MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode
29. April 2007
Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS).
Willkommen zum CHI-Lab-Tutorial zur Ultradünnfilmschichtmethode, die besonders nützlich für die genaue Massenbestimmung von Proteinen ist. Aufgrund der empfindlichen Natur der Massenspektrometrie verwenden wir nur Reagenzien der HPLC-Qualität sowie puderfreie Latex- oder Nitrilhandschuhe, um die Platte zu reinigen. Spülen Sie sie abwechselnd mit Methanol und Wasser und anschließend abschließend erneut mit Methanol.
Zwischen den einzelnen Spülschritten wischen Sie vorsichtig das überschüssige Lösungsmittel mit Linsenpapier ab. Diese Waschschritte können nach Bedarf mehrmals wiederholt werden, um eine saubere Platte zu erhalten. Sobald die Platte gereinigt und trocken ist, sollte sie umgehend verwendet werden.
Tragen Sie 20 bis 30 Mikroliter dünne Schicht Substratlösung auf die saubere MALDI-Platte auf und verteilen Sie sie gleichmäßig. Hier verwenden wir eine P2-50-Pipettenspitze, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen und gleichzeitig ein Kratzen der Platte zu vermeiden. Während die dünne Schicht trocknet, entfernen Sie eventuell verbliebene Wassertropfen vorsichtig durch Abtupfen mit einem Kim-Tuch.
Wischen Sie dann die Platte mit einem Kim-Tuch in einer sanften, gleichmäßigen Bewegung ab, um die dünne Schicht richtig zu bilden. Reinigen Sie abschließend die Ränder der Platte, um eine Kontamination des Massenspektrometers zu vermeiden. Es ist entscheidend, die dünne Schicht zu testen, bevor Sie Ihre Probe auftragen.
Wenn der Testfleck zu lange zum Trocknen braucht und die Kristalle nicht homogen sind, liegt das Problem möglicherweise in der Dünnschicht selbst oder in der Matrixlösung. Reinigen Sie die Platte, tragen Sie die Dünnschicht erneut auf und führen Sie einen erneuten Test durch. Wenn Sie auf die Dünnschicht auftragen, sollten die Probenflecken nicht bis zur Trockenheit eintrocknen. Entfernen Sie vielmehr das überschüssige Lösungsmittel, sobald die Kristallisation verlangsamt hat und zum Stillstand gekommen ist.
Unter Verwendung eines Vakuumaspirators kann das Vorhandensein von Verunreinigungen wie Salzen und Detergenzien sowie eine hohe Analytkonzentration die Kristallisation stören. Eine weitere Probenverdünnung kann die Kristallisation verbessern. Platziere die Ants in unmittelbarer Nähe zur Probe. Dies ermöglicht eine pseudo-interne Kalibrierung, bei der die Platte von der Probenstelle zur Kalibrierstelle bewegt wird.
Während der Probengewinnung gewährleistet das Hinzufügen einiger Laserimpulse des CAS zum Spektrum eine genauere Massenkalibrierung als alleinige externe Kalibrierung. Es ist sehr wichtig, Verunreinigungen wie Salze oder Detergenzien, die die Ionisierung des Analyten stören könnten, gründlich zu entfernen. Dazu kaltes, eisgekühltes, 0,1%iges Trifluoracetat in HPLC-Reinstwasser direkt auf die Stellen tropfen.
Entfernen Sie die Waschlösung mithilfe eines Vakuum-Aspirators, wie hier gezeigt. Diese Methode liefert hervorragende Spektren sowohl für membranständige als auch für lösliche Proteine.
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Übersicht
Dieses Video zeigt die Herstellung einer ultradünnen Matrix-Analyt-Schicht zur Analyse von Peptiden und Proteinen mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS). Die Methode ist entscheidend für die genaue Bestimmung der Masse von Proteinen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Massenspektrometrie
- Proteinanaylse
- Analytische Chemie
Hintergrund
- Die Massenspektrometrie ist eine empfindliche Methode zur Analyse von Biomolekülen.
- Die Probenvorbereitung auf der Probenträgerplatte ist entscheidend für genaue Ergebnisse.
- Für die Reinigung werden Reagenzien in HPLC-Qualität empfohlen.
- Richtige Handhabung und Reinigungstechniken verbessern die Qualität der Analyse.
Zweck der Studie
- Veranschaulichung der Methode der ultradünnen Schicht für die MALDI-MS.
- Sicherstellung einer genauen Massenbestimmung von Proteinen.
- Bereitstellung eines Tutorials zu bewährten Verfahren der Probenvorbereitung.
Verwendete Methoden
- Verwendung von Reagenzien in HPLC-Qualität.
