Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Video-Artikels besteht darin, Antworten auf die folgenden beiden Fragen zu liefern. Erstens: Können Untersuchungen von Proteininteraktionen zuverlässiger gestaltet werden, indem der Anteil einer Proteinstichprobe gemessen wird, der tatsächlich in der Lage ist, an ein anderes Protein zu binden? Zweitens: Wie kann die kinetische Analyse ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion vermitteln?

Beide Fragen werden in einem Experiment untersucht, das Corp X 100 verwendet, ein Instrument, das Proteinwechselwirkungen in Echtzeit ohne Markierung erfasst. In diesem Experiment wird die Wechselwirkung von boviner Cystatin B mit der Cysteinprotease Papain untersucht. Die Kristallstruktur der beiden Proteine im Komplex weist auf mehrere Reste hin, die an der Bindung an die Protease beteiligt sind, um zu ermitteln, wie sich jeder der beteiligten Reste auf die Wechselwirkung zwischen Cystatin B und Papain auswirkt. Mehrere Cystatin-B-Varianten werden mittels gezielter Mutagenese erzeugt.

Bei solchen Experimenten besteht stets die Möglichkeit, dass rekombinante Proteine nicht korrekt falten, aggregieren oder sich zersetzen, was zu falschen und nicht reproduzierbaren Ergebnissen führen kann. VIACORE X 100 verfügt über die Fähigkeit, den Anteil des Proteins, der für die Bindung verfügbar ist, durch kalibrierungsfreie Konzentrationsanalyse, abgekürzt CFCA, zu bestimmen. Dieser Ansatz ermöglicht die Bestimmung der Konzentration von Protein mit erhaltener Bindungsaktivität, selbst wenn Kalibrierstandards nicht verfügbar sind.

CFCA wird hier verwendet, um die Konzentration der Cystatin-B-Varianten zu bestimmen. Diese Daten werden anschließend als Eingabewerte zur Bestimmung der Bindungskinetik der Cystatin-B-Varianten an Pepin verwendet, die ebenfalls unter Verwendung von BOR X 100 bewertet wird. Hallo, ich bin CLA gram von GE Healthcare in Schweden.

Heute wird meine Kollegin Eva Pool Ihnen zeigen, wie man eine Struktur-Funktions-Beziehungsanalyse mithilfe von BOR X 100 durchführt. Rekombinante Proteine können im Laufe der Zeit eine fehlerhafte Faltung aufweisen oder ihre Bindefähigkeit verlieren, und dieses Verhalten kann mit Methoden, die auf der Gesamtkonzentrationsmessung beruhen, nicht erfasst werden. Dies kann letztlich zu falschen kinetischen Daten führen, nachdem die Konzentrationsmessungen mittels kalibrationsfreier Konzentrationsanalyse durchgeführt wurden. B.A. core X 100 wird verwendet, um die Kinetik und Affinität der Wechselwirkung von Cystatin-B-Varianten mit Pepan zu analysieren.

Diese Parameter liefern Einblicke in den Bindungsmechanismus. Wir beginnen mit einer kurzen Erläuterung des experimentellen Designs, also legen wir los. Die Wechselwirkung zwischen Cystin, Protease, Papain und dem Inhibitor Cystatin B wird durch hydrophobe Kontakte dominiert, wie die Kristallstruktur der beiden Proteine im Komplex zeigt.

Aus Sicht des Inhibitors bestehen die Kontaktflächen aus den N- und C-terminalen N-Atomen sowie zwei Haarnadelschleifen. In dieser Studie wurden vier Mutanten untersucht, von denen jede eine Cystein-zu-Syrian-Mutation enthält, die eingeführt wurde, um die Dimerisierung von Cystatin B zu verhindern. Basierend auf dem im Kristallstrukturmodell offenbarten Kontext wurde Leucin 73 in Glycin, Histidin 75 in Glycin und Tyrosin 97 in Alanin mutiert. Die beiden Glycin-Mutationen wurden eingeführt, um die Bedeutung der Seitenketten von Histidin 75 und Leucin 73 für die Bindung an Pepin zu untersuchen; die Tyrosin-Mutation in Alanin diente der Untersuchung der Wechselwirkung zwischen dem C-Terminus von Cystatin B und Pepin.

