Multicolor Durchflusszytometrie Analysen der zellulären Immunantwort in Rhesusaffen
22. April 2010
Wir demonstrieren den Nutzen des multicolor Durchflusszytometrie für detaillierte phänotypische und funktionelle Charakterisierung von insgesamt sowie Speicherprodukte Teilmengen von CD4 + und CD8 + T-Zellen in Rhesusaffen, das ideale Modell für HIV / AIDS-Impfstoff-Studien.
Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Stimulierung und Färbung peripherer mononukleärer Blutzellen oder PBMC. Für die mehrfarbige Durchflusszytometrieanalyse werden von Alec Watts isolierte PBMC aus Vollblut in Zellkulturschalen gegeben. Die Zellen werden chemisch oder biologisch stimuliert, um eine Immunantwort hervorzurufen.
Nach der Stimulation wird ein Antikörpercocktail hinzugefügt, um Zelltypen anhand exprimierter Oberflächenmarker zu identifizieren. Anschließend werden die Zellen permeabilisiert und ein anderer Antikörpercocktail wird zugegeben, um die Expression intrazellulärer Zytokine nachzuweisen; danach werden die Zellen mittels FACS analysiert, um die Zytokinprofile für spezifische Subpopulationen von PBMCs zu bestimmen. Hallo, ich bin Amy Courtney aus dem Labor von Dr. Jagan Sadasivam in der Abteilung für Immunologie am University of Texas MD Anderson Cancer Center.
Hallo, ich bin Hong, ebenfalls aus dem Labor. Heute zeigen wir Ihnen eine multizytometrische Analyse von T-Zell-Antworten. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zelluläre Immunantworten bei Reus Maca zu untersuchen.
Beginnen wir also. Starten Sie dieses Protokoll, indem Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der lebensfähigen Zellen von pbmc aus Reuss Maca nach der Trypan-Blau-Ausschlussmethode bestimmen. Arbeiten Sie dazu in einer laminaren Luftströmungskabine reus.
Suspendieren Sie die Zellen in komplettem Medium mit einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter für eine unspezifische Stimulation; geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Loch-Gewebekulturplatte. Anschließend 100 Mikroliter Medium zugeben, das PMA und CIN enthält, um ein Gesamtvolumen von 0,2 Milliliter zu erreichen, mit einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter PMA und 500 Nanogramm pro Milliliter CIN. Für die Negativkontrollvertiefungen jeweils 100 Mikroliter komplettes Medium allein hinzufügen. Die Zellen nach 1,5 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.
Fügen Sie Felden A der Kultur in einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie weitere 4,5 Stunden. Felden A wird hinzugefügt, um Zytokine im Gold-G-Apparat durch Immunfärbung sichtbar zu machen. Nach der Stimulation zentrifugieren Sie, um das Medium zu entfernen, und waschen Sie anschließend durch Zugabe von 200 Mikrolitern kaltem Flow-Waschpuffer und Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit. Wiederholen Sie diesen Waschschritt und resuspendieren Sie dann in 50 Mikrolitern Flow-Waschpuffer.
Die Zellen sind nun bereit, für die Expression von Oberflächenmarkern angefärbt zu werden, indem sie jeweils in die Vertiefungen mit den resuspendierten Zellen gegeben werden. Geben Sie einen Mikroliter des gemäß den Anweisungen des Herstellers und S zubereiteten lebend-tot-fixierbaren, aquafarbenen fluoreszierenden Reagenzfärbestoffs hinzu. Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius im Dunkeln für 30 Minuten, während die Zellen inkubieren.
Bereiten Sie die Färbungslösungen vor, die für die FACS-Analyse in Mikroröhrchen verwendet werden. Bereiten Sie zunächst einen Stammansatz vor, der die folgenden Komponenten in geeigneten Mengen enthält: titrierte, fluoreszenzmarkierte monoklonale Antikörper, Anti-CD3 PE-Cy7, Anti-CD8 Alexa 700, Anti-CD28 PerCP-Cy5.5, Anti-CD95 APC und Anti-CD4 Pacific Blue in Flow-Waschpuffer.
Bereiten Sie anschließend Kompensationskontrollen vor, die verwendet werden, um die Übersprechkoeffizienten jeder einzelnen Färbung in andere Detektoren zu bestimmen, indem Sie für jeden fluoreszenzmarkierten Antikörper einzeln ein Rohr mit Einzelfarbfärbung vorbereiten. Schließlich bereiten Sie Fluoreszenz-minus-eins- oder FMO-Färbungen vor, indem Sie alle Reagenzien mit Ausnahme des jeweils interessierenden kombinieren. Diese werden verwendet, um die Grenze zwischen einer positiven und negativen Population zu bestimmen, indem Autofluoreszenzniveaus und die in vollständig gefärbten Proben vorhandenen Daten dupliziert werden.
