Optical Microscopy Scatter auf zweidimensionalen Gabor-Filtern

In diesem Video wird die Lichtstreu-Mikroskopie verwendet, um die mitochondriale Fragmentierung während der Apoptose zu quantifizieren. Obwohl die Lichtstreu-Mikroskopie normalerweise keine Fluoreszenz erfordert, werden im vorliegenden Protokoll fluoreszenzbasierte Aufnahmen zur Validierung angefertigt. Nach der Einrichtung des Abbildungssystems werden die Zellen mit MIT-Tracer-Grün markiert und mit Storsporin behandelt, um die Apoptose auszulösen.

Optische Daten werden erfasst, um Veränderungen in der Ausrichtung zellulärer Organellen innerhalb von zwei Stunden nachzuweisen. Der Beginn der mitochondriellen Fragmentierung kann anhand der optisch gestreuten Daten gemessen werden, die eine Abnahme des Orientierungsgrads subzellulärer Partikel anzeigen. Die Daten werden anschließend validiert, indem die optisch gestreuten Daten mit den fluoreszierenden Bereichen, die Mitochondrien enthalten, korreliert werden.

Hallo, ich bin Nada Bustani vom Bio-Optik-Labor am Fachbereich für Biomedizinische Technik an der Rutgers University. Ich bin Rob Pak vom Bio-Optik-Labor, und ich bin Deen ebenfalls vom Bio-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Quantifizierung subzellulärer morphologischer Dynamiken mithilfe einer Methode, die nicht auf fluoreszierenden Farbstoffen basiert.

Wir verwenden diese Technik in unserem Labor, um dynamische Veränderungen der subzellulären Struktur während der Apoptose oder programmierten Zelltod zu untersuchen. Beginnen wir also. Starten Sie dieses Verfahren, indem Sie behandschuhte Hände mit 70 % Ethanol sterilisieren.

Danach eine vorbereitete 100 Nanomolar-Stammlösung von Miot Tracker Green und vorgewärmtes BAEC-Zellkulturmedium in der Haube bei ausgeschaltetem Licht platzieren und alle Oberflächen sterilisieren. Anschließend eine 6-Loch-Kulturschale mit auf Deckgläsern ausplattierten Zellen unter die Haube stellen. Unter Verwendung einer Pasteurpipette, die an eine Vakuumleitung angeschlossen ist.

Entfernen Sie das Zellmedium aus den Vertiefungen. Geben Sie dann umgehend zwei Milliliter des markierten Mediums in jede Vertiefung, um die Zellen.Mitochondrien zu markieren. Decken Sie die Zellkulturplatte ab, um eine Belichtung durch direktes Raumlicht zu verhindern, und stellen Sie die Platte schnell wieder in den Inkubator.

30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, während die Zellen inkubieren. Bereiten Sie zunächst die optische Aufbauten vor, indem Sie die Quecksilberbogenlampe einschalten. Schalten Sie dann den Computer, die Mikroskopkameras und den Laser ein, und stecken Sie das digitale Mikrospiegelsystem oder DMD in den rotierenden Diffusor ein.

Als Nächstes blicken Sie durch das Mikroskopokular, um zu überprüfen, ob die optische Kopplung ausgerichtet ist. Das Sichtfeld sollte gleichmäßig hell durch Laserlicht beleuchtet sein. Um die Probe aufzubringen, geben Sie ein bis zwei kleine Tropfen Immersionsöl auf ein 63x-Ölimmersionsobjektiv, während dieses vollständig abgesenkt ist.

Danach wird auf dem Objekttisch eine Objektträgerplatte mit einem Raster aus Linien in regelmäßigen Abständen von 10 Mikrometern, das sogenannte Gradi, befestigt, und das Objektiv wird so weit angehoben, dass das Öl es benetzt und scharfgestellt wird. Anschließend wird die sechseckige Kante des Kondensorfeldes fokussiert. Stoppen Sie, sobald eine zentrierte Köhler-Beleuchtung erreicht ist.

Die sechseckige Kante sollte im Okular zentriert und scharf fokussiert sein. Anschließend mit den Justierknöpfen für die Kondensorblende die Kondensorblende über dem Sichtfeld zentrieren. Starten Sie das IP-Labor und geben Sie die Einstellungen zur Kamerasteuerung ein.

Stellen Sie sicher, dass die Kamera auf den Frame-Transfer-Modus eingestellt ist. Führen Sie den Befehl zum Erfassen des Fokus aus, um die Live-Vorschau zu starten. Anschließend legen Sie das Index-Präfix und den Speicherort für die Bilder fest.

