Laser Mikrodissektion Angewandt auf Gene Expression Profiling von Untergruppe von Zellen aus dem Drosophila Wing Disc

Hier geben wir eine ausführliche Beschreibung der Laser-Mikrodissektion zur Durchführung eines vergleichenden RNA-Transkript-Profiling von stummen und nicht stummen Bereichen der Drosophila-Flügelscheibe. Dieser Ansatz benötigt als biologisches Material manuell präparierte Drosophila-Imaginalscheiben sowie als Hauptgerät einen Laser-Mikrodissektor. Wir verwenden den LI A-L-L-M-D 6,000 und eine Echtzeit-PCR-Maschine.

Wir verwendeten ein BioRad iq. Fünf kleine benötigte Werkzeuge sind eine konkave Platte, ein kleiner Pinsel, Mikrodissektionspinzette, Hänge-Tropfen-Objektträger mit Insektenstiften, montiert auf Spritzennadeln, ein Metallrahmen mit Pet-Membran und kleine Plastikröhrchen. Diese Methode umfasst die folgenden Schritte.

Schritt eins: Kreuzung zweier geeigneter oph-transgener Linien, um eine lokalisierte und spezifische Genstilllegung in der Nachkommenschaft unter Verwendung des GAL4-UAS-Systems auszulösen. Schritt zwei: Behandlung der Präparationshalterungen. Schritt drei: Einrichten des Laser-Mikrodissektors.

Schritt vier: manuelles Sammeln der Flügel-Imaginalanlagen aus den larvalen Nachkommen des genetischen Kreuzes. Schritt fünf: Durchführung der Laser-Mikrodissektion spezifischer Bereiche der mit GFP markierten Imaginalanlagen. Schritt sechs: Die Transkriptionsprofilerstellung vergleichbarer Bereiche stummer und nicht stummer Regionen der Anlage ermöglicht die Ermittlung der Effekte, die durch die Stummschaltung Ihres Gens der Interesse ausgelöst werden.

Die in vivo-Transkriptionsprofilerstellung für das Gen X erfordert die Isolierung von RNA aus mikrodissezierten Bereichen, die Kontrolle der Genauigkeit der manuellen Dissektion, die Beurteilung der GFP-Expression in den beiden Proben mittels RT-PCR sowie die Quantifizierung der Expression putativer Zielgene des stillgelegten Gens in den beiden Proben entweder durch Echtzeit-RT-PCR oder durch Durchführung einer Microarray-Analyse. Nun weitere Details zu jedem Schritt.

Der erste Schritt, die genetische Kreuzung. Die genetische Kreuzung umfasst GAL4-UAS-transgene Stämme und zielt darauf ab, in der larvalen Nachkommenschaft stillgelegte Imaginalanlagen zu erhalten. Das vielseitige GAL4-System ermöglicht es Ihnen, gezielte und lokal begrenzte Genstilllegung durch RNA-Interferenz auszulösen.

Ein Stamm bringt in den Kreuzungsansatz das Treibergen ein, das GAL4 in einem bestimmten zeitlichen oder räumlichen Muster exprimiert, sowie einen A-U-A-S-G-F-P-Reporter, der die Visualisierung des Expressionsbereichs von GAL4 ermöglicht. Der zweite Stamm führt ein UAS-Responder-Gen ein, das einen Haarnadel-silencing-RNA-Transgen exprimiert, das in der Lage ist, nach Expression in der Zelle gezielt das Gen X zu targeten.

Diese RNA wird gespalten, um kleine interferierende RNA zu erzeugen, die das ausgewählte Gen X in der Nachkommenschaft dieses Kreuzes spezifisch stilllegen kann. Das UAS-Stilllegungs-Transgen wird nur in den Zellen transkribiert, die das GAL4-Protein exprimieren, wodurch eine räumlich begrenzte Stilllegung des Gens X induziert wird. Unter der Vielzahl möglicher Anwendungen konzentrierten wir uns auf die Profilierung von RNA-Transkripten in der durch den Grailed-GAL4-Treiber stillgelegten Flügelscheibe, der eine spezifische Stilllegung im hinteren Kompartiment vermittelt.

Der Stilleregionsbereich ist gekennzeichnet durch die Expression des U-A-S-G-F-P-Transgens im hinteren Kompartiment. Zwei Ereignisse werden ausgelöst: die Expression von GGFP und die Stilllegung des Gens x.

