Mess-Diffusionskoeffizienten über Zwei-Photonen-Fluorescence Recovery After Photobleaching
26. Februar 2010
In diesem Artikel beschreiben wir das Verfahren zur Messung von Diffusionskoeffizienten mittels Multi-Photonen-Fluoreszenz-Erholung nach Ausbleichen. Wir werden durch die Angleichung der Laser entlang der optischen Pfad zu der Probe und Bestimmung der richtigen experimentellen Parameter beginnen, dann weiter generiert und schließlich passende Fluoreszenz Erholung Kurven.
Die Mehrphotonen-Fluoreszenz. Die Erholung nach Photobleichen lässt sich leicht an einer frei diffundierenden Probe fluoreszierender Farbstoffmoleküle demonstrieren. Zunächst wird ein Laserstrahl mit geringer Intensität in die Probe geleitet, um ein Referenzniveau der Fluoreszenz von den Molekülen D innerhalb des Fokusvolumens des Lasers zu erzeugen.
Danach wird ein kurzer, intensiver Laserblitz zur Auslöschung eines Teils der Farbstoffmoleküle innerhalb des Fokalvolumens gesendet. Schließlich wird der Laserstrahl auf die zuvor niedrige Intensität abgeschwächt, und die Fluoreszenz wird überwacht, während die ausgelöschten Moleküle nach außen diffundieren und von noch fluoreszierenden Molekülen aus dem Bereich außerhalb des Fokalvolumens ersetzt werden. Die sich ergebende Fluoreszenz als Funktion der Zeit wird analysiert, um den Diffusionskoeffizienten zu bestimmen.
Hallo, ich bin Kelly Sullivan aus dem Labor von Edward Brown am Department für Biomedizinische Technik der University of Rochester. Heute zeigen wir Ihnen, wie man die Multiphotonen-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleaching durchführt. In unserem Labor verwenden wir diese Technik, um die Diffusion in biologischen Systemen sowohl in vitro als auch in vivo zu untersuchen.
Beginnen wir also. Stellen Sie zunächst die gewünschte Laserwellenlänge ein und setzen Sie den entsprechenden Filter vor die Photomultiplier-Röhre oder PMT. Danach stellen Sie die Laserleistung auf 200 Milliwatt oder weniger ein, um Schäden an der pcal-Zelle zu vermeiden.
Es gibt zwei Spiegel, die in einer Viereranordnung stromaufwärts der pcal-Zelle ausgerichtet sind. Diese Spiegel sind notwendig und ausreichend, um den Laserstrahl durch die pcal-Zelle auszurichten. Stellen Sie den Spannungs-Offset am Vorspannungsregler der pcal-Zelle auf null ein und justieren Sie den Laserstrahl durch die pcal-Zelle so, dass der Laser in den vorderen und hinteren Fenstern zentriert ist.
Verwenden Sie den stromaufwärts gelegenen Spiegel in der Abbildung vier, um den Strahl im vorderen Fenster zu zentrieren, und den stromabwärts gelegenen Spiegel in der Abbildung vier, um den Strahl im hinteren Fenster zu zentrieren. Stellen Sie nun die Spannung über dem pcal-Zellenkristall auf den maximalen Wert ein. Der geeignete Wert ist wellenlängenabhängig und kann im Bedienungshandbuch der pcal-Zelle gefunden werden.
Stellen Sie die Spiegel in der Abbildung vier stromaufwärts der pcal-Zelle so ein, bis die Ausgangsleistung der pcal-Zelle maximiert ist. Schalten Sie nun die Spannung über dem Kristall auf null und stellen Sie den Spannungs-Offset am Bias-Regler ein, um die Ausgangsleistung der pcal-Zelle zu minimieren. Stellen Sie die auf die pcal-Zelle auftreffende Laserleistung auf den für das Experiment erforderlichen Wert zurück.
Nun wechseln Sie zum Mikroskop und stellen Sie eine klare visuelle Fokussierung auf eine standardisierte fluoreszierende Probe ein. Hier verwenden wir fixierte fluoreszierende Pollenkörner. Nach dem Fokussieren verschließen Sie das Mikroskop und stellen die Laserleistung auf ein geeignetes Niveau für die Bildaufnahme der Probe ein, indem Sie die Spannung über dem PCAL-Zellkristall verändern.
