bakterien, die in einer Glycerinlagerprobe bei minus 80 Grad Celsius aufbewahrt werden. Diese Bakterien enthalten bereits den Vektor zur Deca-Rekombination. Mithilfe einer Pipettenspitze kratzen wir eine kleine Menge der Bakterien auf die Pipettenspitze und geben sie in das Becherglas mit der Übernachtkultur.

Die Übernachtkultur besteht aus LB-Medium, das mit Glukose in einer Endkonzentration von 0,5 % und 50 Mikrogramm Kohlensäureinsulin pro ml ergänzt wurde. Das Becherglas wird dann in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius gestellt, um die Expression des ortsspezifischen Rekombinase Cre zu ermöglichen. Für unsere großmaßstäbliche Expressionskultur verwenden wir vorgewärmtes TB-Medium.

Um die Expression zu beschleunigen, empfehlen wir die Verwendung von TB-Medien, die auf 37 Grad Celsius erwärmt wurden, da dies der Temperatur während der Expression des rekombinanten Proteins entspricht. Anschließend fügen wir Glukose den TB-Medien in einer Endkonzentration von 0,5 % hinzu. Die Glukose verhindert eine erhöhte basale Expression des Fusionsproteins während des Wachstums der Expressionskultur vor der Induktion. Schließlich wird Ampicillin der Expressionskultur in einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro ml zugesetzt, um eine reine Kultur sicherzustellen, die nur Bakterien enthält, welche noch das Plasmid tragen, das für das Decree-Protein kodiert.

Wir können nun unsere Übernachtkultur entnehmen und die Expressionskultur im Verhältnis von eins zu 50 ansäen. Die Bechergläser werden anschließend in einen Inkubator überführt, der bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius läuft. Sie sollten regelmäßig Proben entnehmen, um die optische Dichte zu messen.

Sobald die Kultur eine optische Dichte von 1,5 erreicht hat, werden die Bakterien mit einer Endkonzentration von 0,5 Millimolar IPTG induziert. Nach einer Stunde Induktion wird die Expressionskultur in Röhrchen überführt und anschließend durch Zentrifugation geerntet. Zu diesem Zweck verwenden wir einen SLA-3000-Rotor.

Die Zentrifuge läuft mit einer Geschwindigkeit von 5.000 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Die Überstände werden dann verworfen, und das Bakterienpellet kann unbegrenzt bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Die gefrorenen Pellets werden in Lizza-Puffer resuspendiert, einem Puffer entsprechend einem Liter Expressionskultur.

Wir verwenden 10 ml Lizza-Puffer und warten etwa 15 Minuten, bis die Lösung homogen wird. Anschließend werden je Milliliter Suspension 1 mg Lysozym zugegeben. Die Lösung wird 20 Minuten lang gemischt, um dem Enzym Zeit zu geben, die Bakterien zu lysieren.

Anschließend wird Benson Nase in einer Verdünnung von 1:1000 für weitere 15 Minuten zugegeben, wodurch die DNA geschnitten wird und eine nicht viskose Lösung entsteht. Abschließend wird ein Sonierer verwendet, um die Zellen vollständig zu lysieren. Das Programm läuft eineinhalb Minuten lang mit einer Leistung von 45 % nach Abschluss der Zertifizierung.

Denken Sie daran, bei jedem Schritt eine Probe zu entnehmen, sei es der rohe Lysat oder die SDS-Page-Analyse der Reinigung. Nun ist es sehr wichtig, pro ml Suspension ein ml eiskaltes TSB-Puffer hinzuzufügen, da Dekree-Protein dazu neigt, in der Glycerinlagerlösung auszufällen. Wenn Sie diesen Schritt überspringen möchten, wird die Lösung kurz vermischt und der Rohextrakt ist nun zur Zentrifugation bereit.

Hierfür verwenden wir einen SS-34-Rotor. Die Zentrifuge läuft bei 17.000 U/min für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach Beendigung wird das Überstand-S-Supernatant vorsichtig in frische 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt.

