DNA-basierte Fischarten Identification Protocol

Das Fischart-Identifizierungssystem ist eine einfache, schnelle und genaue DNA-basierte Methode zur Bestimmung der in einer gegebenen Probe enthaltenen Fischarten. Fischproben werden mit Proteinase K behandelt, um Nukleinsäuren in Lösung freizusetzen. Die genomische DNA des Fisches wird anschließend isoliert und mittels PCR mit Primern amplifiziert, die an Sequenzen binden, die in allen Fischgenomen vorkommen.

Die PCR-Produkte werden anschließend mit drei verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer aufgetrennt. Die bei den Verdauungsreaktionen entstehenden Fragmentlängen können verwendet werden, um die Fischart mithilfe von Restriktionslängenpolymorphismus oder RFLP-Muster-Software zu bestimmen. Hallo, ich bin Rachel Formosa von Agilent Technologies.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur DNA-basierten Identifizierung von Fischarten. Dieses Verfahren ist eine Screening-Methode, mit der Sie die in frischen, gefrorenen, zerkleinerten, gekochten, getrockneten oder anderweitig verarbeiteten Proben vorhandenen Fischarten identifizieren können. Und dies kann in weniger als einem Arbeitstag durchgeführt werden.

Wir verwenden dieses Verfahren, um die Authentizität von Meeresfrüchten zu untersuchen, was für die Fischwirtschaft von großer Bedeutung ist, da Substitutionen und Fehlbezeichnungen erhebliche wirtschaftliche, ökologische und lebensmittelsicherheitsrelevante Folgen haben können. Zudem kann es besonders schwierig sein, Fischarten durch visuelle Identifizierung und andere traditionelle Methoden zu bestimmen. Sobald ein Fisch verarbeitet wurde, liefert eine DNA-Analyse ein weitaus genaueres und zuverlässigeres Ergebnis.

Beginnen wir nun. Bereiten Sie die Proben für die DNA-Extraktion vor, indem Sie 10 bis 1000 Milligramm jeder rohen oder gekochten Fischgewebeprobe in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben. Fügen Sie zu jeder Fischprobe 220 Mikroliter frisch zubereitete Proteinase-K- Lösung hinzu und pipettieren Sie mehrmals auf und ab.

Inkubieren Sie die Röhrchen bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Anschließend zentrifugieren Sie sie für drei bis fünf Minuten bei 14.000 G, um unverdautes Gewebe zu pelletieren. Überführen Sie danach vorsichtig 150 Mikroliter des Überstands jedes Röhrchens in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen, wobei Sie unverdautes Material am Boden und öliges Material an der Oberfläche vermeiden sollten. Der Überstand wird nun für die genomische DNA-Extraktion verwendet.

Beginnen Sie die genomische DNA-Extraktion, indem Sie 500 µL Puffer zur Nukleinsäurebindung zu jeder Probe hinzufügen. Dadurch erhöht sich das Gesamtvolumen der Probe auf 650 µL. Vortexen Sie die Probe, bis sie homogenisiert ist.

Überführen Sie danach jede Probe in eine DNA-Bindungs-Spin-Säule, die in einem der beiden im Kit enthaltenen 2-ml-Auffangröhrchen platziert wurde. Setzen Sie den Verschluss des Röhrchens fest auf die Spitze der Spin-Säule. Zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang bei 14.000 G, um die DNA auf die Matrix der Spin-Säule aufzutragen.

Nach der Zentrifugation die Spin-Säulchen entnehmen, das Filtrat verwerfen und die Säulchen zurück in die Auffanggefäße stellen. 500 Mikroliter eines 1× Hochsalzwaschpuffers hinzufügen. Die Gefäße verschließen und erneut zentrifugieren.

Entfernen Sie das Filtrat und setzen Sie die Spin-Cups erneut in die Auffangröhrchen ein. Geben Sie nun 500 µL 80 % Ethanol hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 14.000 ×g für eine Minute.

Wiederholen Sie die Ethanol-Waschung nach dem dritten Waschgang in 80 % Ethanol noch zweimal, entsorgen Sie die Filtrate. Setzen Sie die Spin-Cups in die Auffangröhrchen zurück und zentrifugieren Sie diesmal zwei Minuten lang, um die Fasermatrix zu trocknen. Überführen Sie nun die Spin-Cups in 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen.

Geben Sie 100 Mikroliter Evolutionspuffer in jede Säulenkassette direkt auf die Fasermatrix innerhalb der Kassette. Danach verschließen Sie die Sammelröhrchen mit den Deckeln der Säulenkassetten und inkubieren sie eine Minute bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang mit maximaler Geschwindigkeit.

Als Nächstes entsorgen Sie die Spin-Säule und verschließen die Röhrchen. Es werden DNA-Konzentrationen im Bereich von fünf Nanogramm pro Mikroliter bis 500 Nanogramm pro Mikroliter erwartet. Die DNA kann nun bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius gelagert werden; für die Langzeitlagerung sollte die DNA bei minus 20 oder minus 80 Grad Celsius aufbewahrt werden.

Führen Sie die PCR mit den im P-C-R-R-F-L-P-Reagenzkit bereitgestellten Primern und Reagenzien durch. Gemäß dem beigefügten schriftlichen Protokoll wird empfohlen, jede Probe einschließlich der positiven und der No-Template-Kontrolle in Duplikat zu analysieren, während die PCR läuft. Bereiten Sie Master-Mixe für die Restriktionsenzyme für die Verdauungen mit DTE E one HAE three und NL three vor, indem Sie die folgenden Komponenten der Reihe nach kombinieren: 1,5 µL sterilem destilliertem Wasser, 0,5 µL 10×-Enzympuffer und 0,5 µL 10×-Enzym.