Die drei Doppelmutanten sowie der INE drei aufweisende syrische Einzelmutant werden auf ihre Interaktion mit einer katalytisch inaktiven Variante von Papain-S-Methyl-Popin getestet. Diese katalytisch inaktive Form des Proteus weist eine Methylgruppe, die an CYS 25 in der aktiven Spalte angebunden ist. Der Einfachheit halber werden wir diese Variante im gesamten Protokoll als Propan bezeichnen.

CFCA beruht auf der Messung der Bindungsgeschwindigkeit unter Bedingungen, bei denen die Geschwindigkeit durch die Diffusion der Analytmoleküle zur Oberfläche begrenzt ist. Dies wird durch hohe Immobilisierungsgrade des Liganden begünstigt. Vor Beginn der Immobilisierungsprozedur stellen Sie den für die Experimente verwendeten HEPs-Puffer auf das linke Fach und stecken Sie beide Schläuche ein.

Stellen Sie außerdem eine leere Abfallflasche auf das rechte Fach. Setzen Sie dann einen neuen Sensor Gypsum Five in das Gerät ein, initialisieren Sie es über die Core X 100-Software und klicken Sie auf dem Startbildschirm auf den Menüpunkt „Dock Chip Tool“. Klicken Sie in der Software auf „Start Doc“.

Als Nächstes verwenden Sie den Immobilisierungs-Assistenten, um die Papier- und Immobilisierung einzurichten, indem Sie im Startbildschirm die Kopplung an CM5 mit Zensur auswählen, auf die Schaltfläche „Weitere Optionen“ klicken und dann Assistenten auswählen. Daraufhin wird ein Fenster mit den verfügbaren Assistenten angezeigt. Wählen Sie Immobilisierung aus und klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Neu“. Unten rechts erscheint der erste Bildschirm des Immobilisierungs-Assistenten; die Kopplung an Sensor Gips 5 ist standardmäßig voreingestellt.

Aktivieren Sie das Kästchen unter Durchflusszelle zwei, um in Durchflusszelle zwei zu immobilisieren. Durchflusszelle eins bleibt unverändert, um sie als Referenzoberfläche aus den drei verfügbaren Optionen unten zu verwenden. Aktivieren Sie das Kästchen Kontaktzeit festlegen, wodurch sich das rechte Zielniveau in Kontaktzeit ändert; geben Sie eine Kontaktzeit von 900 Sekunden an.

Als Nächstes geben Sie die Immobilisierungsparameter unter der Lösung des immobilisierenden Moleküls beziehungsweise Liganden ein. Geben Sie Papain ein. Klicken Sie dann auf Weiter.

Der nächste Bildschirm zeigt die Anordnung des Probenracks an. Position eins enthält Ethanolamin, das zur Desaktivierung der verbleibenden aktiven Gruppen nach der Kopplung des Liganden Papain an die Chipoberfläche verwendet wird. Fügen Sie die Ethanolaminlösung an Position eins in Position zwei ein.

Platzieren Sie das Ligand-Papain, das in einem Überschuss an Methylsulfat gelagert wird, und verdünnen Sie es auf 50 Mikrogramm pro Milliliter in 10 Millimolar Natriumacetatpuffer, pH 4,5. Rekonstituieren Sie die EDC- und NHS-Kupplungsreagenzien aus dem Amin-Kupplungs-Kit mit doppelt destilliertem Wasser. Pipettieren Sie 85 Mikroliter EDC in ein Vial, verschließen Sie es und stellen Sie es auf Position drei.

Verwenden Sie das gleiche Volumen für NHS in Position vier. Beachten Sie, dass die Datei fünf verschlossen und leer sein muss, damit das Instrument ED, C und NHS in dieser Datei mischen kann. Füllen Sie außerdem die Waschdatei in Position H2O mit frischem entionisiertem Wasser.

Wenn das Rack gemäß der Anleitung auf dem Bildschirm befüllt ist, klicken Sie auf „Proben laden“ und laden das Rack in das Gerät ein. Sobald das Rack eingelegt ist, klicken Sie auf „Weiter“. Vor Beginn des Laufs wird eine Checkliste angezeigt.

Stellen Sie sicher, dass alle Aufzählungspunkte erfüllt sind, wenn dies der Fall ist. Der Durchlauf wird durch Drücken des Startknopfs gestartet. Der Durchlauf wird während des Immobilisierungsverfahrens gestartet.

