Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Dieses Protokoll demonstriert eine videobasierte Bioinformatik-Methode zur Messung des Wachstums menschlicher embryonaler Stammzellkolonien durch Analyse von Zeitraffervideos, die in einem Icon Bio Station CT-Inkubator mit Kamera für die Videoaufnahme aufgezeichnet wurden. Kolonien aus menschlichen embryonalen Stammzellen (HESC) werden bis zu einer Konfluenz von 70 % kultiviert, umgesät und 48 Stunden inkubiert, woraufhin die HESC-Kolonien weitere 48 Stunden im Biot-ct aufgezeichnet werden. Die Wachstumsrate wird mithilfe von Segmentierungsverfahren sowie Messrezepturen ermittelt, die mit der CL-Quant-Software entwickelt wurden.

Die Rezepte werden durch einen Vergleich mit Adobe Photoshop validiert, einem Bildanalysetool, das eine präzise manuelle Maskenanpassung an jede Kolonie ermöglicht. Das aufstrebende Fachgebiet der Video-Bioinformatik kann zur Automatisierung der Verarbeitung, Analyse und Auswertung biologischer Daten aus mikroskopischen Videos genutzt werden. Hallo, ich bin Serena Lin aus dem Labor von Dr. Prue Talbot am Department für Zellbiologie und Neurowissenschaften an der University of California Riverside.

Hallo, ich bin Sean Fino, ebenfalls aus dem Talbot-Labor. Hallo, ich bin TI Satish aus dem Graduiertenprogramm für Zell-, Molekular- und Entwicklungsbiologie. Heute zeigen wir Ihnen, wie man das Wachstum von Kolonien menschlicher embryonaler Stammzellen mithilfe von videobasierten Bioinformatik-Tools misst.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Wirkungen von Umweltgiften auf das Verhalten menschlicher embryonaler Stammzellen zu untersuchen. Wir werden dieses Verfahren in unserer neuen Stammzell-Kernfacility demonstrieren. Beginnen wir also.

Um HESC für die Videoanalyse vorzubereiten, kultivieren Sie die HESC auf mit Matrigel beschichteten 6-Loch-Platten, bis sie 70 % konfluent sind. Entfernen Sie das Medium aus einem Loch mit HESC durch Absaugen und waschen Sie zweimal mit je einem Milliliter PBS. Geben Sie ein Milliliter Accutase hinzu und inkubieren Sie eine Minute lang bei 37 °C in 5 % Kohlendioxid. Danach geben Sie 10 bis 12 Glaskügelchen in das Loch und schütteln die Platte vorsichtig, bis die Kolonien vollständig abgelöst sind.

Neutralisieren Sie Accutane mit einem Milliliter menschlichem Embryonalstammzell-Erhaltungsmedium oder konditioniertem Medium von embryonalen Mausfibroblasten. Sammeln Sie die abgelösten Zellen ohne die Perlen in einem 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren Sie sie drei Minuten bei 200 ×g. Dekantieren Sie das Überstand und lösen Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern frischem menschlichem Embryonalstammzell-Erhaltungsmedium oder M-T-E-S-R auf. Geben Sie 100 Mikroliter der HESC-Zellsuspension tropfenweise in mehrere Vertiefungen einer 12-Loch-Matrigel-beschichteten Platte.

Schwenken Sie die Platte vorsichtig hin und her und untersuchen Sie die Kulturen unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Zellklumpen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilen. Stellen Sie die Platte 48 Stunden lang in einen Inkubator bei 37 Grad und 5 % Kohlendioxid, um sicherzustellen, dass die Zellen flach angeheftet sind und groß genug, um sie leicht sichtbar zu machen. Nach 48 Stunden saugen Sie das Medium ab und waschen die Vertiefungen mit 500 µL PBS, um nicht angeheftete Zellen zu entfernen, anschließend geben Sie 500 µL M-T-E-S-R-Medium zu jeder Vertiefung hinzu.

Stellen Sie die Platte sofort in das Biot CT und beginnen Sie mit der Aufnahme von Zeitrafferaufnahmen. Wählen Sie Felder mit deutlich abgegrenzten Einzelkolonien aus, die unwahrscheinlich sind, in andere Kolonien hineinzuwachsen. In diesem Protokoll werden die Zellen weitere 48 Stunden lang mit Bildern im Abstand von sieben Minuten videographiert.

Um das Segmentierungsrezept zu erstellen, scannen Sie zunächst manuell das gesamte Video, um sicherzustellen, dass es eine einzelne Kolonie enthält, die während des gesamten Aufzeichnungszeitraums fokussiert bleibt. Öffnen Sie danach den Segmentierungs-Assistenten in der CL-quants-Software, und klicken Sie auf die Schaltfläche „Weiter“. Wählen Sie den richtigen Bildkanal aus, und klicken Sie erneut auf die Schaltfläche „Weiter“.

