Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zum Wachstum und zur Vermehrung menschlicher bronchialer Epithelzellen aus frisch isolierten menschlichen Bronchialsegmenten. Dieses Protokoll besteht aus fünf Abschnitten: Kodieren und Kratzen, hundert Millimeter Kulturplatten, Reparatur des Bronchialgewebes, Explantation von Bronchialgewebetransplantaten, Passage von wachsenden cilierten menschlichen bronchialen Epithelzellen, menschliche bronchiale Epithelzellen auf Transwell-Kammern. Vor Beginn ist zu beachten, dass alle Schritte im biologischen Sicherheitswerk durchgeführt werden.

Sofern nicht anders angegeben, lesen Sie bitte den Abschnitt zu Materialien, Reagenzien und Vorbereitung und vergewissern Sie sich, dass Sie grundlegend vorbereitet sind. Die folgenden Schritte – Kodierung, Kultur von Stammlösungen, Medium, Dissoziationlösungen, Beschichtung und Kratzen – sollten in der bst durchgeführt werden. Kulturschalen mit hundert Millimetern Durchmesser sollten in der bst vorbereitet werden.

Halten Sie alles steril. Stellen Sie sterile 100-mm-Kulturplatten und Beschichtungslösung bereit. In der BST-Pipette werden zwei Milliliter Beschichtungslösung in einer 100-mm-Platte geschwenkt, um den Boden der Platte zu beschichten.

Stellen Sie sicher, dass die Beschichtungslösung die Unterseite der Platte gleichmäßig bedeckt. Pipettieren Sie die überschüssige Lösung ab und verwenden Sie sie, um eine zweite 100-mm-Platte zu beschichten. Wiederholen Sie dies für so viele Platten, wie benötigt werden.

Die benötigte Anzahl an Platten variiert je nach Anzahl der Gewebestücke. Stellen Sie sicher, dass die Beschichtungslösung die Unterseite der Platten gleichmäßig bedeckt. Wie gezeigt.

Decken Sie die Platten mit ihren Abdeckungen ab. Lassen Sie die Platten im Inkubator eine bis zwei Stunden trocknen und saugen Sie überschüssige Lösung vor der Verwendung ab, für bronchiales Gewebe-Explantat. Unbenutzte beschichtete Kulturschalen können in eine sterile Tüte gelegt und bei vier Grad Celsius für spätere Verwendung aufbewahrt werden.

Desinfizieren Sie kleine, scharfe Scheren, Skalpell und Pinzette mit 70 % Ethanol und bringen Sie sie in den Sicherheitswerkbank. Kratzen Sie beschichtete Platten mit festem Druck mittels Skalpell an, um tiefe, kleine Kreuze zu bilden, mindestens vier pro Platte. Falls der Kratzer nicht tief genug ist, setzen sich Gewebestücke nicht ab und schwimmen aus der Spritze heraus. Platzieren Sie das Gewebe außerhalb der Sicherheitswerkbank in einer P3-Schale. Spülen Sie das isolierte humane bronchiale Gewebe gründlich in BSS aus.

Öffnen Sie die Bronchialstücke. Geben Sie das Gewebe in das BS und überführen Sie es in eine sterile 100-mm-Zellkulturschale mit DMEM/Ham F12, ergänzt mit 1 % Antibiotikum-Antimykotikum. Schneiden Sie das Gewebe mit einer scharfen kleinen Schere in 2 bis 3 mm große Würfelstücke.

Platzieren Sie mithilfe einer Pinzette ein Stück geschnittenes Gewebe in die Mitte jedes X und drücken Sie leicht darauf. Lassen Sie die Gewebestücke oder X-Explantate einige Sekunden lang vorsichtig an der Platte haften. Anschließend geben Sie vorsichtig 10 ml komplettes Medium hinzu. Falls das Gewebe nach Zugabe des Mediums schwimmt, verwenden Sie die Pinzette, um das Gewebe in die Rillen des X zu drücken, oder erstellen Sie ein neues X. Es kann notwendig sein, neue X zu formen, falls die Rillen nicht tief genug sind.