Die Daten werden in Echtzeit erfasst. Zunächst werden die Kopplungsreagenzien injiziert. Anschließend wird Pape an die Chips Oberfläche gekoppelt, und das Verfahren endet mit der Deaktivierung der verbleibenden aktiven Ester.

Nach dem Durchlauf fasst ein Dialogfenster das Ergebnis zusammen. In diesem Fenster wird der Immobilisierungsgrad angezeigt. Das gesamte Kopplungsverfahren sollte zu einer Immobilisierung von etwa 3000 RU Papain führen.

Nachdem Papain auf dem Sensorchip immobilisiert wurde, verdünnen Sie die Cystatin-B-Mutantenproben für die CFCA-Analyse auf eine Gesamtkonzentration von etwa 10 Nanomolar in mindestens 300 Mikroliter. Notieren Sie den Verdünnungsfaktor, da dieser später bei der Assay-Einrichtung verwendet wird. Öffnen Sie zunächst den Assistenten-Dialog wie im vorherigen Abschnitt im Konzentrationsbereich des Assay-Ordners beschrieben.

Wählen Sie kalibrierungsfrei und anschließend neu. Auf dem ersten Bildschirm des Assistenten wird die Injektionssequenz angezeigt. Die Einstellungen können unverändert bleiben, da hier ein Sensorchip vom Typ CM5 und ein direkter Immobilisierungsassay-Ansatz verwendet werden.

Klicken Sie im nächsten Bildschirm auf „Weiter“. Lassen Sie die Kontrollkästchen „prime before run“ und „run startup cycles“ aktiviert. Belassen Sie auch die Standardanzahl von drei Startzyklen unverändert.

Geben Sie Pufferlösung in das Feld für den Lösungsnamen ein. Klicken Sie dann auf Weiter. Geben Sie im nächsten Bildschirm den Namen der Regenerationslösung ein, die 20 Millimolar Natriumhydroxid beträgt.

Belassen Sie die anderen Parameter unverändert. Klicken Sie auf „Weiter“, um die Beispiel-Tabelle anzuzeigen. Richten Sie die Proben gemäß der Beispiel-Tabelle ein.

Jede Zeile in der Probentabelle führt zu zwei Zyklen. Einem mit einer Flussrate von 10 Mikrolitern pro Minute und einem mit 100 Mikrolitern pro Minute. Beginnen Sie den Lauf mit einer Leerprobe.

Geben Sie anschließend den Namen, den Verdünnungsfaktor, den Diffusionskoeffizienten bei 20 Grad Celsius und das Molekulargewicht ein. Für jeden Mutanten kann der Diffusionskoeffizient mithilfe des Webtools auf der Produktwebsite berechnet werden. Ein Link zu diesem Tool ist im Support-Navigator der Software bereitgestellt.

Da empfohlen wird, jede Probe und deren Duplikat zu analysieren, kopieren Sie die gesamte Tabelle ab der leeren Zeile bis zur letzten Probe und fügen Sie sie am Ende der Tabelle ein. Klicken Sie auf „Weiter“, um fortzufahren. Auf dem nächsten Bildschirm wird das Probenröhrchenlager angezeigt.

Stellen Sie die Proben und Reagenzien gemäß dem vom Software vorgegebenen Layout in das Rack. Laden Sie das Rack in das Gerät, indem Sie die Taste „Proben laden“ drücken. Klicken Sie anschließend auf Weiter.

Nach dem Laden der Proben wird ein Erinnerungsbildschirm mit einer Checkliste angezeigt. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Punkte überprüft haben, und drücken Sie dann auf Start. Während des Laufs werden die Daten in Echtzeit erfasst.

Wenn der Durchlauf abgeschlossen ist, schließen Sie das Fenster mit den gesammelten Daten. Beachten Sie, dass ein neues Ergebniselement im Hauptfenster erschienen ist. Um die Konzentrationen anhand der Daten zu berechnen, wählen Sie das neue Ergebniselement aus und klicken Sie auf die Schaltfläche.