Nachdem die Zellen mit der Live-Dead-Färbung inkubiert wurden, waschen Sie sie einmal mit kaltem Durchfluss-Waschpuffer, um überschüssige Farbstoffe zu entfernen, und saugen Sie den Waschpuffer ab. Geben Sie dann die vorbereiteten Färbelösungen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Waschen Sie die gefärbten Zellen mit kaltem Flow-Waschpuffer, um überschüssigen Antikörper zu entfernen. Anschließend 100 Mikroliter BD-Fixierungs- und Permeabilisierungslösung für mindestens 10 Minuten hinzufügen. Die Zellen bis zu 24 Stunden bei vier Grad Celsius im Dunkeln lagern, bis sie verwendet werden, oder fortfahren, um die intrazellulären Zytokine zu markieren, um die intrazellulären Zytokine zu markieren.
Permeabilisieren Sie zunächst die Zellen in 100 Mikrolitern eines X-Perm-Puffers. Waschen Sie die Zellen und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Während die Zellen inkubieren, bereiten Sie die Anfärbungsantikörper, Kompensationskontrollen und FMO-Kontrollen wie zuvor in einem X-Perm-Waschpuffer vor.
Nachdem die Zellen 10 Minuten inkubiert wurden, kurz zentrifugieren und den 1×-Permeabilisierungspuffer entfernen. Die geeigneten markierten Antikörper hinzufügen. Anschließend die Zellen und Antikörper 60 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.
Waschen Sie die Zellen zwei Mal mit der Permeabilisierungslösung. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie die Zellen in 1 % Paraformaldehyd in DPBS, um die Zellen zu fixieren. Lagern Sie die Zellen bei vier Grad Celsius im Dunkeln, bis sie innerhalb von 24 Stunden verwendet werden.
Nachdem die Zellen gefärbt wurden, verwenden Sie einen LSR II- oder Cyan ADP-Durchflusszytometer, um die Messungen durchzuführen. Analysieren Sie die Daten anschließend mit FlowJo oder einer ähnlichen Software. Die Zusammensetzung der PBMCs in reuss Maca wurde mittels Durchflusszytometrie-Analyse bestimmt.
Diese Abbildung zeigt das Gating-Schema, das zur Analyse der verschiedenen T-Zell-Subpopulationen aus einem repräsentativen Tier verwendet wurde. Die Lymphozyten wurden zunächst über den Vorwärtsstreulicht (FSC) im Vergleich zum Seitwärtsstreulicht (SSC) selektiert, anschließend wurden lebende Lymphozyten basierend auf SSC und der AQUA-negativen Population identifiziert. Die T-Zellen wurden dann durch CD3-Expression bestimmt, wobei die CD4-positiven, CD8-negativen sowie die CD4-negativen, CD8-positiven Populationen innerhalb der CD3-positiven T-Zell-Population ebenfalls ermittelt wurden.
Die CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen wurden zusätzlich anhand der Expression von CD28 und CD95 in verschiedene Subpopulationen unterteilt, und zwar in naive, zentrale Gedächtnis- und Effektor-Gedächtnis-Zellen. Diese Abbildung zeigt die Produktion von Interferon-gamma und IL-2 in unstimulierten sowie PMA/Cin-stimulierten CD4-positiven T-Zellen und deren Subpopulationen.
Beachten Sie die unterschiedlichen Zytokinprofile, die durch die Stimulation in jedem Subset hervorgerufen werden. Wir müssen Ihnen zeigen, wie man eine Multiflow-Zytometrie-Analyse von PBMC durchführt.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sowohl Einkanal-Kompensationskontrollen als auch Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen einzurichten. Beide Kontrollen sind für eine korrekte Analyse von Durchflusszytometriedaten erforderlich. Weitere Informationen zur Auswahl geeigneter Kompensationskontrollen finden Sie in unserem schriftlichen Protokoll.
Bitte beachten Sie außerdem, dass es bei Verwendung fluoreszenzmarkierter Antikörper wichtig ist, die Proben abzudecken, um sie vor Lichteinwirkung zu schützen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Stimulation und Färbung peripherer mononuklearer Blutzellen (PBMC) für die mehrfarbige Durchflusszytometrie-Analyse. Die Studie konzentriert sich auf die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von CD4+ und CD8+ T-Zell-Subpopulationen in Rhesusmakaken, einem Modell für die HIV/AIDS-Impfstoffforschung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Durchflusszytometrie
- HIV/AIDS-Forschung
Hintergrund
- Makaken werden als Modell zur Erforschung von HIV/AIDS verwendet.
- Das Verständnis von T-Zell-Subpopulationen ist entscheidend für die Entwicklung von Impfstoffen.
- Mit der mehrfarbigen Durchflusszytometrie lassen sich Immunzellen detailliert analysieren.
- PBMCs sind Schlüsselkomponenten bei der Untersuchung von Immunantworten.
Zweck der Studie
- Charakterisierung der Gesamt- und Gedächtnis-Teilmengen von T-Zellen.
- Anwendung der mehrfarbigen Durchflusszytometrie zur detaillierten immunologischen Profilierung.
- Verbesserung des Verständnisses immunologischer Reaktionen im Kontext von HIV/AIDS.
Verwendete Methoden
- Isolierung von PBMCs aus Vollblut.
- Chemische oder biologische Stimulierung von PBMCs.
