Studium synaptischer Vesikel Pools mit Photokonversion Styrylfarbstoffe

Dieses Video zeigt das Verfahren zur photochemischen Umwandlung des Farbstoffs Styro Dye FM 1 43. Um synaptische Vesikel-Pools in Drosophila melanogaster zu untersuchen, werden zunächst Drosophila-Larven präpariert, um die ventralen Muskeln freizulegen, die die neuromuskuläre Verbindung oder NMJ-Präparation bilden. Die Präparationen werden in einem Puffer inkubiert, der FM D enthält, hier in Grau dargestellt, zur Markierung der zellulären Membran.

Anschließend werden sie elektrisch oder chemisch stimuliert, um die physikalische Fusion der Vesikelmembran, die danach internalisiert wird, auszulösen. Die stimulierte Exozytose wird mit FM D. angefärbt. Der extrazelluläre FM-Farbstoff wird dann ausgewaschen, wodurch er von der Plasmamembran entfernt wird, und das Gewebe wird unter kontinuierlicher Bestrahlung mit hoher Intensität fixiert. Der Farbstoff wird vollständig ausgeblichen, und die schwarze Färbung entsteht aufgrund der Diaminobenzidinpräzipitation.

Dieser Niederschlag kann dann mittels Transmissions-EM sichtbar gemacht werden. Hallo, ich bin Philippe o Paso aus dem Labor von Sylvia Olli am European Neuroscience Institute in Göttingen, Deutschland. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur FM-Foto-Umwandlung an der neuromuskulären Endplatte.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die synaptische Vesikelrecycling zu untersuchen. Beginnen wir also. Arbeiten Sie unter einem Stereomikroskop und fixieren Sie eine Drosophila-Larve mit der dorsalen Seite nach oben in einer mit Sylgard beschichteten Petrischale.

Bedecken Sie es mit Drosophila-Salzlösung unter Verwendung einer Spritzennadel und schneiden Sie mit der Schere entlang der dorsalen Seite. Entfernen Sie anschließend die inneren Organe. Danach strecken Sie das Präparat und befestigen es erneut in der Petrischale.

Mehrere ventrale Muskeln können dann genutzt werden, um die in diesem Verfahren verwendeten FM-Farbstoffe vor Ausbleichen zu schützen. Dieses Verfahren sollte unter lichtarmen Bedingungen durchgeführt werden. Bedecken Sie das präparierte Drosophila-Präparat mit Drosophila-Salzlösung, die 90 Millimolar Kaliumchlorid und 10 Mikromolar FM 1-43 enthält, um die Nerven chemisch zu stimulieren.

Einminütiges Inkubieren bei Raumtemperatur nach der Stimulation. Entfernen Sie die stimulierende Lösung und tauchen Sie die Schale mit der fixierten Drosophila in ein Becherglas, das zweimal mit 100 Milliliter Drosophila-Salzlösung gefüllt ist, um den extrazellulären FM 1 43-Farbstoff unter einer chemischen Sicherheitshaube zu entfernen.

Fixieren Sie die neuromuskuläre Junction-Präparation 45 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2,5 % Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung oder PBS. Spülen Sie das Präparat einmal mit PBS, nehmen Sie es dann aus der Zigarrenschale und tauchen Sie es 15 Minuten lang in 100 Millimolar Ammoniumchlorid ein, um die freien Aldehydgruppen des verbliebenen Glutaraldehyd-Fixativs zu quenchieren.

Spülen Sie die Ammoniumchloridlösung mit normaler PBS, geben Sie die Neuromuskulärverbindungsvorbereitung in eine neue Zigarrenschale und tauchen Sie sie in gefiltertes 1,5 Milligramm pro Milliliter Diaminbenzidin oder DAB in PBS ein und inkubieren Sie 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Positionieren Sie die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Quecksilberlampenlichtquelle ausgestattet ist, deren Lampengehäuse einen Rückspiegel enthält, unter Verwendung eines relativ niedrigen trockenen Objektivs mit geringer Vergrößerung.

Finden Sie die Probe. Bringen Sie dann mit einem normalen blauen Anregungsfilter für grüne Fluoreszenz das fluoreszierende Signal in den Fokus. Die neuromuskulären Junctions erscheinen als helle Punkte auf den Muskeln.

Danach die Probe unter Verwendung desselben Fluoreszenzfilter-Satzes mit maximaler Intensität beleuchten, bis das FM D vollständig gebleicht ist. Bei Verwendung eines 20x-Objektivs sollten 30 bis 45 Minuten ausreichen. Die Dauer der photochemischen Umwandlung variiert jedoch je nach Beleuchtungsintensität, Eindringtiefe von DAB in die Präparation und dem verwendeten Objektiv.