Überprüfen Sie über Core X 100. Die Auswertungssoftware wird gestartet und zeigt alle gesammelten Daten an. Wählen Sie in der Symbolleiste die Konzentrationsanalyse und anschließend kalibrierungsfrei aus dem Menü. Wählen Sie im ersten Fenster die Daten aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen.

Scrollen Sie durch die Liste und gehen Sie die Ansichtsliste der Reihe nach durch, um die Daten aller Proben anzuzeigen. Wenn Sie bestimmte Daten ausschließen möchten, entfernen Sie das Häkchen aus der Liste. Klicken Sie auf Weiter, um die Berechnung zu starten.

Das CFCA-Wechselwirkungsmodell wird automatisch an die experimentellen Daten angepasst; sobald die Anpassung abgeschlossen ist, werden die Ergebnisse für jede Probe im Ergebnisfenster angezeigt. Schalten Sie durch die Anpassungen für jede Probe, indem Sie die entsprechende Zeile in der Tabelle auswählen. Die Spalte mit der Bezeichnung gemessene Konzentration zeigt die Konzentration in der analysierten Probe an.

Die Konzentration in der ursprünglichen Probe wird mithilfe des zuvor eingegebenen Verdünnungsfaktors berechnet und in der Spalte „berechnete Konzentration“ angezeigt. Nach Fertigstellung klicken Sie auf „Fertig stellen“, um das Ergebnis zu speichern. Da wir nun die Konzentrationen der Proteine aus der CFCA-Analyse kennen, verfügen wir über eine hervorragende Grundlage für die anschließenden kinetischen Messungen. Die kinetische Analyse wird uns nun helfen, die Bedeutung wichtiger Aminosäurereste für den Bindungsmechanismus zu verstehen.

Beginnen wir mit der Einrichtung der kinetischen Analyse. Die kinetische Analyse startet damit, dass ein neuer Sensorschip CM5 in das Gerät auf dem Startbildschirm eingedockt wird. Wählen Sie die Erstellung eines Assay-Workflows für die kinetische Affinität.

In der oberen linken Ecke erscheint ein Dialogfenster, in dem Informationen über den Liganden eingegeben werden. Geben Sie den Namen Papain in das Feld für den Ligandennamen ein und wählen Sie ein anderes Protein aus der Liste der Artenarten aus. Wählen Sie anschließend die kovalente Immobilisierung des Liganden unter Verwendung des Sensorchips CM5 aus den beiden vorgeschlagenen Alternativen für die Ligandenbindung; der empfohlene Assay-Arbeitsablauf wird nun auf der rechten Seite des Fensters dargestellt.

Es beginnt mit einem Immobilisierungsschritt, gefolgt von einem Assayschritt. Klicken Sie auf „Weiter“, um fortzufahren. Speichern Sie den Assay-Ablauf, indem Sie einen Namen eingeben und auf „Speichern“ klicken.

Die Software zeigt nun den Ablauf des Assays mit Schaltflächen an, die jedem Schritt zugeordnet sind. Der erste Schritt unter der Sensoroberflächenvorbereitung ist das Ermitteln eines MobilisierungspH-Werts. Da dieser pH-Wert bekannt ist, drücken Sie im erscheinenden Dialogfeld auf „bekannten Wert eingeben“.

Geben Sie den Puffernamen „Acetat“ und pH 4,5 ein und wählen Sie „Speichern“. Der Assay-Workflow wird nun mit einem grünen Häkchen aktualisiert, um anzuzeigen, dass dieser Schritt abgeschlossen ist. Nun ist es an der Zeit, die Immobilisierung durchzuführen: Drücken Sie die Schaltfläche „Ausführen“ im Schritt „Immobilisierung“.

Dadurch wird der gleiche Assistent gestartet, der bereits für Propan und die Immobilisierung bei der CFCA-Analyse verwendet wurde. Die Immobilisierung von Papain für die kinetische Analyse wird hier auf die gleiche Weise eingerichtet, mit dem Unterschied, dass eine verdünntere Lösung für einen kürzeren Zeitraum injiziert wird. Dies dient dazu, weniger Papain zu immobilisieren, um Situationen zu vermeiden, in denen die Bindungsraten der Cystatin-B-Mutanten durch Diffusion begrenzt sind, sodass kinetische Daten isoliert gemessen werden können. Da der Name des Liganden und der ImmobilisierungspH in vorherigen Schritten des Assay-Workflows eingegeben wurden, sind beide hier voreingestellt.