Die Platten in den Inkubator stellen und alle drei bis vier Tage das Medium wechseln, bis die Gewebe zur Transplantation bereit sind. Wenn sich ausreichend epitheliale Zellen um die Gewebe herum ausgebreitet haben, um Bereiche von einem bis zwei Zentimetern zu bedecken, was etwa vier Wochen dauert, die hundert Millimeter großen beschichteten und angeritzten Platten verwenden.

Da einige Gewebeproben möglicherweise nicht erfolgreich sein könnten. Die Anzahl der Platten hängt davon ab, wie viele Gewebestücke Sie transplantieren. Wenn Sie Platten verwenden, die zuvor beschichtet und bei vier Grad Celsius gelagert wurden, bringen Sie diese vor der Verwendung auf Raumtemperatur. Heben Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette von der ursprünglichen Platte auf und legen Sie es in die Mitte der Achse der neuen Platte, und drücken Sie sanft darauf. Gewebe ohne Auswuchs sollten verworfen werden.

Lassen Sie das Gewebe an der Platte haften. Fügen Sie für einige Sekunden Medium hinzu und inkubieren Sie. Fügen Sie zuvor für X Erklärung Beschriebenes hinzu.

Also zwei Milliliter Trypsin- und EDTA-Stammlösung für jede hundert Millimeter große Zellkulturschale. Verdünnen Sie die Stammlösung mit sechs Milliliter steriler 0,01-molarer PBS und zwei Milliliter Stammlösung auf sechs Milliliter PBS, um eine Endkonzentration von 250 Mikrogramm Trypsin pro Milliliter und 100 Mikrogramm EDTA pro Milliliter zu erreichen. Nachdem Sie die Explantate in eine neue Schale überführt haben, entfernen Sie das Medium von den Schalen mit ein bis zwei Zentimeter großen Ringen aus Zellen.

Geben Sie acht Milliliter warme, verdünnte Tropfen und EDTA-Lösung in jede 100-Millimeter-Platte und inkubieren Sie sie für drei bis 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie regelmäßig.

Ein zu langes Einwirken von Trypsin schädigt die Zellen. Überprüfen Sie die Platten unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die meisten Zellen abgelöst wurden; die Zellen runden sich auf und lösen sich ab, wie bei acht Mils Wärme gezeigt. 10 % FBS im Medium pro Platte, um die EDTA-Lösung zu inaktivieren.

Vereinigen Sie die Volumina aller Platten in einem Gefäß oder in separaten Gefäßen für unterschiedliche Gewebe. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hema-Zytometers. Zentrifugieren Sie bei hundert ×g für fünf Minuten. Es bildet sich ein Zellpellet am Boden des Gefäßes. Resuspendieren Sie das Zellpellet in komplettem Medium auf die gewünschte Zellkonzentration.

Je T-75-Flasche zwei bis drei Millionen Zellen geben und je nach Bedarf komplettes Medium hinzufügen. Inkubieren und Medium wechseln. Alle drei bis vier Wochen wachsen die Zellen in D-75-Flaschen bis zur Subkonfluenz heran.

Etwa vier Wochen nach der Aussaat sollten die Zellen abgelöst und vermehrt oder vor der Konfluenz verwendet werden, um Seneszenz zu vermeiden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der durchlässigen Membranen der Transwell-Kammern. Verwenden Sie 6,5-Millimeter-Einsätze, die in 24-Loch-Mehrfachplatten passen.

Geben Sie Medium auf beide Seiten der Membran. 0,6 ml auf den Boden und 0,1 ml auf die Oberseite. Inkubieren Sie eine Stunde im Zellkultur-Inkubator.

Entfernen Sie das Medium vorsichtig von beiden Seiten der Membran. Da die Membran bereits bei der ersten Entnahme des basalen Volumens leicht beschädigt werden kann, pipettieren Sie das Medium an der Seite des Kulturinserts entlang und verwenden Sie das empfohlene Volumen.

Wenn dies nicht beachtet wird, kommt es zu einer Übertragung des Mediums auf andere Vertiefungen, was die Zellansaat beeinträchtigen kann. Nach der Vorinkubation des durchlässigen Supports pipettieren Sie vorsichtig Ihre Zellsuspension auf die apikale Seite der Membran für 6,5-mm-Vertiefungen mit 0,1 mL Zellsuspension auf die apikale Seite der Membran. Pipettieren Sie 0,6 mL Medium auf die basolaterale Seite der Membran.