- Reinigung der Platte mit Methanol und Wasser.
- Entfernen überschüssiger Lösungsmittel mit Linsenpapier.
- Sofortige Verwendung der gereinigten Platte zur Analyse.
Hauptergebnisse
- Zeigte effektive Reinigungsmethoden für die Probenplatte auf.
- Unterstrich die Bedeutung der Verwendung geeigneter Materialien.
- Veranschaulichte die Vorbereitungsschritte für eine ultradünne Schicht.
- Lieferte Einblicke in die Aufrechterhaltung der Probenechtheit.
Schlussfolgerungen
- Die Methode der ultradünnen Schicht ist entscheidend für eine genaue Massenspektrometrie.
- Die richtigen Reinigungs- und Vorbereitungstechniken sind unerlässlich.
- Die Einhaltung bewährter Verfahren kann die Analyseergebnisse erheblich verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die genaue Bestimmung der Masse von Proteinen ist entscheidend für die Validierung von Zielstrukturen und die Identifizierung von Leitverbindungen in der frühen Entdeckungsphase. Die Probenvorbereitungsmethode mit ultradünner MALDI-Schicht verbessert die Datenqualität durch eine höhere Toleranz gegenüber Verunreinigungen und eine verbesserte räumliche Homogenität und ermöglicht so eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen. Diese Methode erlaubt eine vorhersagebasierte Zuverlässigkeit in der Proteincharakterisierung und verringert mechanistische Unklarheiten bei der Auswahl präklinischer Modelle.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die genaue Bestimmung der Masse von Proteinen und unterstützt damit die Überprüfung therapeutischer Hypothesen und die funktionale Validierung von Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Bietet eine höhere Toleranz gegenüber Salzen und Detergenzien und verringert somit falsch-negative Ergebnisse bei proben mit Neigung zu Verunreinigungen.
- Prädiktiver Wert: Verbessert die Auflösung und räumliche Gleichmäßigkeit und erhöht die Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von Proteinen sowie deren Modifikationszustand.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt hochwertige, reproduzierbare Spektren, die für die Standardisierung von Assays und die konsistente quantitative Auswertung unerlässlich sind.
- Operativer Wert: Verwendet einfache, robuste Schritte, die mit Umgebungen für Hochdurchsatz-Screening kompatibel sind.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Herstellung validierter Probenteller für nachgeschaltete Arbeitsabläufe und unterstützt die Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Projekte hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Ermöglicht die Analyse sowohl membranständiger als auch löslicher Proteine und damit die Charakterisierung krankheitsrelevanter Systeme.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Erleichtert die genaue Massenbestimmung von Proteinen mit breitem Massenbereich (bis zu 380 kDa) und unterstützt so die Optimierung von Wirkstoffkandidaten.
- Ausrichtung an präklinischen Modellen: Anwendbar auf Ionenkanäle, Transporter und Rezeptoren und damit geeignet zur Zielstrukturvalidierung in physiologisch relevanten Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode der ultradünnen Schicht fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zum präklinischen Profiling ein und ermöglicht eine zuverlässige Proteinanalyse in jeder Phase.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem genaue Massendaten zur Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen bereitgestellt werden.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse, die eine zuverlässige Beurteilung von Verbindungen in der Assay-Entwicklung ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt massenspektrometrische Daten mit hoher Auflösung und räumlicher Gleichmäßigkeit, wodurch die Vergleichbarkeit der Daten unter verschiedenen Bedingungen verbessert wird.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Kontinuität durch konsistente Analyse der Proteinmasse über verschiedene Probenarten hinweg.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine standardisierte, robuste Probenvorbereitungsfähigkeit dar, die auf verschiedene Proteinklassen und Projekte anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Bestimmung der Proteinmasse, Verringerung mechanistischer Unschärfen bei der Zielvalidierung.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Toleranz gegenüber gängigen Kontaminationen wie Salzen und Detergenzien.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch verbesserte Datenqualität und damit verbundene Verringerung biologischer Risiken in späteren Phasen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung auf Grundlage zuverlässiger Proteincharakterisierungsdaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Massenspektrometrie-Proben und den Prinzipien der MALDI-MS.
- Benötigt Zugang zu HPLC-Reagenzien, einem Vakuumsauger und mit MALDI kompatiblen Platten.
- Setzt standardisierte Reinigungs- und Trocknungsverfahren voraus, um die Gleichmäßigkeit der Schichten sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen an unterschiedliche Analytkonzentrationen und Probenmatrizes.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit, die Platten unmittelbar nach der Reinigung zu verwenden, um eine erneute Kontamination zu vermeiden.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