Als Nächstes starten Sie das RS-Bild. Legen Sie die Einstellungen für die Bedienung der Cool-Snap-Kamera fest. Der Taktemodus sollte auf normal eingestellt werden.

Starten Sie die DMD-Software. Platzieren Sie die Dunkelfeldblende im Skriptmenü. Klicken Sie anschließend auf Laden und Zurücksetzen.

Um das Skript manuell auszuführen, stellen Sie den Optiv-Balken des Mikroskops im Ansichtsfenster auf LSM. Dadurch wird das Bild durch die DMD in der justierten Optik gesendet. Projektion des Dunkelfeldbildes auf die CCD des Cascade Five 12-Kameras.

Das Dunkelfeldbild sollte in der Live-Vorschau in IP Lab angezeigt werden. Fokussieren Sie gegebenenfalls das Bild in der Live-Vorschau. Stellen Sie die Belichtungszeit so hoch ein, dass mindestens 10.000 Signalzähle im Bild gewährleistet sind.

Nehmen Sie anschließend eine Momentaufnahme des Sichtfelds mit dem Befehl „Einzelbild aufnehmen“ nach der Aufnahme auf. Verwenden Sie den Befehl „Als indiziert speichern“, um das Bild auf der Festplatte zu speichern. Das Bild des GTI misst die Größe des Sichtfelds.

Bewegen Sie nun die GTI-Probe so, dass sie außerhalb des Sichtfeldes liegt und nur der Hintergrund sichtbar ist. Erfassen Sie ein Hintergrundbild des Feldes mit einer Belichtungszeit, die ausreicht, um mindestens 5.000 Counts zu erzielen. Dieses Bild wird bei der Hintergrundsubtraktion der ungefilterten Bilder helfen.

Nun, um Gabor-gefilterte Bilder des Hintergrunds zu erfassen, laden Sie das Gabor-Filterbank-Skript in die DMD-Steuerungssoftware. Führen Sie das gesamte Skript aus, um die Filter im Onboard-Speicher des DMD zu puffern. Dies kann einige Minuten dauern, sobald das gesamte Skript gepuffert ist.

Verwenden Sie die Start- und Stopp-Marker in der DMD-Software, um sicherzustellen, dass jeweils nur ein Satz Filter geladen wird, der einem Gabor-ähnlichen Filter entspricht. Führen Sie das Skript aus, um gefilterte Bilder des Hintergrunds aufzuzeichnen. Die Live-Bildvorschau sollte sich vom Dunkelfeld zum gefilterten Bild ändern.

Öffnen Sie für diesen Filter das Akquisskript in IP Lab von der Festplatte. Passen Sie die Belichtungszeit so an, dass mindestens 2000 Zählwerte erfasst werden. Während das DMD-Skript läuft, beenden Sie die Live-Vorschau in IP Lab und führen das Akquisskript aus.

Dadurch wird automatisch ein Index erfasst und das gefilterte Bild auf der Festplatte gespeichert. Sobald das erste Bild aufgenommen ist, beenden Sie das Skript in der DMD. Löschen Sie die verwendeten Befehle aus dem Skript.

Danach ersetzen Sie die Start- und Stopp-Marker am Anfang und Ende des nächsten Filter-Satzes. Wiederholen Sie die Aufnahme im IP-Labor, bis der gesamte Filterbank verwendet wurde und alle gefilterten Bilder aufgenommen und gespeichert sind. Bereiten Sie das Ausplattieren der Zellen vor, indem Sie ein Lötkolben auf der Laborbank einschalten und das L-15-Medium auf 37 Grad Celsius erwärmen.

Richten Sie einen Arbeitsplatz mit einem Papiertuch und einem Kim-Tuch ein, um verschüttetes Medium aufzufangen und den Bereich sauber zu halten. Bereiten Sie mehrere Dochte vor, indem Sie Kim-Tücher zerreissen und verdrehen. Die Dochte werden verwendet, um die Flüssigkeit durch die Zellplatte zu ziehen.

Verwenden Sie anschließend den metallenen Probenträger, um ein Zell-Sandwich herzustellen. Tragen Sie mit einer Spritze einen dünnen Strang Vakuumfett entlang dem oberen Rand des Lochs in der bearbeiteten Metallplatte auf, etwa bis zur halben Strecke zu den Enden der Nuten auf jeder Seite. Führen Sie vorsichtig eine saubere Deckglasnummer eins auf das Fett.