Schalten Sie abschließend die Lichter aus und schalten Sie die PMT ein. Starten Sie einen wiederholten Bildscan der standardisierten Probe und justieren Sie die Spiegel stromabwärts der pcal-Zelle, bis ein scharfes Bild der Probe erhalten wird. Nun betrachten wir, wie sich sichere Monitorleistungen für den Fokus innerhalb der Probe bestimmen lassen.
Für dieses Video verwenden wir eine wässrige Farbstoffprobe, die in einer Vertiefung eines Objektträgers gehalten und mit einem Deckglas abgedeckt ist. Dämpfen Sie den Laser auf eine niedrige, aber ausreichende Leistung ab, um Fluoreszenz in der Probe zu erzeugen. Verschließen Sie das Mikroskop und leiten Sie das Ausgangssignal des PMT zum Photonenanzähler um.
Schalten Sie die Lichter aus, schalten Sie die PMT ein und starten Sie einen Punkt-Scan in der Mikroskop-Software. Stellen Sie den Photonenzähler so ein, dass er über einen Zeitraum integriert, der deutlich länger ist als die erwartete Fluoreszenzrekuperationszeit, und nehmen Sie eine angemessene Anzahl von Datenpunkten auf. Erhöhen Sie die Leistung und nehmen Sie eine weitere Serie von Photonenzähldaten auf.
Setzen Sie die Erhöhung der Leistung fort, bis der Anstieg der Photonenzählraten deutlich abnimmt. Bezogen auf das Leistungsanstiegsdiagramm, dem Logarithmus der Photonenzählraten als Funktion des Logarithmus der Leistung. Jede Abweichung von einer Steigung von zwei weist auf Bleichen hin.
Wählen Sie während der Überwachung eine angemessene Monitorleistung unterhalb dieser Abschaltgrenze. Bestimmen wir nun die Eingabeparameter für den Multikanalzähler und den Impulsgenerator. Am Impulsgenerator.
Stellen Sie die Vorspurzeit auf das Eineinhalb- bis Zweifache der erwarteten Halbwertszeit der Erholung und die Bleichzeit auf ein Zehntel der erwarteten Halbwertszeit der Erholung am Skalierer ein. Wählen Sie die Binschrittweite etwa auf die Hälfte der Bleichdauer und legen Sie die Anzahl der Bins pro Aufzeichnung so fest, dass das Produkt aus der gewählten Binschrittweite und der Anzahl der Bins pro Aufzeichnung größer ist als die erwartete vollständige Erholungszeit. Leiten Sie die Vorspur- und Bleichzeiten zur Impulsgeneratorschaltung zurück und stellen Sie die Frequenz der Vorspur- und Bleichsequenz auf einen Wert ein, der geringfügig kleiner ist als der Kehrwert des Produkts aus Binschrittweite und Anzahl der Bins pro Aufzeichnung.
Stellen Sie abschließend die Anzahl der Aufzeichnungen pro Scan auf dem Skaler basierend auf der Signalintensität bei Ihrer gewählten Monitorleistung ein. Stellen Sie nun die Monitorleistung auf einen sicheren Wert ein und die Bleichleistung auf etwa 200 Milliwatt über der während des Monitor-Bleich-Tests bestimmten Bleichschwelle. Beide Leistungen werden als unterschiedliche Spannungen an der Al-Zellkristalldichtung eingestellt, das Mikroskop schaltet das Licht aus.
Schalten Sie die PMT ein. Starten Sie einen Punkt-Scan in der Bildgebungssoftware. Anschließend starten Sie den Impulsgenerator und den Skalierer.
Um die resultierende Wiederherstellungskurve zu analysieren, markieren Sie drei wichtige Punkte: die Vor-Photobleichungs-Fluoreszenz, die Fluoreszenz unmittelbar nach der Photobleichung und die Fluoreszenz am Ende des Datensatzes. Verwenden Sie die Fluoreszenzwerte vor und unmittelbar nach der Photobleichung, um die halbe Wiederherstellungszeit genauer abzuschätzen.