Die einzige erforderliche Aktualisierung beträgt 50 Sekunden für die Kontaktzeit. Die Immobilisierung erfolgt anschließend wie zuvor gezeigt. Der erwartete Bindungsgrad nach der Immobilisierung liegt bei 50 R ru.

Ein grünes Häkchen neben der Schaltfläche „Ausführen“ zeigt an, dass die Immobilisierung abgeschlossen ist. Geben Sie als Nächstes die Regenerationslösung im Workflow im Schritt ein. Finden Sie Regenerationsbedingungen, indem Sie im erscheinenden Dialogfeld auf „bekannte Werte eingeben“ klicken.

Geben Sie die Regenerationslösung und die Kontaktzeit ein. Klicken Sie dann auf Speichern. Nachdem der Ligand immobilisiert wurde und die Regenerationsbedingungen eingegeben sind, ist alles bereit, um kinetische Daten im Feld „Kinetik-Affinitätsassay“ zu generieren. Drücken Sie die Schaltfläche „Ausführen“, um den ersten Schritt der Kinetik zu starten.

Der Affinitätsassistent legt die Injektionssequenz jedes Zyklus für die Einzelzykluskinetik fest, die hier verwendet wird; es ist nicht erforderlich, etwas zu ändern. Klicken Sie auf „Weiter“, um fortzufahren. Im nächsten Schritt behalten Sie die Standardeinstellungen bei, die die Vorbereitung des Systems vor dem Durchlauf anzeigen.

Wählen Sie eine Startzyklusdurchführung, um die Chipoberfläche zu equilibrieren. Definieren Sie anschließend die Injektionsparameter für die Probe. Da die Regenerationslösung zuvor festgelegt wurde und die Einstellung voreingestellt ist, besteht keine Notwendigkeit, Parameter auf dem Bildschirm zu ändern.

Klicken Sie auf Weiter. Geben Sie abschließend die Proben an. Tragen Sie zwei Zeilen für jede Mutantenvariante ein, eine leer und eine mit Probe.

Ein leerer Zyklus wird angegeben, indem der höchste Konzentrationsparameter auf null gesetzt wird. Zwei. Cystatin-B-Varianten können pro Durchlauf ausgewertet werden. Geben Sie für jede Mutante das Molekulargewicht, die höchste Konzentration und den Verdünnungsfaktor ein und klicken Sie auf „Weiter“.

Im folgenden Bildschirm ist das Probenröhrchenrack dargestellt. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe der Proteinproben vor und stellen Sie die verschlossenen Röhrchen in das Rack. Wie auf dem Bildschirm dargestellt, wird ein Röhrchen mit Puffer an Position 13 und ein Röhrchen mit Regenerationslösung an Position 14 platziert. Stellen Sie sicher, dass die Wasserposition mit frischem Wasser gefüllt wird.

Stellen Sie das Rack in das Gerät ein und laden Sie die Proben, indem Sie die Schaltfläche „Proben laden“ drücken und anschließend auf „Weiter“ klicken. Führen Sie wie zuvor eine abschließende Überprüfung durch, bevor Sie die Durchführung des Experiments durch Drücken von „Start“ beginnen; die Interaktionsdaten erscheinen in Echtzeit. Sobald der Durchlauf beendet ist, führen Sie unverzüglich die verbleibenden Cystatin-B-Varianten wie gerade gezeigt durch.

Wenn die verbleibenden Cystatin-B-Varianten nacheinander durchgeführt werden, lassen Sie den Prime-Schritt und den Startzyklus aus, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen im Schritt deaktivieren. Sobald jeder Durchlauf abgeschlossen ist, können die Daten über den Link abgerufen werden. Alle Ergebnisse im Assay-Workflow.

Ein Dialogfenster mit allen innerhalb dieses Workflows generierten Ergebnissen wird angezeigt. Um die kinetischen Ratenkonstanten zu berechnen, wählen Sie das zu bewertende Ergebnis aus und klicken Sie auf „evaluate“. Die Software Core X 100 Evaluation wird erneut gestartet und zeigt alle gesammelten Daten an. Wählen Sie im Symbolleistenmenü „Kinetics Affinity“.