- Verwendung von Antikörpersortimenten zur Identifizierung von Zelltypen und Oberflächenmarkern.
- Analyse von Zytokinprofilen mittels Durchflusszytometrie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Stimulation und Färbung von PBMCs zur Analyse.
- Identifizierung spezifischer T-Zell-Subpopulationen basierend auf Oberflächenmarkern.
- Charakterisierung der intrazellulären Zytokingexpression.
- Erkenntnisse über immunologische Reaktionen im Zusammenhang mit HIV/AIDS.
Schlussfolgerungen
- Mehrfarbige Durchflusszytometrie ist effektiv für die T-Zell-Analyse.
- Makaken liefern wertvolle Erkenntnisse für die HIV-Impfstoffforschung.
- Das Verständnis der T-Zell-Dynamik ist entscheidend für die Entwicklung wirksamer Therapien.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie lässt sich ein präzises phänotypische und funktionelle Profil von T-Zell-Subpopulationen bei Rhesusmakaken erstellen, einem entscheidenden präklinischen Modell für die Entwicklung von HIV-Impfstoffen. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung durch Quantifizierung zytokinproduzierender Immunantworten und liefert somit Entscheidungsgrundlagen für Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen Entdeckungsphase. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit, indem sie die antigenspezifische Stimulation mit messbaren intrazellulären Zytokinausgaben in definierten Gedächtnispopulationen verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Messung der Produktion von IFN-γ und IL-2 in CD4+ und CD8+ T-Zell-Subpopulationen nach Stimulation.
- Operativer Wert: Bietet qualitative und quantitative Messgrößen der intrazellulären Zytokingexpression, um mechanistische Unklarheiten bei der Validierung immunologischer Zielstrukturen abzumildern.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch empfindliche Detektion geringer antigen-spezifischer T-Zell-Fraktionen in PBMC-Proben geimpfter Tiere.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe vor, indem standardisierte Färbungs- und Stimulationsprotokolle zur reproduzierbaren Immunprofillierung etabliert werden.
- Operativer Wert: Trägt zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei, indem Kompensationskontrollen und FMO-Kontrollen verwendet werden, um eine genaue Populationsgating zu gewährleisten.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstreicht die Bereitschaft für Screening-Anwendungen, indem die Detektion von Zytokinprofilen in naiven, zentralen Gedächtnis- und effektorischen Gedächtnis-T-Zellsubpopulationen ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem intrazelluläre Zytokinmessungen bei Rhesusmakaken mit der HIV-Pathogenese und vaccineinduzierten Immunantworten in Beziehung gesetzt werden.
- Operationaler Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die Ergebnisse der PBMC-Stimulation mit der funktionellen Charakterisierung von T-Zellen verknüpft werden.
- Wissenschaftlicher Wert: Konzentriert sich auf den prädiktiven Entwicklungsrisikoverringerungswert, indem die Zytokinproduktion als funktioneller Endpunkt zur Bewertung der Impfstoffimmunogenität genutzt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode verortet sich innerhalb des Entdeckungsspektrums von der frühen Immunprofilerstellung bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die Aufklärung von Signalwegen in Modellen infektiöser Krankheiten.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem sie die Zytokinproduktion in spezifischen T-Zell-Subpopulationen nach PMA/Ionomycin- oder antigenspezifischer Stimulation quantifiziert.
- Screening: Beschreibt die Einsatzbereitschaft des Assays anhand standardisierter Stimulation, Oberflächen- und intrazellulärer Färbung sowie der Durchflusszytometrie-Analyse von PBMC-Proben.
- Analytik: Betont Messgrößen wie die Frequenzen der IFN-γ- und IL-2-Produktion, die den Vergleich immunologischer Reaktionen zwischen verschiedenen Bedingungen und Subpopulationen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie vaccineinduzierte T-Zell-Antworten bei Rhesusmakaken mit funktionellen immunologischen Profilen in Bezug auf die HIV-Impfstoffentwicklung verknüpft.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Kapazität für die longitudinale Immunüberwachung über verschiedene Impfstoffkandidaten und Adjuvanzformulierungen hinweg dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei T-Zell-vermittelten Immunantworten.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Multifärben-Durchflusszytometrie-Assays für die Immunprofilerstellung.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirtschaftlichkeit und reduziertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Entwicklungsphasen von Impfstoffentwicklungsprogrammen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf quantitativen Zytokinprofilen in präklinischen Modellen.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Expertise in der Design, Kompensation und Gating-Strategie von Durchflusszytometrie-Panels für multicolor Immunphänotypisierung.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Durchflusszytometer (z. B. LSR II) und Software (z. B. FlowJo) zur Analyse hochdimensionaler Daten.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen Teams hinsichtlich Stimulationsbedingungen, Antikörpertitration und Kontrollaufbau (Einzel-Farbe und FMO) über verschiedene Labore hinweg.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, einschließlich Optimierung der Stimulationskonzentrationen und Inkubationszeiten für PBMCs von nichtmenschlichen Primaten.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind: Notwendigkeit des Lichtschutzes für fluoreszierende Antikörper und sorgfältige Titration zur Minimierung von Spillover in Multicolor-Panels.
