Die Bestimmung der Reaktivität und Titre von Serum mit einem Hämagglutinations Assay

Bestimmung der Reaktivität und des Titer von Serum mithilfe eines Hämagglutinationsassays. Eine Gleichgewichtsreaktion ist eine Reaktion, die zwischen löslichen Antikörpern und partikulären Antigenen stattfindet. Dazu können Zellen oder Trägermoleküle gehören.

Epitope auf der Oberfläche des Trägers ermöglichen es einem Antikörper, sich anzubinden und den Träger zu vernetzen, was zur Bildung eines komplexen Gitters führt, das als Antigen-Antikörper-Komplex bezeichnet wird. Hämagglutination ist eine spezifische Form der Agglutination, bei der Antikörper an rote Blutkörperchen binden, die als partikuläres Antigen fungieren. Rote Blutkörperchen sind nützliche Zielstrukturen, da sie leicht verfügbar sind und die Ergebnisse einfach mit bloßem Auge sichtbar sind.

Serumproben werden seriell verdünnt und anschließend in eine 96-Well-UBO-Platte gegeben. Dann wird eine Suspension von roten Blutkörperchen, Riva-Zellen, hinzugefügt. Wenn Antikörper in hoher Konzentration vorhanden sind, binden diese an die roten Blutkörperchen und bilden ein großes Gittergeflecht.

Während dieses Gitter durch die Schwerkraft absetzt, passt es sich der Form der Ubo-Platte an. Von oben betrachtet ist ein ausgedehntes Feld aus roten Blutkörperchen zu sehen. Dies ist eine positive Hämagglutinationsreaktion.

Wenn die Antikörperspiegel niedrig sind, kann sich kein Gitter bilden, und die roten Blutkörperchen nehmen die Form der UBO-Platte an und konzentrieren sich an der Basis, wodurch ein kleines Pellet entsteht. Dies ist eine negative Hämagglutinationsreaktion. Dieses Diagramm zeigt eine positive Reaktion.

Die Zellen bilden ein Gitter, während sie sich absetzen, und passen sich der Form der U-förmigen Bodenplatte an. Links und rechts sehen wir die Draufsicht, bei der ein breites Feld roter Blutkörperchen sichtbar ist. Wenn eine mittlere Menge an Antikörpern vorhanden ist, wird die Bildung einiger Buchstaben beobachtet.

Die Hämagglutination ermöglicht auch, die Reaktivität verschiedener Serumproben gegenüber dem bekannten Antigen zu testen. Außerdem kann die Titerhöhe der Serumprobe bestimmt werden. Der Titer ist die letzte Verdünnung, bei der eine positive Reaktion beobachtet wurde.

Normalerweise gilt: Je höher die Antikörperkonzentration in der Serumprobe ist, desto höher ist der Titer. Dieses Diagramm zeigt eine negative Hämagglutinationsreaktion. Es sind nicht ausreichend Antikörper vorhanden, um die roten Blutkörperchen zu vernetzen.

Während die Zellen durch die Schwerkraft absinken, rutschen sie an der Wand des Wells entlang und bilden am Boden ein dichtes Pellet. Das Diagramm rechts zeigt die roten Blutkörperchen, wie sie von oben betrachtet aussehen. Für dieses Experiment benötigen Sie eine 96-Well-U-Boden-Platte.

Es ist unbedingt erforderlich, eine U-förmige Mikrotiterplatte zu verwenden, da Zellkulturplatten mit flachem Boden nicht ermöglichen, dass sich die Zellen zu einem Pellet absetzen, wodurch die Auswertung unmöglich wird. Ein Pipettierroboter, der 50 µL Serum, eine 1%-ige Suspension von Riva-Zellen und eine einmalige Lösung von Veronal-Puffer-Salzlösung in jede Vertiefung der Reihe A sowie 50 µL Ringer-Puffer-Salzlösung in die Vertiefungen 1 bis 12 abgeben kann.

Dies dient als Ihr Verdünnungsmittel. Geben Sie nun 50 Mikroliter Serum in das Loch A1. Dies ist Ihre erste Verdünnung im Verhältnis 1:2.

Unter Verwendung des Perpet sicherstellen, dass die Serumprobe gründlich gemischt wird. Nach dem Mischen 50 Mikroliter aus Vertiefung A1 entnehmen und in Vertiefung A2 überführen. Dies ist Ihre zweite Verdünnung im Verhältnis 1:2 und ergibt eine vierfache Verdünnung.

Setzen Sie diese Verdünnungsreihe mit den Vertiefungen drei bis elf fort. Geben Sie kein Serum in Vertiefung 12, da dies Ihre negative Kontrolle mit Pufferlösung ist. Nehmen Sie nun Ihre 1 %ige Suspension von Riva-Zellen, die gründlich gemischt wurde, und übertragen Sie 50 Mikroliter in Vertiefung A1 bis A12.

Nachdem die Zellen hinzugefügt wurden, bedecken Sie die Platte und klopfen Sie vorsichtig darauf, um sicherzustellen, dass die Proben und die Zellen gut vermischt sind. Inkubieren Sie nun 60 Minuten bei 37 Grad. Ein befeuchteter Inkubator ist geeignet.

Während der 60-minütigen Inkubationszeit finden Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen statt, und die Zellen beginnen sich abzusetzen. Die angezeigte Videosequenz ist eine Zeitrafferaufnahme des gesamten 60-minütigen Zeitraums. Dies ist eine Vergrößerung der Vertiefungen fünf bis zehn.

Wir haben bereits gut 12 untersucht, der Ihre VBS-Kontrolle in diesem Experiment war. Die Zellen hatten ein dichtes Pellet gebildet, was darauf hindeutet, dass der Test ordnungsgemäß funktioniert hat. Gutt 5 und 6 sind Beispiele für eine positive Hämagglutination.

Nun, Brunnen sieben ist ein Beispiel für ein intermediäres Agglutinationsergebnis, während die Brunnen acht, neun und zehn negativ für Häm-Agglutination sind. Basierend auf diesem Ergebnis würde die Titerbestimmung anhand der Verdünnung des Brunnens sieben erfolgen, da dies der letzte Brunnen war, in dem eine positive Reaktion beobachtet wurde.