Drehen Sie die Platte um und tragen Sie das Fett um das Loch herum auf. Schalten Sie das Raumlicht aus, während Sie ethanolsterilisierte NI-Prüfungs-Handschuhe tragen. Entnehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator.

Entfernen Sie den Deckel, der für das Experiment verwendet wird, aus der sechsbrüdrigen Platte. Trocknen Sie den Deckel vorsichtig ab. Drücken Sie den Deckel dann mit der Zellseite nach unten in die gefettete Metallplatte über die Betrachtungsöffnung.

Die Zellen in der Platte einschließen. Sicherstellen, dass keine Luftblasen verbleiben und dass das Vaseline eine wasserdichte Abdichtung gebildet hat, sodass Medium zugegeben werden kann. Nun die Platte umdrehen und jeweils 200 Mikroliter pipettieren.

Geben Sie vorgewärmtes L-15-Medium über die Nut zwischen dem oberen Deckglas und der Metallplatte in das Sandwich, bis die Flüssigkeit fast die gegenüberliegende Nut erreicht. Waschen Sie anschließend die Zellen, indem Sie an der gegenüberliegenden Nut einen Docht ansetzen und weitere 200 µL Medium mit einer Pipette in das Sandwich geben. Das Medium fließt von einer Seite zur anderen, während der Docht das alte Medium entfernt.

Seien Sie vorsichtig, um zu verhindern, dass während dieses Schritts Blasen in der Flüssigkeit entstehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei bis drei Mal unter Verwendung eines neuen Dochts für jede Spülung. Drehen Sie die Platte nun erneut um, wobei Sie die Platte an den Rändern abstützen, um die Flüssigkeit im Zellreservoir einzuschließen.

Tauchen Sie das Lötkolbenelement in den Veap-Becher, um etwas Veap schnell schmelzen zu lassen, das dann an der Spitze der Lötkolbenlage haften bleibt. Tragen Sie mit der Spitze des Lötkolbens vorsichtig das schmelzende Veap entlang der Ränder der unteren Deckglasplatte auf. Fahren Sie fort, indem Sie erneut eintauchen und das Veap entlang des gesamten Umfangs des Deckglases auftragen, um dieses mit der Metallplatte abzudichten.

Dadurch entsteht eine gute mechanische Abdichtung, sodass die Deckglasplatte während der Betrachtung nicht von der Platte abfällt. Reinigen Sie Rückstände von der Unterseite, indem Sie ein Kim-Tuch zusammenknüllen und die Deckglasoberfläche säubern.

In einem einzigen Gleitvorgang auffällen, um sicherzustellen, dass die Deckglasmitte, die betrachtet wird, am saubersten ist. Stellen Sie die sechs Wandplatten in den Inkubator zurück. Bringen Sie die beplatteten Zellen ins Optiklabor und montieren Sie sie am Objektiv an.

Wie zuvor ein Feld mit gesund aussehenden Zellen finden und ein Dunkelfeldbild des Sichtfelds aufnehmen. Anschließend das Mikroskop im DIC-Modus justieren und sicherstellen, dass die Belichtungszeiten angemessen sind. Ein DIC-Bild mit einer Kaskadenkamera aufnehmen.

Bei dieser Einstellung werden fluoreszente Bilder mit der cool SNAP-Kamera aufgenommen, während das Mikroskop weiterhin im DIC-Modus justiert ist. Stellen Sie die Mikroskop-VAR auf einfache Vergrößerung ein und den Bildausschnitt auf 100 % Binokular und leiten Sie das Bild vom Okular zum Kamerapfad um. Platzieren Sie eine blaue LED über dem Kondensor, um das Sichtfeld zu beleuchten.

Überprüfen Sie dann das Sichtfeld im RSS-Bild und stellen Sie den Feinfokus entsprechend ein. Falls erforderlich, nehmen Sie ein DIC-Bild auf und speichern Sie es auf der Festplatte. Achten Sie darauf, wie sich das Sichtfeld von dem unterscheidet, das mit der Kaskadenkamera erhalten wurde.

Diese Bilder müssen während der Analysephase des Experiments registriert werden. Danach bewegen Sie den Fluoreszenz-Filtercubus in die Position und nehmen ein Fluoreszenzbild auf, indem Sie die Fluoreszenzanregung kurz über den Mikroskop-Verschluss einschalten und sie unmittelbar nach Abschluss der Aufnahme wieder ausschalten. Um die Photobleiche zu minimieren, speichern Sie das Fluoreszenzbild auf der Festplatte.