Schritt zwei, Behandlung der Dissektionsrahmen zur Hemmung der RNase-Aktivität. Spülen Sie die Objektträger und das Dissektionsbesteck mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit DEPC-Wasser und lassen Sie sie in einer sterilen Kammer trocknen. Um die RNase-Aktivität zu hemmen, verwenden Sie eine nagelneue 50-ml-Röhrchen, die bereits RNase-frei ist, gefüllt mit DEPC-Wasser, in das Pinzette, einen Hänge-Tropfen-Objektträger und einen Petri-Rahmen gelegt werden.

Beides benötigt für die Mikrodissektion. Schließen Sie das Röhrchen, drehen Sie es auf den Kopf und lassen Sie es mindestens eine Stunde lang reagieren. Bei Raumtemperatur, eine Stunde später, überführen Sie das DEPC-Wasser mit der Pinzette in ein anderes Röhrchen.

Halten Sie die Objektträger in der Röhre, damit sie nicht herunterfallen. Lassen Sie die Objektträger dann in der Röhre trocknen. Schritt drei, Einrichten der Mikrodissektion.

Schalten Sie zunächst alle benötigten Geräte ein: die Fluoreszenzlampe, das Mikroskop und die Software für die Mikrodissektion. Ein Warnfenster erinnert Sie daran, auch den Laser einzuschalten. Tun Sie dies und lassen Sie den Laser aufheizen, während Sie die Einrichtung der Mikrodissektion abschließen.

Jetzt ist es an der Zeit, die Vertiefungen vorzubereiten, in denen das Gewebe gesammelt wird. Die Laser-Mikrodissektionsanlage Leica LMD 6,000 ermöglicht das Laden von bis zu vier Röhrchen, um verschiedene Proben zu sammeln. Für unseren Zweck benötigen wir lediglich zwei Röhrchen.

Einmal, um das GFP-positive stille Gewebe zu sammeln, und einmal, um das GFP-negative einheitliche Gewebe mit einem Mikro-Pipettenspitzen-System zu gewinnen. Füllen Sie beide Probengefäßdeckel mit je 20 Mikrolitern Tri-Reagens-Lösung, um die RNA zu stabilisieren. Nun ist die Mikrodissektion betriebsbereit. Schritt vier: manuelle Dissektion von Flügel-Imaginalanlagen aus Joof-Larven.

Isolieren Sie die Imaginalscheiben aus den larvalen Nachkommen, die zuvor beschrieben wurden, und stellen Sie sicher, dass keine anderen Gewebe die Scheiben verunreinigen. Um dieses Ziel zu erreichen, unterscheidet sich die Präparationstechnik deutlich von der, die üblicherweise zum Sammeln der Gesamtheit der ursprünglichen Scheiben verwendet wird. Waschen Sie zunächst die Larve in Ringer-Lösung, um anhaftendes Medium zu entfernen. Übertragen Sie sie dann auf eine Hänge-Tropfen-Präparation und schneiden Sie den Kopf ab, wobei Sie sofort den Mund nach unten ziehen.

Entfernen Sie mit den Insektennadeln nun vorsichtig das umliegende Gewebe. Die rote Umrandung zeigt die zu sammelnden Imaginalflügelscheiben an. Halten Sie die Scheiben schnell und schonend frei von anhaftendem Gewebe. Überführen Sie jede isolierte Flügelscheibe in einen Präparationsrahmen für den unmittelbaren Schnitt.

Dieses Verfahren muss wiederholt werden, bis eine Gesamtanzahl von hundert Flügelscheiben erreicht ist. Schritt fünf: Laser-Mikrodissektion spezifischer Bereiche von GFP-markierten Flügelscheiben. Sobald die ursprüngliche Flügelscheibe auf der Membran liegt, kann mit dem Schneiden fortgefahren werden.

Stellen Sie den Rahmen auf seinen Halter und befestigen Sie den Halter auf der motorisierten Probebühne. Suchen Sie die ursprüngliche Flügelscheibe mit dem LMD 6.000 als herkömmlichem Mikroskop. Fokussieren Sie sie und legen Sie den Schnitt fest.