Versorgen Sie die Zellen von der apikalen und basalen Seite aus über einen Zeitraum von 10 Tagen. Um eine gut differenzierte Kultur zu etablieren, wechseln Sie das Medium zweimal wöchentlich. Entfernen Sie anhand der demonstrierten Methode das basale Volumen.

Ersetzen Sie zunächst das epikale Volumen, indem Sie 0,6 ml Medium auf die basale Seite der Membran geben. Diese Methode fördert die Zellanheftung an der Membran und verhindert, dass die Zellen über längere Zeiträume Luft ausgesetzt sind. Wechseln Sie das Medium schnell und stellen Sie die Probe anschließend wieder in den Inkubator.

Erstellen Sie am Tag 10 eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, indem Sie das AAL-Medium entfernen und 0,6 ml Medium auf der basalen Seite der Membran erneuern. Kultivieren Sie die Zellen sechs Wochen lang an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und wechseln Sie das Medium zweimal wöchentlich. Cilierte Zellen erscheinen vier Wochen nach der Herstellung des Ohres.

Flüssige Grenzfläche. Die Zellen differenzieren sich gleichmäßig in Flimmerzellen. Sechs Wochen nach der Herstellung der flüssigen Grenzfläche des Ohres.

Menschliche Bronchialsegmente mit gesunden epithelialen Zellen aus Explantaten und Transplantaten. In unserer Studie gelangen erfolgreiche Kulturen aus Bronchialgewebe-Explantaten bei acht von neun Gewebeproben. Da eine der Explantatkulturen infiziert wurde, erreichten die Epithelzellenringe einen Radius von einem bis zwei Zentimetern innerhalb von drei bis vier Wochen.

Erfolgreiche Explantate wurden bis zu sechs Mal erneut kultiviert. Alle erfolgreichen Kulturen zeigen innerhalb von 48 Stunden nach Beginn der Transplantation Hinweise auf Zellmigration, oder Explantate, wie in B gezeigt, weisen Zellen ein gepflastertes Erscheinungsbild auf, das für diese epithelialen Zellen charakteristisch ist, wie in B dargestellt. In nachfolgenden Abbildungen zeigte die Immunfärbung von Zytosin-Präparationen von Zellen aus Explantaten und auf Deckgläsern ausgesäten Zellen, dass alle Zellen positiv für das epithelspezifische Zytokeratin waren. Menschliche Bronchialzellen der Unterkuhlur, bis zur Teilconfluenz gezüchtet in T-75-Flaschen, sind hier dargestellt. Beachten Sie das gepflasterte Erscheinungsbild.

Menschliche subkultivierte Bronchialzellen zeigten eine einheitliche positive Immunfärbung für Keratin und E-Cadherin. Die Immunfärbung mit spezifischen Antikörpern gegen andere Zelltypen zeigte keine Hinweise auf eine Kontamination der Kulturen durch Fibroblasten, mesenchymale oder endotheliale Zellen. Weitere Einzelheiten finden Sie in Abbildung fünf und deren Legende im Text. Zellen, die auf permeablen Polyester­membranen oder Transwells mit oder ohne Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert wurden, differenzierten sich zu einem ciliären Epithel aus, wie hier dargestellt. Verwerfen Sie Zellen und deren oder Transplantate, wenn Zellen mit einer abweichenden Morphologie, wie hier gezeigt, auftreten. In diesem Protokoll stellen wir detaillierte Methoden zur Kultur und Expansion primärer humaner bronchialer Epithelzellen vor.

Studien an menschlichen Zellen sind erforderlich, um wichtige Signalwege der Krankheitsmechanismen bei menschlichen Lungenerkrankungen zu bestimmen und um Toxizität sowie pharmakologische Wirkungen neuartiger Arzneimittel zu untersuchen. Wir hoffen, dass die hier beschriebenen Methoden Sie ermutigen, humane bronchiale Epithelzellen aus Explantaten zu kultivieren und diese Zellen in Ihren Untersuchungssystemen einzusetzen. Vielen Dank und viel Erfolg.