Einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Quantifizierung von bakteriellen Chemotaxis in Stable Konzentrationsgradienten

E. coli RP4-37 werden in eine Chemotaxis-Vorrichtung eingeführt, in der sie definierten räumlichen Konzentrationen ausgesetzt werden. Zellen, die in die Kammer eintreten, treffen auf den Mittelpunkt des Konzentrationsgradienten. Abhängig davon, ob das Signal als Attraktant oder Repellent wahrgenommen wird, bewegen sich die Bakterien schnell entlang des Konzentrationsgradienten aufwärts oder abwärts.

Hallo, ich bin Derek Engler vom Labor für molekulare Systembiotechnologie und vom Fachbereich Verfahrenstechnik der Texas A&M University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis in einer mikrofluidischen Vorrichtung. In unseren Laboren verwenden wir dieses Verfahren, um zu erforschen, wie E. coli RP437 in einem Konzentrationsgradienten aus Nickelsulfat migriert.

Beginnen wir also. Die fluidische Schicht und die Steuerschicht werden durch Abformung von Polymethyl SUBOXANE oder PDMS von der SU-acht-Masterform hergestellt. Mischen Sie zu Beginn des Verfahrens das PDMS-Präpolymer und den Vernetzer im Gewichtsverhältnis 10 zu 1.

Entgasen Sie die Mischung eine Stunde lang im Exsikkator, bis die Luftblasen entfernt sind. Wenn die PDMS-Mischung bereit ist, stellen Sie die SU-acht-Masterform in eine Petrischale und gießen Sie die Mischung vorsichtig in der gewünschten Dicke darauf. Heizen Sie die Petrischale mit der PDMS-Mischung und der SU-acht-Masterform zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius, um das PDMS zu aushärten.

Nach zwei Stunden das ausgehärtete, mit PDMS beschichtete SU-8-Master vom Heizblock nehmen und die PDMS-Form vorsichtig vom SU-8-Master ablösen. Die gewünschte Struktur wird in die PDMS-Form eingebettet sein. Mit einer stumpfen Nadelspitze (20 Gauge) vier Löcher in die PDMS-Form stanzen, um Schläuche an den Gradientengenerator, den Zellzulauf und den Zellauslauf anzuschließen. Nun ist die Montage des PDMS-Geräts zur Verbindung des PDMS-Geräts möglich.

Zunächst reinigen Sie einen Glasobjektträger mit Isopropanol und trocknen ihn mit einem Luftstrom. Danach setzen Sie die PDMS-Form und den Glasobjektträger etwa 30 Sekunden lang einer Sauerstoff-Plasma-Behandlung in einem Plasma-Ätzer aus. Bringen Sie die PDMS-Form mit dem Glasobjektträger in Kontakt. Erhitzen Sie den verbundenen Objektträger und die PDMS-Form 15 Minuten lang auf einer Heizplatte auf 65 Grad Celsius.

Um das PDMS-Gerät zusammenzubauen, schneiden Sie das Schlauchstück mit einer Rasierklinge im 45-Grad-Winkel auf die je nach Mikroskopaufbau benötigte korrekte Länge zu. Anschließend führen Sie mit einer Pinzette ein Ende des Schlauchs in eines der vier in das Gerät gestanzten Löcher ein.

Setzen Sie die stumpfe Nadelhülse einer 30-Gauge-Nadel in das andere Ende des Schlauchs ein. Wiederholen Sie das Einführen des Schlauchs und der Nadelhülse für alle verbleibenden Löcher. Füllen Sie einen Milliliter Chemoattraktanzien, Puffer oder CB in eine Drei-Milliliter-Spritze.

Darauf achten, dass keine Luft in der Spritze verbleibt. Fügen Sie CB mit einer Pipette an der Auslassnadelnabe hinzu und klopfen Sie leicht auf die Nadelnabe, um eventuelle Luftblasen zu entfernen. Drücken Sie etwas CB aus der Spitze der Dreimilliliterspritze heraus und verbinden Sie die Spritze mit der Nadelnabe, ohne Luft einzuschließen.