Wählen Sie die weiche Abgleichung aus und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie ein oder zwei gewünschte Bereiche aus, indem Sie vom äußeren Rand bis zum Zentrumsbereich der Kolonie einen Kreis ziehen. Dieser Bereich sollte so klein wie möglich sein, aber dennoch repräsentativ für die gesamte Kolonie.

Wählen Sie nicht zu viele Bereiche aus, da dies zu einer ungenauen Maskenanwendung führen kann. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter. Wählen Sie Bereiche, die nicht gewollt sind, indem Sie Bereiche umkreisen, die weder Teil der Kolonie noch Teil des Hintergrunds sind.

Diese Bereiche weisen Muster auf, die unterdrückt werden sollten, wie beispielsweise Schmutzpartikel und abgestorbene Zellen. Klicken Sie auf „Weiter“. Wählen Sie den Hintergrund aus, indem Sie Bereiche umkreisen, die keine Kolonien, Schmutzpartikel oder abgestorbene Zellen sind.

Der Hintergrund sollte einheitlich sein und wahrscheinlich in jedem Bildausschnitt sichtbar werden. Üblicherweise wählen wir den grauen Hintergrund um die Kolonie herum. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Weiter“.

Eine farbige Maske sollte über dem interessierenden Bereich angezeigt werden, wenn die Maske den interessierenden Bereich nicht genau abdeckt. Der Segmentierungsschwellenwertbereich in der unteren rechten Ecke des Bildschirms kann erhöht oder verringert werden, falls eine Änderung der Maske erforderlich ist. Wählen Sie „Aktualisieren“ für weiche Übereinstimmungsbereiche.

Dies ermöglicht das Ändern der gewünschten, unerwünschten oder Hintergrundbereiche. Wenn die Maske zufriedenstellend ist, wählen Sie „Schwellenwert anwenden“ und „Meine Maske speichern“. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Weiter“.

Die Maske wird dann in einer anderen Farbe angezeigt. Wählen Sie „Fertig stellen“. Das Rezept sollte in der rechten oberen Ecke der Software als Segmentierungsrezept angezeigt werden.

Benennen Sie das Rezept nach Wunsch um, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und einen neuen Namen eingeben. Um das Rezept anzuwenden, klicken Sie mit der rechten Maustaste und bewegen die Maus darüber.

Rezept anwenden. Ein Menü wird angezeigt, das die Auswahl der zu verwendenden Anzahl von Einzelbildern ermöglicht. Stellen Sie das Bildintervall auf jeweils 20 Bilder ein, um die Genauigkeit der Maske sicherzustellen.

Überprüfen Sie zufällig manuell 10 % der Bilder, auf die die Maske angewendet wurde, um ein Verbesserungsrezept zu erstellen, das unerwünschte Bereiche in Trümmern eliminiert. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Ordner für das Verbesserungsrezept und anschließend auf „Neu“. Ein neues Verbesserungsrezept sollte aus dem ursprünglichen Bildfeld angezeigt werden.

Bewegen Sie die Maus über die Symbole in der Symbolleiste, um die Schaltfläche für das Erweiterungsmodul zum Umschalten rechts neben dem Bild zu identifizieren, und klicken Sie darauf. Wählen Sie das Dropdown-Menü für die Beschriftung. Wählen Sie die Beschriftung für verbundene, beschriften Sie verbundene zwei.

Eine neue Taskleiste sollte angezeigt werden. Nehmen Sie die anfängliche Maske aus dem Segmentierungsrezept und ziehen Sie sie in das Eingabefeld. Die Leiste sollte jetzt die Nummer der Eingabemaske anzeigen.

Ziehen Sie das Symbol mit der Eingabemaske-Nummer zum Symbol der Maske Null. Suchen Sie in der Taskleiste nach der Mindestgröße und passen Sie die Zahl an, bis nur der interessierende Bereich angezeigt wird. Stellen Sie sicher, dass Sie bei jedem Anpassungsversuch auf „Ausführen“ klicken.

Sobald die Mindestgrößenanpassung zufriedenstellend ist, klicken Sie auf das vorherige Verbesserungsrezept am unteren Bildschirmrand und wählen Sie „Speichern unter Rezept“. Die Software fordert nun auf, das ausgewählte Rezept zu überschreiben, und wählen Sie „Ja“-Punkt. Überprüfen Sie das Verbesserungsrezept mithilfe desselben Verfahrens wie beim Punktprüfen der Segmentierung.

Wenn Sie mit den Segmentierungs- und Verbesserungsrezepten zufrieden sind, fahren Sie fort, um die Messvorlage zu erstellen. Beginnen Sie, indem Sie in der rechten Seitenleiste „Messvorlage erstellen“ auswählen. Wählen Sie im Messfenster „Cursor über Clipart-Zellabbildung bewegen“ aus.