Im ersten Bildschirm wird der Cystein-Drei-zu-Syrisch-Mutant zur Auswertung ausgewählt. Die Daten dieses Mutanten werden zusammen mit dem Leerlauf, der für diesen Mutanten durchgeführt wurde, angezeigt; fortsetzen durch Klicken auf „Weiter“. Der nächste Bildschirm zeigt die Daten an, bei denen der Leerlauf von der Probe abgezogen wurde.

Wählen Sie die Kinetikbewertung aus, indem Sie auf die Schaltfläche „Kinetik“ klicken. Wählen Sie nun aus, die Daten an ein Eins-zu-Eins-Interaktionsmodell anzupassen. Durch Klicken auf die Schaltfläche „Anpassen“ wird die Anpassung angezeigt, während sie berechnet wird.

Wenn es bereit ist, werden automatisch Qualitätskontrollen durchgeführt und am unteren Rand hervorgehoben. Überprüfen Sie die Elemente der Qualitätskontrolle und betrachten Sie anschließend die Sensorgrammdaten, um sicherzustellen, dass die Sensorgramme ausreichend gekrümmt sind. Außerdem sollten Sie sich das Residuenplot ansehen, das die Unterschiede zwischen den gesammelten Daten und dem angepassten Modell zeigt.

Achten Sie auf systematische und nicht zufällige Abweichungen. Diese Anpassung ist akzeptabel. Sehen Sie sich nun die kinetischen Daten im Register Bericht an.

Die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante, die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante und die Gleichgewichtsdissoziationskonstante. Wenn fertig, drücken Sie „Fertig“, um denselben Vorgang für alle anderen Mutanten zu wiederholen. Hier sind repräsentative Ergebnisse der CFCA-Analyse für die verschiedenen untersuchten Cystatin-B-Varianten.

Die Daten zur spezifischen Bindungskonzentration werden aus den Sensorgrammen gewonnen, die bei Flussraten von 10 und 100 Mikrolitern pro Minute erhalten wurden. Beim Vergleich der durch eine Zweifach-80-Messung bestimmten Konzentration mit der durch CFCA bestimmten Konzentration zeigt sich deutlich, dass das Protein im Fall der Leucin-73-Glycin-Variante in den meisten Fällen vollständig aktiv ist, während der Anteil des aktiven Proteins sehr gering ist. Die Kinetik der Bindung von Cystatin-B-Varianten an Pepin wird mittels Einzelzykluskinetik bestimmt.

Die Sensorgramme zeigen die blanko- und referenzsubtrahierten Daten mit der Kinetik für ein 1:1-Interaktionsmodell, das in Schwarz überlagert ist. Die spezifische Bindungskonzentration, gemessen mittels CFCA für die Leucin-73-Variante, beträgt nur etwa 10 % der Gesamtproteinkonzentration, wie durch eine zwei-80-Messung bestimmt. Bei Verwendung der korrekten Konzentration zur Berechnung der kinetischen Parameter wird deutlich, dass die Assoziationsrate für Leucin 73 der der anderen Varianten ähnelt.

Während die Assoziationsraten der Mutanten mit der des Wildtyp-Proteins vergleichbar sind, kann die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante der Mutanten um nahezu zwei Größenordnungen höher sein, was einer entsprechenden Erhöhung der Gleichgewichts-Dissoziationskonstante entspricht. Die verminderten Affinitäten hängen hauptsächlich von erhöhten Dissoziationsraten ab, was darauf hinweist, dass sowohl die zweite Bindungsschleife als auch das C-terminale Ende von Cystatin B zur Bindungsaffinität beitragen, indem sie den Inhibitor am Enzym festhalten, sobald der Komplex gebildet wurde. Die Verwendung einer kalibrierungsfreien Konzentrationsanalyse war für diese Schlussfolgerung entscheidend, da sich herausstellte, dass eine der Mutanten eine sehr geringe Bindungsaktivität aufweist. Mein Kollege Pol hat Ihnen nun gezeigt, wie man BiCore X 100 in einer strukturierten Funktionsstudie anwendet. Bei der Durchführung dieser Experimente ist es wichtig zu bedenken, dass, obwohl sowohl die Konzentrations- als auch die kinetische Analyse auf demselben Bindungsverfahren basieren, die experimentellen Bedingungen doch recht unterschiedlich sind.