Drücken Sie CB durch das Gerät, bis alle verbleibenden Nadelaufsätze mit CB gefüllt sind. Dadurch sollten die meisten Luftblasen entfernt werden. Füllen Sie anschließend zwei 500-Mikroliter-Spritzen mit CB, der die geeigneten Konzentrationen des zu testenden Chemo-Effektors enthält.

Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, indem Sie einen kleinen Tropfen des Spritzeninhalts herausdrücken, die Flüssigkeitstropfen im Nadelstutzen berühren und die Spritze anschließen, um hochbewegliche Bakterien vorzubereiten. Für das Chemotaxie-Experiment züchten Sie eine Übernachtkultur von E. coli RP437 mit GFP-Expression, Plasmid in Triptonbrühe oder TB bei 32 Grad Celsius unter Schütteln am nächsten Tag. Verwenden Sie die Übernachtkultur, um eine 20-Milliliter-Kultur von TB in einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von etwa 0,05 zu impfen.

Züchten Sie die Kultur bei 32 Grad Celsius unter Schütteln, sobald die Zellen einen OD 600 von etwa 0,35 bis 0,45 erreicht haben. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und resuspendieren Sie die Zellen auf einen OD 600 von etwa 0,35 in CB, das den Chemo-Effektor in der Konzentration enthält, die in der Mitte des Kanals erwartet wird. Geben Sie schließlich RFP-markierte tote Zellen mit einem OD 600 von etwa 0,35 zu den GFP-exprimierenden lebenden Zellen hinzu.

Diese toten Zellen dienen als interne Kontrolle, um sicherzustellen, dass eine eventuelle Migration nicht auf Strömungseffekte zurückzuführen ist. Die Zellsuspension ist nun bereit, in die mikrofluidische Vorrichtung für das Chemotaxis-Experiment geladen zu werden. Um das Chemotaxis-Experiment zu beginnen, entnehmen Sie etwas CB aus dem Nadelaufsatz des Zellzulaufports und füllen diesen mit der Zellsuspension wieder auf.

Füllen Sie eine 50-Mikroliter-Spritze vorsichtig mit den resuspendierten Zellen. Gehen Sie dabei langsam vor, da Geißeln abgeschert werden können, was die Beweglichkeit verringern würde. Befestigen Sie die 50-Mikroliter-Spritze an der Einlassnadelhalterung, wie zuvor gezeigt, indem Sie einen kleinen Tropfen des Spritzeninhalts herausdrücken, den Tropfen mit der Flüssigkeit in der Nadelhalterung in Kontakt bringen und die Spritze anschließen. Platzieren Sie die Vorrichtung auf dem Objekttisch eines Fluoreszenzmikroskops, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera zur Bildaufnahme ausgestattet ist.

Platzieren Sie beide Zulauf-Spritzen in der Spritzenpumpe und starten Sie den Fluss, sodass der Gradient gebildet wird und die Zellen durch die Schläuche fließen. Sobald die Zellen in die Chemotaxis-Kammer eintreten, warten Sie etwa 20 Minuten, bis das System stabil ist. Vor der Bildaufnahme sammeln Sie lebende grüne und tote rote Fluoreszenzbilder an verschiedenen Stellen entlang der Länge der Kammer.

Üblicherweise sammeln wir an jedem Ort 100 Bilder im Abstand von drei Sekunden. Die aufgenommenen Fluoreszenzbilder können mit jedem handelsüblichen Bildanalyseprogramm wie ImageJ oder MetaMorph oder mit einfachen in MATLAB geschriebenen Codes analysiert werden. In diesem Beispiel verwenden wir MATLAB-Codes.

Entfernen Sie zunächst die Hintergrundpixel im Bild anhand dieses Schwellenwerts für die Pixelintensität und eliminieren Sie alle Pixel mit einer geringeren Intensität als der Schwellenwert. Dadurch wird das Rauschen minimiert. Verwenden Sie in der Analyse die Position der toten Zellen, um das Zentrum des Bildes zu bestimmen.