Geben Sie nun Nickel-Anti-A-Suspension zum überstehenden Nickel hinzu. Anti A ist ein entscheidender Reagenzstoff zur korrekten Reinigung der Histidin-Tech-Fusionsproteine. Das Histidin bildet einen Komplex mit den Nickelionen, wodurch eine Affinitätsreinigung ermöglicht wird. Schütteln Sie die Reaktionsgefäße nun sanft 60 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.

Nach einer Stunde können Sie nun die Suspension auf 20 ML-Säulen auftragen und die Lösung durch Schwerkraft ablaufen lassen. Bei großtechnischen Herstellungen ist es sinnvoll, die Suspension auf mehrere Säulen aufzuteilen. Anschließend waschen wir die Säule zweimal mit einem Puffer, der 15 Millimolar Innersole enthält.

Die Menge des verwendeten Puffers hängt vom Harzvolumen ab. Zwei MLS Nickel-NTA entsprechen einem ml Harz für die Waschung. Nachdem wir fünf Harzvolumina Waschpuffer auf die Säule gegeben haben, sind wir nun bereit, unser Protein zu eluieren.

Daher verwenden wir einen Elutionspuffer mit einer Konzentration von 250 Millimolar Immuno. Achten Sie darauf, wie sich die Farbe des Harzes in Richtung Grün verändert. Aufgrund der hohen Konzentrationen des CRE-Proteins wird die OID-Fraktion manchmal braun.

Um dies zu verhindern, mischen Sie die Lösung und geben zusätzliches Lysepuffer hinzu; anschließend werden alle Fraktionen vereinigt und in ein Lyserohr überführt. Die Lyse entfernt das Ole; der erste Dialyse-Schritt erfolgt gegen einen Puffer mit hoher Salzkonzentration. Nach einer Stunde wird der Puffer mit hohem Salzgehalt ausgetauscht, und das Dialyseverfahren wird über Nacht durchgeführt.

Am nächsten Tag wird das Dialyseschläuchchen aus dem Puffer mit hohem Salzgehalt entnommen und in einen Glycerinpuffer überführt. Nach drei bis fünf Stunden wird der Glycerinpuffer ausgetauscht und die Dialyse erneut über Nacht durchgeführt. Die Dialyse gegen Glycerinpuffer führt zu einer mindestens dreifach konzentrierten Stammlösung.

Die Stammlösung kann nun mehrere Jahre lang bei minus 20 Grad Celsius ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden. Zur Qualitätssicherung können Sie Ihre gesammelten SDS-PAGE-Proben auf ein Gel laden und anschließend anfärben. Bei Kamasi ist das Cree-Fusionsprotein als hervorstehendes Band in der OID-Fraktion nachweisbar. Um die geeignete Konzentration der Crew-Rekombination zu verwenden, sollten Sie die Konzentration mittels Redford-Assay bestimmen.

So wenden Sie permanente Proteine in Säugetierzellen an. Bereiten Sie zunächst Ihre Zielzellen vor, um die höchsten Proteintransduktionseffizienzen zu erzielen. Sehen Sie Einzelschichtzellen mit einer Dichte aus, die am nächsten Tag zu einer Zellbedeckung von 80 bis 90 % führt, falls Ihre Zielzellen ja-Zellen sind, die in kompakten Kolonien wachsen.

Trennen Sie die Zellen somatisch und bringen Sie sie fünf Stunden im Voraus in eine Einzelzell-Suspension. Es ist wichtig, vor der Proteintransduktion eine Einzelzell-Suspension herzustellen, da andernfalls nur Luftzellen an der Oberfläche einer Kolonie transfiziert werden können. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Luftzellen kurz zuvor mit PPS, bevor Sie die Behandlung versuchen.

Entfernen Sie das restliche Yes, grobe Medium, das Serum enthält. Nachdem Sie die Zellen mit der PPS-Überlagerung abgesaugt haben, lassen Sie sie drei bis fünf Minuten lang tropfen und inkubieren. Überprüfen Sie nun unter dem Mikroskop, ob alle Kolonien in Einzelzellen aufgelöst sind.

Die gerade genannten Gründe machen dies zu einem entscheidenden Schritt für die Proteintransduktion in yes-Zellen. Überführen Sie die abgelösten Zellen in ein Reagenzglas. Stellen Sie das Reagenzglas in eine Zentrifuge und pelletieren Sie die Zellen. Aspirieren Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen.