Nach der Beleuchtung das Probenmaterial im Durchlicht untersuchen. Falls eine photochemische Umwandlung stattgefunden hat, sollte ein dunkelbrauner Niederschlag sichtbar sein. Zurück zum Auflichtmikroskop wechseln und dann mit einer Schere die photochemisch umgewandelte Stelle aus der Larve herausschneiden.

Zurück zum Präparationsmikroskop. Anschließend mit einer Schere die photochemisch veränderte Stelle aus der Larve herausschneiden. Danach die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben, das PBS enthält, wobei unter einer chemischen Sicherheitshaube gearbeitet wird und geeignete Schutzausrüstung getragen wird, einschließlich Handschuhe und Augenschutz.

Bereiten Sie 300 Mikroliter einer 1 %igen Osmiumtetroxidlösung pro Probe vor. Geben Sie die Probe nun in einen mit Kunststoff verschlossenen Glasflasche und fügen Sie die vorbereitete Osmiumtetroxidlösung hinzu, um die Probe nachfixieren. Während die Probe inkubiert, bereiten Sie getrennte Lösungen mit 30, 50, 70, 90, 95 und 100 % Ethanol vor.

Waschen Sie die Probe vier bis fünfmal mit PBS, jeweils fünf Minuten lang. Nach jedem Waschschritt verwenden Sie einen Kunststoff-PEs an Ihrer Pipette, um die Probe in einen neuen Kolben zu überführen. Nach dem letzten Waschgang überführen Sie die Probe in einen sauberen Glaskolben.

Als Nächstes dehydrieren Sie die Probe, indem Sie sie in eine Reihe von Ethanol-Lösungen geben. Beginnen Sie mit der Inkubation in einem Milliliter 30 % Ethanol. Danach entfernen Sie nach fünf Minuten das Ethanol mit einer Pasteur-Pipette und ersetzen es durch einen Milliliter 50 % Ethanol.

Fahren Sie mit der Dehydrierung fort, indem Sie das neuromuskuläre Junction-Präparat in den Lösungen mit 70, 90 und anschließend 95 % inkubieren. Anschließend wird die Probe öfter in 95 % Ethanol als dreimal in 100 % Ethanol nach der Dehydrierung inkubiert. Geben Sie zwei Milliliter Ein-zu-Eins-EIN-Harz zu Ethanol hinzu und stellen Sie die Probe auf einen Rotator zur Inkubation.

Zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur nach der Rotation bei 100 % EIN und stellen Sie die Probe in einem offenen Kolben, damit der restliche Ethanol vier bis sechs Stunden lang verdunsten kann. Gießen Sie frisches EIN in eine Form. Geben Sie die Präparationen hinzu und inkubieren Sie bei 60 Grad Celsius für 36 Stunden.

Wenn die eingebetteten EIN-Präparationen fertig sind, verwenden Sie einen Ultramikrotom, um mit einem Diamantmesser 50 bis 80 Nanometer dünne Schnitte I anzufertigen. Die Proben werden in dünne Schnitte geschnitten. Die Schnitte schwimmen auf dem Wasserbad des Messers und können anschließend auf normale EM-Gitter aufgebracht werden.

Die Präparationen sind nun bereit, mit herkömmlichen EM-Verfahren abgebildet zu werden. Isolierte neuromuskuläre Junctions von Drosophila melanogaster wurden mittels hohem Kaliumgehalt stimuliert und interne Membranen wurden mit FM 1-43 gefärbt, wie hier gezeigt.

Die Fluoreszenz eines Nervenendes kann mit einem herkömmlichen Epi-Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Unter kontinuierlicher Beleuchtung wird der Farbstoff vollständig ausgeblichen, und wenn die Beleuchtung fortgesetzt wird, erscheint aufgrund der Ausfällung von Dino-Benzin eine schwarze Färbung. Dieses Nervenende enthält synaptische Vesikel, aber keines davon ist photochemisch umgewandelt worden.

Das könnte darauf zurückzuführen sein, dass nicht genügend Beleuchtung vorhanden ist oder dass die DIA-Aminobenzin-Penetration im Gewebe unzureichend ist. Im Gegensatz dazu führt zu starke Beleuchtung zu einem insgesamt dunklen Endbereich, in dem keine Vesikel oder Organellen unterscheidbar sind; bei der geeigneten Beleuchtungsintensität ist die Photoumwandlung sichtbar. Dieses Mikrofoto zeigt ein synaptisches Bhuton, in dem ein Pool dunkler Vesikel zu sehen ist, was auf eine FM-Photoumwandlung hinweist.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man synaptische Vesikel, die mit fem die markiert sind, photochemisch umwandeln kann. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, stets sorgfältig die Beleuchtungszeiten für den Umwandlungsschritt zu kalibrieren. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.