Verwenden Sie nun die in früheren Schritten beschriebenen Regeln, um die Werte für die Dauer der Präbleichung und der Anregungsimpulsbreite zu aktualisieren. Nehmen Sie eine neue Kurve auf und justieren Sie die Parameter weiter, bis die resultierende Kurve eine starke Bleichung und eine gleichmäßige Erholung aufweist. Überprüfen Sie eine Sättigung der Anregung, indem Sie den Logarithmus des Bleichungstiefenparameters in Abhängigkeit vom Logarithmus der Leistung auftragen.
Jede Abweichung von einer Steigung von zwei weist auf eine Anregungssättigung hin. Wählen Sie eine Bleichleistung, die eine starke Bleichung erzeugt, jedoch keine Sättigung verursacht. Schließlich, nachdem die geeigneten Parameter bestimmt wurden, nehmen Sie weiterhin Mehrphotonen-Fluoreszenz-Remissionskurven nach Photobleichung oder MP FP-Kurven Ihrer Probe auf.
Nun zeigen wir repräsentative Ergebnisse sowohl der rohen MP-FRAP-Daten als auch einer normalisierten MP-FRAP-Kurve, die angepasst wurde, um den Diffusionskoeffizienten zu ermitteln. Die rohen MP-FRAP-Daten weisen eine starke Bleiche und eine gleichmäßige Erholung auf. Die vollständige Erholung wird für die zweite Hälfte der Daten berichtet, um die Daten anzupassen. Zunächst normalisieren wir die Erholung auf die durchschnittliche Prä-Bleiche-Fluoreszenz und führen anschließend eine nichtlineare Kleinste-Quadrate-Anpassung durch.
Bezüglich des geeigneten Modells. Beide Datensätze wurden in wässrigem Fluorescein aufgenommen und liefern Diffusionskoeffizienten. Im Einklang mit der Literatur haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man ein Multiphotonen-Fluoreszenz-Wiederherstellungs-Experiment nach Photobleaching durchführt.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sorgfältig vorzugehen und die experimentellen Parameter, insbesondere die Bleichdauer sowie die Bleich- und Beobachtungsleistungen, innerhalb der im Protokoll festgelegten sicheren Grenzen zu halten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
In diesem Artikel wird das Verfahren zur Messung von Diffusionskoeffizienten mithilfe der Mehrphotonen-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleaching beschrieben. Der Prozess umfasst die Justage des Lasers entlang des optischen Pfads zur Probe sowie die Anpassung von Fluoreszenz-Wiederherstellungscurven.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Fluoreszenzmikroskopie
- Diffusionsmessung
- Photobleichmethoden
Hintergrund
- Die Mehrphotonen-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleichen ist eine Technik, die zur Untersuchung der molekularen Diffusion verwendet wird.
- Die Methode liefert Einblicke in die Dynamik fluoreszierender Moleküle in einer Probe.
- Das Verständnis von Diffusionskoeffizienten ist für verschiedene biologische Anwendungen unerlässlich.
- Das Verfahren ist auf frei diffundierende Proben fluoreszierender Farbstoffmoleküle anwendbar.
Zweck der Studie
- Die Vorgehensweise zur Messung von Diffusionskoeffizienten demonstrieren.
- Forschern auf dem Gebiet eine detaillierte Methodik bereitstellen.
- Das Verständnis molekularer Dynamik in biologischen Systemen vertiefen.
Verwendete Methoden
- Ein Laserstrahl mit geringer Intensität erzeugt ein Referenz-Fluoreszenzniveau.
- Ein intensiver Laserblitz photobleicht einen Teil der Farbstoffmoleküle.
- Die Fluoreszenz wird überwacht, während die photobleichten Moleküle diffundieren und ersetzt werden.
- Die Fluoreszenzrückgewinnungskurven werden analysiert, um Diffusionskoeffizienten zu erhalten.
Hauptergebnisse
- Das Verfahren misst effektiv die Diffusionskoeffizienten fluoreszierender Moleküle.
- Die Fluoreszenzrekoveriekurven liefern quantitative Daten über die molekulare Dynamik.
- Die Methode ist reproduzierbar und auf verschiedene Proben anwendbar.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis molekularer Wechselwirkungen in biologischen Kontexten bei.
Schlussfolgerungen
- Die Mehrphotonen-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleichen ist eine wertvolle Technik zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten.
- Die beschriebene Methodik kann von Forschern genutzt werden, um molekulare Dynamiken zu untersuchen.