Zeichnen Sie einen ovalen Bereich, der auf beiden Seiten der Scheibe passt, die GFP-positive und die andere. Wählen Sie die Tubenkappe aus, in der Sie den GFP-positiven Teil sammeln möchten. Drücken Sie die Schaltfläche „Start cut“.

Der Mikro-Dissektor führt den Schnitt des Gewebes mit der zuvor eingestellten Geschwindigkeit und Leistung durch, indem Sie die Funktion „Bewegen und Schneiden“ auswählen. Sie können den Schnitt manuell verfeinern, bis das nicht ausgewählte Gewebestück abfällt. Die 3D-Animation zeigt, was unterhalb des Mikro-Dissektors geschieht: Ein Laser wird auf das Gewebe fokussiert und führt entlang des ausgewählten Umfangs einen Schnitt aus.

Nachdem der Schnitt erfolgt ist, fällt das Gewebestück in die ausgewählte Röhrchenkappe und anschließend in das Tri-Reagens. Nach dem ersten Schnitt verschieben Sie den Schneidbereich auf die andere Seite der Flügelscheibe, um einen entsprechenden GFP-negativen Bereich zu schneiden. Stellen Sie vor dem nächsten Schnitt sicher, dass Sie eine andere Röhrchenkappe auswählen, um die GFP-positiven Gewebe von den GFP-negativen getrennt zu halten.

Drücken Sie nach dem automatischen Schneiden die Start-Schnitt-Taste. Fahren Sie anschließend mit der manuellen Feinbearbeitung des Schnitts fort, wie in der 3D-Animation vor dem zweiten Schnitt gezeigt. Der motorisierte Tisch bewegt die ausgewählte Röhrchenkappe unter den Schneidbereich.

Der Laserstrahl fokussiert sich auf das Gewebe, das entlang des ausgewählten Umfangs geschnitten wird, und sobald der Schnitt abgeschlossen ist, fällt das Gewebestück in die ausgewählte Röhrchenkappe, die Tri-Reagenz enthält. Um genügend Material zu sammeln, wiederholten wir den Vorgang an hundert imaginalen Flügelscheiben. Sobald Sie die Proben gesammelt haben, entnehmen Sie die Röhrchen.

Dies ist ein empfindlicher Schritt, bei dem Sie alle bisher geleistete Arbeit verlieren könnten. Seien Sie daher vorsichtig. Schließen Sie die Kappe verkehrt herum und fahren Sie mit dem Experiment fort.

Dies ist die Probe mit GFP-positivem Gewebe. Dies ist die andere Probe mit GFP-negativem Gewebe. Schritt sechs, Transkriptionsprofilanalyse.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen, um die Flüssigkeit vom Verschluss zu lösen, und geben Sie Try-Reagenz bis zu einem Milliliter hinzu. Führen Sie die RNA-Extraktion gemäß dem Standard-Try-Reagenz-Protokoll aus hundert Bereichen von jeweils etwa 5.000 Quadratmikrometern durch. Unsere Ausbeute betrug 1,5 Mikrogramm RNA.

Wir verwenden dreifach markiertes Vitrögen, um CD NA mit zufälligem Hexa zu synthetisieren. Die Genauigkeit der manuellen Dissektion wurde durch Überprüfung der GFP-Expression in den beiden Proben mittels R-T-P-C-R kontrolliert. Wie im Gel mit quantitativer R-T-P-C-R gezeigt.

Wir untersuchten die Expressionslevel des stillen Gens X zusammen mit denen möglicher putativer Zielgene des durch Gen X vermittelten regulatorischen Signalwegs. Dieses Diagramm zeigt ein Beispiel für die Expressionslevel von Gen X und einem seiner putativen Zielgene. Bezeichnen Sie diese als Gene Y in Bezug auf ihre basalen Expressionslevel in den anterioren und posterioren Kompartimenten von unsoliden Flügelscheiben.

Die Aktivität des ausgewählten Gens X zeigte sich nach der Stilllegung auf 40 % reduziert. Im Gegensatz dazu wurde eines seiner putativen Zielgene, Gen Y, signifikant hochreguliert, was eine siebenfache Zunahme bedeutet, wodurch wir die Hypothese bestätigen konnten, dass es durch Gen X negativ reguliert wird. Wir schlussfolgern, dass der oben beschriebene experimentelle Ansatz erfolgreich zur Validierung putativer Zielgene in verschiedenen regulatorischen Wegen angewendet werden kann.