Bereiten Sie ausreichend für alle Proben plus ein Reaktionsvolumen, überschüssiges Fourex-drei-Reagenzgemisch vor. Verteilen Sie anschließend 2,5 µL auf jedes Reaktionsröhrchen, das mit Proben- und Enzymnamen beschriftet ist. Sobald die PCR abgeschlossen ist, nehmen Sie die Proben vom Thermocycler und stellen Sie sie auf Eis.

Fügen Sie 2,5 Mikroliter jedes PCR-Produkts zu jedem der drei Restriktionsverdauungsgefäße für diese Reaktion hinzu: DDE1, HAE3 und NLA3. Anschließend wirbeln.

Zentrifugieren Sie kurz und inkubieren Sie die Verdauungsansätze bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Falls praktischer, können die Verdauungsansätze auch über Nacht inkubiert werden. Nach dem Verdau inkubieren Sie die Ansätze bei 65 Grad Celsius für 15 Minuten.

Fügen Sie dann ein Mikroliter 60 Millimolar EDTA zu jedem Reaktionsgefäß hinzu, um die Reaktion zu beenden, und wirbeln Sie die Probe kurz. Bereiten Sie mithilfe des Agilent Bioanalyzer-Reagenzienkits das Restriktionsverdauungsprodukt vor, und laden Sie es gemäß der Anleitung des Kits in die Vertiefungen eines DNA-Chips. Für jede Probe sollten alle drei Verdauungsansätze auf demselben Chip aufgetragen werden.

Danach den Chip vortexen und in das Gerät einlegen. Nach Beendigung des Laufs wechseln Sie zum Assay-Kontext und wählen die Registerkarte „Chip-Zusammenfassung“. Geben Sie im Feld „Probenname“ einen Probennamen für alle 12 Vertiefungen des Chips ein, um die Fischart für die Test-DNA-Proben zu identifizieren.

Starten Sie das RFLP-Decoder-Programm, indem Sie auf Datei klicken. Öffnen Sie dann die XAD-Datei. Der Dialog zum Öffnen wird angezeigt.

Wählen Sie nun die XAD-Datei für den verwendeten DNA-Chip aus. Klicken Sie auf „Öffnen“, um eine Liste der auf dem Chip geladenen Proben anzuzeigen. Wählen Sie die drei Verdauungen aus, die der ersten DNA-Probe entsprechen.

Unter der Enzymspalte geben Sie die Restriktionsenzyme an, die im Feld mit der Bezeichnung Mindestspitzenhöhe als Prozentsatz des unteren Markers verwendet wurden. Der Standardwert beträgt 10 %, falls erforderlich. Dieser Wert kann gesenkt werden, um kleine, zuvor übersehene Spitzen zu erkennen, oder erhöht werden, um Spitzen zu verwerfen, die durch unspezifisches Rauschen im Elektropherogramm entstehen.

Nachdem Sie Anpassungen am Mindestgipfelhöhenwert vorgenommen haben, klicken Sie auf „Reintegrieren“. Klicken Sie nun unten im Dialogfeld auf „Berechnen“. Die aus dem Bioanalyzer-Lauf gewonnenen Daten zur Fragmentlänge werden die Softwarefelder füllen.

Als Nächstes im Bewertungsmenü in der oberen linken Ecke des Bildschirms „Würfel“ auswählen. Wenn die Fischprobe aus einer einzelnen Fischart oder einer Mischung besteht, und wenn die Probe möglicherweise eine Mischung enthält, wird die Tabelle am unteren Bildschirmrand mit der Bezeichnung kombinierte Bewertungsliste angezeigt. Die besten Artzuordnungen basierend auf den Ergebnissen aller drei Verdauungsreaktionen.

Perfekte Übereinstimmungen mit einem Wert von eins sind grün hervorgehoben. Nahe Übereinstimmungen werden gelb am oberen Bildschirmrand hervorgehoben. Der untere Grenzwert legt die minimale Fragmentgröße fest, die in der Analyse verwendet wird, und der Toleranzwert für Übereinstimmungen bestimmt, wie ähnlich die Länge eines Fragments der vorhergesagten Fragmentlänge sein muss, um als Übereinstimmung zu gelten.

Die angezeigten Werte entsprechen den Standardeinstellungen und können angepasst werden. Wiederholen Sie diese Schritte zur Analyse der verbleibenden DNA-Proben auf der Spitze. DNA-Proben von vier verschiedenen Fischarten wurden isoliert, amplifiziert und mit der in diesem Video beschriebenen Methode verdaut.

Ein Bioanalyzer-Gel, das die Restriktionsverdauungsproben zeigt, wird hier unter Verwendung des Agilent Bioanalyzer und des RFLP-Decoders dargestellt. Softwarebasierte Bandenmuster werden hier verwendet, um die Fischarten zu identifizieren. Die erste Probe wird korrekt als Forelle identifiziert, die zweite als Thunfisch, die dritte als Steinbutt.

Und die letzte Probe als spezifischen Kabeljau. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine DNA-basierte Identifizierung von Fischarten mithilfe der P-C-R-R-F-L-P-Methode von Agilent durchführt. Bei dieser Methode ist es wichtig, eine Kreuzkontamination der Proben zu vermeiden, da das Verfahren äußerst empfindlich ist.

Das war's. Nun wissen Sie, wie Sie die in Ihren Proben vorhandenen Fischarten schnell, einfach und genau identifizieren können. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.