- Weitere Anwendungen dieser Technik können unser Verständnis biologischer Prozesse vertiefen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Messung von Diffusionskoeffizienten mittels Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleichen liefert quantitative Einblicke in die molekulare Dynamik biologischer Systeme und unterstützt die Zielvalidierung sowie die mechanistische Entschärfung von Risiken in der frühen Entdeckungsphase. Die Technik ermöglicht eine reproduzierbare, markierungsfreie Beurteilung des makromolekularen Transports und liefert damit Grundlagen für die Assay-Entwicklung sowie eine höhere Vorhersagesicherheit in Workflows zur Identifizierung von Leitverbindungen. Ihre Anwendbarkeit sowohl in vitro als auch in vivo verbessert die translationale Kontinuität und verringert biologische Unsicherheiten bei präklinischen Entscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem das Diffusionsverhalten von Makromolekülen in krankheitsrelevanten Systemen quantifiziert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch direkte Messung der molekularen Mobilität in nativen oder technisch gestalteten Umgebungen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten, indem diffusionsbasierte Kenngrößen bereitgestellt werden, die mit der Zielmolekülbindung und Bindungskinetik korrelieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Bildschirmierung vor, indem die Baseline-Diffusionsparameter etabliert werden.
- Reproduzierbarkeit: Liefert quantitative, fluoreszenzbasierte Messwerte, die die Standardisierung von Assays über verschiedene Durchläufe und Labore hinweg unterstützen.
- Skalierbarkeit: Integriert sich in Automatisierungsplattformen wie LabVIEW, um die Durchsatzleistung bei Screening-Kampagnen für Wirkstoffkandidaten zu erhöhen.
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheit: Gilt für biologische In-vivo-Systeme und ermöglicht die Beurteilung der Diffusion in gewebeähnlichen Umgebungen.
- Translationskontinuität: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Arbeitsabläufe, indem konsistente biophysikalische Messgrößen über verschiedene Modellsysteme hinweg bereitgestellt werden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem molekulare Transporteigenschaften quantifiziert werden, die die Arzneimitteldistribution und den Zugang zum Ziel beeinflussen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der frühen Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis zur präklinischen Bewertung ein und liefert biophysikalische Daten, die die molekulare Gestaltung und Optimierung unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem gemessen wird, wie sich die makromolekulare Diffusion unter experimentellen Bedingungen verändert, und klärt so das Verhalten von Wegen und Zielstrukturen auf.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft von Assays durch standardisierte Messungen der Fluoreszenz-Wiederherstellung, die eine konsistente Bewertung von Verbindungen sicherstellen.
- Analytik: Erzeugt quantitative Diffusionskoeffizienten durch eine Kleinste-Quadrate-Anpassung der Wiederherstellungskurven und ermöglicht so einen objektiven Vergleich molekularer Varianten.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem Diffusionsmessungen sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden können, was die Übertragung über verschiedene Maßstäbe hinweg unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare biophysikalische Plattform zur Beurteilung molekularer Dynamik über mehrere Projekte und Zielklassen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Zuversicht bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten hinsichtlich molekularer Beweglichkeit und Wechselwirkungen reduziert werden.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher durch definierte Laserparameter, Bleichprotokolle und automatisierte Datenerfassung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Risikominderung von Zielstrukturen auf Grundlage diffusionsbasierter biophysikalischer Profile ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Zielstrukturen mit günstigen molekularen Transporteigenschaften für die nachgeschaltete Entwicklung identifiziert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Zweiphotonenmikroskopie, Photobleich-Techniken und Fluoreszenzquantifizierung.
- Hängt von der Instrumentierung ab, einschließlich gepulster Laser, Pockels-Zellen, Photonenzähler und kompatibler Scansysteme.
- Erfordert die Standardisierung von Laserleistung, Bleichdauer und Binning-Breite über verschiedene Anwender und Standorte hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übergang von wässrigen Farbstoffmodellen zu komplexen biologischen Proben wie Zellen oder Gewebe.
- Ist durch die Notwendigkeit fluoreszenter Markierung oder intrinsischer Fluoreszenz begrenzt, was eine Optimierung für Zielstrukturen mit geringer Abundanz erforderlich machen kann.