Dies stellt die Position dar, an der die Zellen die Chemotaxis-Kammer betraten und an der sie ohne jegliche Migration detektiert würden. Als Nächstes lokalisieren Sie lebende Zellen im Bild, teilen das Bild in Kanäle auf und ermitteln die Anzahl der lebenden Zellen in jedem Kanal. In unserer vorherigen Arbeit wurde die 10 bis 50 Mikrometer breite Chemotaxis-Kammer in 64 Kanäle unterteilt, von denen jeder etwa 16 Mikrometer breit war.

Nachdem diese Schritte für alle Bilder wiederholt wurden, ergeben sich aus der Gesamtanzahl der Zellen für jeden Kanal über alle Bilder hinweg. Dies ergibt die insgesamt über die Dauer des Experiments in jedem Kanal detektierte Zellanzahl. Berechnen Sie die Chemotaxis, den Verteilungskoeffizienten oder CPC, der die Richtung der Migration darstellt.

Indem Sie die folgenden Schritte durchführen, weisen Sie jeder Zelle auf der Seite mit hoher Konzentration bzw. rechts einen Multiplikator von plus eins und jeder Zelle auf der Seite mit niedriger Konzentration bzw. links einen Multiplikator von minus eins zu. Addieren Sie alle multiplizierten Werte und normalisieren Sie diese auf die Gesamtanzahl der detektierten Zellen. Berechnen Sie die Chemotaxis, den Migrationskoeffizienten oder CMC, der die Zellmigration nach der zurückgelegten Distanz gewichtet.

Einer Zelle, die sich in den am weitesten entfernten Kanal mit hoher Konzentration, Kanal 64, bewegt, wird ein Gewichtungsfaktor von plus eins zugewiesen, während einer Zelle, die sich zur Hälfte in den Bereich mit höherer Konzentration bewegt, ein Gewichtungsfaktor von plus 0,5 zugewiesen wird. Eine Zelle, die sich in die am weitesten entfernte Position mit niedriger Konzentration bewegt, erhält eine Gewichtung von minus eins. Die Summe aller gewichteten Zellanzahlen wird durch die Anzahl der Zellen normalisiert, um den CMC zu berechnen.

Dieses Diagramm zeigt ein lineares Konzentrationsgefälle oder Profil, das in der mikrofluidischen Vorrichtung unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat gebildet wird. Die Bildung eines Konzentrationsgradienten wird in dieser Abbildung anhand von blauen und gelben Farbstoffen veranschaulicht. Der Zellzulauf war verschlossen, sodass kein Durchfluss erfolgte, und es ist erkennbar, dass eine Farbskala zwischen Blau und Gelb entsteht.

Hier sind Falschfarbenbilder eines repräsentativen Chemotaxis-Experiments, bei dem E. coli RP437 einem Gradienten von null bis 100 Mikromolar L-Aspartat oder null bis 225 Mikromolar Nickelsulfat im Gerät ausgesetzt wurde. Die Migration lebender, grüner Bakterien in Richtung L-Aspartat oder weg von Nickel wurde alle 2,5 Sekunden über einen Zeitraum von 30 Minuten aufgezeichnet. Tote, rot dargestellte Bakterien dienten als Kontrolle für Strömungseffekte im Gerät.

Die räumliche Verteilung von RP 4 37 in der mikrofluidischen Vorrichtung in Abwesenheit eines Gradienten ist in diesem Diagramm im Vergleich zu ihrer Reaktion auf einen Aspartat-Gradienten und einen Nickelsulfat-Gradienten dargestellt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man die Chemotaxis von E. coli RP 4 37 in einem Nickelsulfat-Gradienten überwacht. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Wirbelbildung der Zellen zu minimieren, damit eine hochbewegliche Subpopulation verwendet werden kann.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.