P in Wachstumsmedium verdünnen Sie die Zellen auf die geeignete Zellanzahl. Das hängt natürlich von der Größe der Zellkultur ab. Inkubieren Sie die Zellen in der Schale weitere fünf Stunden bei Luft.

Dadurch erhalten die Zellen genügend Zeit, um sich am Boden anzulagern und adherent zu wachsen. Drei Klassen Reihenbestand können bei minus 20 Grad mehr als zwei Jahre lang gelagert werden. Bei der Arbeit mit rekombinantem Zell-Dauer-Fusionsprotein ist es sehr vorteilhaft, über eine solche Stammlösung zu verfügen, die nach Bedarf verwendet werden kann.

Während man darauf wartet, dass die Zellen an der Schale anhaften, kann man das C-Transduktionsmedium einfach herstellen, indem man ein geeignetes Volumen des Zell-ständigen Kriechproteins aus der Cholesterin-Stammlösung in das eigene Medium verdünnt. Da die Clare-Stammlösung noch nicht steril ist, muss das Trans-Medium vor der Anwendung steril filtriert werden. Wir empfehlen die Verwendung einer Spritze, die auf einen Lappen-Protein-Bindungsfilter aufgeschraubt werden kann.

Die endgültige CREEK-Konzentration hängt von der Zelltyp oder den Zusätzen im Kulturmedium ab. Beispielsweise hat Serum einen stark negativen Einfluss auf die Transduktionseffizienz. Dies kann durch die Verwendung von serumfreiem Medium oder durch eine erhöhte CREEK-Konzentration kompensiert werden.

Wir ermitteln die optimalen Bedingungen für die höchste Rekombinationseffizienz. Erhöhen Sie die Decree-Konzentration ausgehend von 0,5 bis hin zu 10 Mikromolar. Wir empfehlen, verschiedene Inkubationszeiten zwischen sechs und 18 Stunden zu testen.

Nach fünf Stunden Inkubation entnehmen Sie Ihre Zielzellen und aspirieren das Kreuzmedium. Anschließend ersetzen wir es durch Protein-Transduktionsmedium, geben die Zellen zurück in den Inkubator und inkubieren sie über Nacht. Kurz waschen Sie die D-Zellen mit PPS und wechseln das Protein-Transduktionsmedium in normales ES-Medium.

48 Stunden nach der Inkubation kann die stabile Genexpression in Zellen mittels xul nachgewiesen werden. Färbung von Zellen mit positivem bega-Phänotyp haben erfolgreich durch die standortspezifische Rekombination genetisch verändert worden. Cree den Bericht.

Die Zellen enthalten den CRE-vermittelten Lae-Konstrukt nach prämediärer Rekombination. Eine durch P-Flossen flankierte Stoppsequenz wird ausgeschnitten und ein Luxe-Reportergen, das durch einen Team-Promotor angetrieben wird, wird aktiviert. Um die Rekombinationseffizienz in vorbehandelten Reporterkieselzellen zu bewerten, müssen die Zellen fixiert werden.

Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Überlagern Sie die Zellen mit 4 % PFA und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Danach waschen Sie die Zellen erneut dreimal mit PBS. Nach dem Absaugen des PBS aus dem letzten Waschschritt geben Sie Xal-Färbelösung in die Vertiefungen und inkubieren die Zellen über Nacht bei 37 Grad in einem Inkubator.

Am nächsten Tag kann die Beal-Aktivität durch blau gefärbte Zellen überwacht werden. Die Rekombinationseffizienz kann anhand der Anzahl blauer Kolonien bestimmt werden. Unter optimalen Bedingungen sollte eine Rekombinationseffizienz von mehr als 90 % erreichbar sein. Gut, heute haben wir Ihnen gezeigt, wie man die Expression und Reinigung einer ortsspezifischen Query-Rekombination aus E. coli durchführt.

In dieser Machbarkeitsstudie konnten wir eine Rekombination in den meisten Salzen induzieren. Gut, das war's. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.I.