Halten Sie die Steuertaste gedrückt und wählen Sie die Zelle unter dem Abschnitt Morphologie aus, deaktivieren Sie den Standardparameter und aktivieren Sie den Parameter „Fläche“. Schließen Sie dann das Vorlagenfenster. Wählen Sie das Symbol aus.

Erstellen Sie ein Messrezept. Benennen Sie das Rezept um. Wechseln Sie zum Vorlagen-Tab und wählen Sie ihn aus. Ziehen Sie in der oberen rechten Ecke die zuvor erstellte Messvorlage per Drag & Drop auf das Messfenster.

Klicken Sie im Fenster des Messrezepts auf Ja, um fortzufahren, und wählen Sie dann Kanalzuordnungen. Danach wählen Sie Maskenzuordnungen für die Gesamtzelle. Wählen Sie anschließend die Option für die Gesamtzelle. Für eine verbesserte Maske wählen Sie das Messrezept unter dem Reiter Rezept aus.

Wählen Sie im Hauptfenster das Speichersymbol im Messrezept-Fenster aus. Schließen Sie dann das Fenster. Danach schließen und öffnen Sie das Sichtfeld erneut. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Rezeptlistordner und fügen Sie neue Rezepte in der Reihenfolge der erforderlichen Anwendung in die Rezeptliste ein. Wählen Sie „Rezeptliste sperren“ und führen Sie die Rezepte nacheinander auf den Videodaten mithilfe von Adobe Photoshop aus.

Jedes 20. Bild derselben Kolonien wurde analysiert. Öffnen Sie manuell ein Bild einer Kolonie in Adobe Photoshop. Klicken Sie im Werkzeugkasten auf den Zauberstab.

Klicken Sie auf den Bereich um die Kolonie herum, sodass das gesamte Feld abgedeckt ist, außer dem Koloniebereich. Stellen Sie sicher, dass die gepunktete Linie genau um den Rand der Kolonie verläuft und nicht innerhalb davon. Falls die gepunktete Linie nicht am Rand verläuft, passen Sie den Toleranzwert in der oberen Symbolleiste entsprechend an.

Klicken Sie in der Symbolleiste auf Bearbeiten im Schnellmaskus-Modus und anschließend auf die Kolonie, sodass die Kolonie ausgewählt ist. Gehen Sie zum Fenster, ziehen Sie das Menü herunter und klicken Sie auf Histogramm. Der Cache sollte auf eins eingestellt sein.

Wenn der Cache zwei beträgt, klicken Sie auf das Ausrufezeichen für die Expression, um den Cache auf eins zu ändern. Notieren Sie den Pixelwert in einer Tabellenkalkulation. Wiederholen Sie den oben beschriebenen Vorgang für jedes 20. Bild.

Die mit Photoshop und der CL-Quant-Software gesammelten Daten können anschließend gemeinsam dargestellt werden. Unser Protokoll zur Quantifizierung des Wachstums von HESC-Kolonien zeigt eine Anwendung der Video-Bioinformatik auf ein biologisches Problem. Hier zeigen wir einen Graphen, der die Zunahme der Koloniengröße über 48 Stunden hinweg vergleicht, wie sie mithilfe der CL-Quant-Software und Adobe Photoshop bestimmt wurde.

Der Graph zeigt fünf verschiedene Kolonien, die jeweils mit beiden Softwarepaketen analysiert wurden. Jede Kolonie ist durch eine andere Farbe dargestellt. Die durchgezogenen Linien wurden mit der Software sail quant erstellt, während die gepunkteten Linien mit Photoshop erfasst wurden.

Der Graph der Rohdaten zeigt, dass beide Messmethoden gut übereinstimmen, was die Tatsache berücksichtigt, dass die Kolonien eine unterschiedliche Ausgangsgröße aufweisen. Diese Abbildung zeigt die Daten erneut aufgetragen als prozentuale Zunahme der Koloniengröße. Die Wachstumsraten sind unabhängig von der anfänglichen Koloniengröße ähnlich, und beide Analysemethoden liefern vergleichbare Ergebnisse.

Der folgende Graph zeigt die Mittelwerte der vorherigen Prozentänderungsdaten zum Wachstum von HESC-Kolonien. Dieser Graph verdeutlicht eine gute Übereinstimmung zwischen der Analyse mithilfe von Video-Bioinformatik und Adobe Photoshop. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man das Wachstum von Kolonien menschlicher embryonaler Stammzellen mit Werkzeugen der Video-Bioinformatik misst.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens mittels Phasenkontrastmikroskopie sollten Sie sicherstellen, dass der Hof um die Kolonie herum für die präzise Kolonieauswahl durch die Software einbezogen wird. Es ist außerdem wichtig zu beachten, dass andere Methoden zur Kultivierung, Inkubation und Videodatenerfassung anstelle des hier demonstrierten Protokolls verwendet werden können. Sobald die Rezepte entwickelt und validiert sind, ermöglichen sie eine deutlich schnellere Analyse und weisen eine geringere experimentelle Variabilität auf als die manuelle Analyse.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.