Um gefilterte Bilder zu erhalten, stellen Sie das Mikroskop erneut auf das Feld ein und leiten Sie das Licht durch den LSM-Port. Führen Sie wie zuvor das gesamte Skript der Gabor-Filterbank aus, um die Datenaufnahme für einen Zeitpunkt abzuschließen, während sich die Zellen noch auf dem Objektträger befinden und das Sichtfeld nicht gestört wird. Verwenden Sie die Kapillarmethode, um das reguläre L-15-Medium durch dasselbe Medium zu ersetzen, das eine einmikromolare Lösung von STS enthält.

Während des Experiments zusätzliches Medium hinzufügen, um Austrocknen zu verhindern, indem Medium in die Rille der Zellplatte pipettiert wird, ohne diese von der Stufe zu nehmen oder das Sichtfeld zu stören. Wiederholen Sie diese Schritte nun für nachfolgende Zeitpunkte, bis das Experiment abgeschlossen ist. Die gesammelten Daten umfassen eine große Anzahl gefilterter Bilder, die verarbeitet werden müssen, um die Daten zu den subzellulären Strukturen zu extrahieren.

Hier sind zwei Beispielversuche dargestellt. Diese Abbildung zeigt aufeinanderfolgende Bilder einer Probe mit marinen Diatomeen-Algen. Die orientierten Strukturen sind deutlich sichtbar.

Bei der Dunkelfeldmikroskopie werden die optisch gefilterten Bilder mit den Bezeichnungen fünf gleich null Grad bis fünf gleich 160 Grad neben dem ungefilterten Bild der Probe dargestellt. Zum Vergleich wurde der Satz der neun Gabor-gefilterten Bilder der Kieselalge pixelweise zur Objektorientierung verarbeitet.

An jedem Pixel wurde das maximale Signal durch das durchschnittliche Signal in Abhängigkeit von der Filterorientierung dividiert, um einen Aspektverhältniswert zu erhalten. Ein Aspektverhältnis nahe eins, dargestellt in Blau, liegt in Bereichen vor, in denen kein bevorzugter Antwortwinkel vorhanden ist. Höhere Werte, dargestellt in Rot, weisen auf Bereiche hin, in denen eine stärkere Antwort auf einen bestimmten Winkel vorliegt.

Die Helligkeit und die Bedeutung des Gesamt-GABOR-Filterergebnisses, die Filterausrichtung, die an jedem Pixel das maximale Signal liefert, entspricht der Richtung senkrecht zur zugrundeliegenden Objektausrichtung. Die Orientierung substruktureller Partikel wird in einem Strichplot dargestellt, wobei jede Linie eng mit der zugrundeliegenden lokalen Objektausrichtung übereinstimmt, die im ungefilterten Dunkelfeld sichtbar ist. Der Strichplot zeigt die Ausrichtung von Objekten mit Antwortintensitäten von mehr als 10 % des Maximums an.

Diese Dunkelfeld- und optisch gefilterten Bilder eines Feldes enthalten lebende bovine Endothelzellen; nach der Behandlung mit dem Apoptoseinduktor Stor Sporin wurden anschließend alle 20 Minuten über einen Zeitraum von drei Stunden gefilterte Bilder aufgenommen. Hier werden die Seitenverhältniskarte im oberen Feld und die Fluoreszenzbildgebung der Mitochondrien im unteren Feld als Funktion der Zeit dargestellt. Der Farbton repräsentiert den Orientierungsgrad; wie zuvor vergleichen diese Zeitverlaufsdiagramme den Abfall des Orientierungsgrads des Seitenverhältnisses der Partikel in Endothelzellen, die mit S Thoro Sporin behandelt wurden, wobei die einzelnen Kurven Zeitverläufe innerhalb einzelner Zellen darstellen.

Die Ausrichtung der Tropfen ist auf die Bereiche der Zellen beschränkt, die mit fluoreszierenden Regionen übereinstimmen. Nun wurde die Validierung gegenüber der Fluoreszenz erreicht. Sie wird archiviert.

Daher können in den nächsten Experimenten die mitochondrialen Messungen durchgeführt werden, indem die Fluoreszenzbildgebungsschritte weggelassen und direkt die optische Streumethode verwendet wird. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man die mitochondriale Fragmentierung während der Apoptose mithilfe von Lichtstreu-Signaturen auf der Basis von Gabor-Filtern überwacht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, eine gute Probenvorbereitung durchzuführen und sicherzustellen, dass die optische Anordnung gut justiert und kalibriert ist.

Beginnen wir also mit dem Sinn fürs Beobachten und CoLab mit UI-Experimenten.