Chronisch Salmonellen Infected Maus-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Mausmodell mit chronischer Salmonelleninfektion zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Salmonellenlösung hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Mäuse entweder mit Streptomycin und anschließend mit Salmonellen oder nur mit Streptomycin zu gavagieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Salmonellen aus dem Fäkalienmaterial von Mäusen zu isolieren und eine Salmonelleninfektion im Darm von Mäusen mithilfe von BL-Chromaplatte zu detektieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Beobachtung und Dokumentation der Körpermasse der Maus sowie die Erfassung von Veränderungen der Vitalität nach einer Salmonelleninfektion. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass eine Infektion mit Salmonellen im Darm von Mäusen, die mittels Gavage mit Salmonellen infiziert wurden, etabliert werden kann.

Hallo, ich bin Michelle P aus dem Labor von Dr. Johnson der Abteilung für Innere Medizin an der University of Rochester. Ich komme ebenfalls aus dem Sun-Labor und ich bin Y aus dem Sun-Labor. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Erstellung eines mit Alytic Lennar infizierten Massenmodells zeigen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Signaltransduktion bei der Interaktion zwischen Wirt und Bakterien sowie die Tumorgenese zu untersuchen. Beginnen wir also. Bereiten Sie vor dem Experiment ausreichend Luria-Berti- oder LB-Brüheplatten für jeden Salmonella-Stamm vor und halten Sie diese für den gesamten Versuchsverlauf bereit.

Die Platten können gekühlt und mehrere Monate lang gelagert werden. Bereiten Sie anschließend die Salmonella-Kultur vor. Entnehmen Sie ein Gefäß mit der Stammlösung von Salmonella, das bei minus 80 Grad Celsius eingefroren ist, und lassen Sie es auf der Arbeitsfläche auftauen, um Salmonella anzupflanzen.

Ein Inokulationsloop in einem Bunsenbrenner erhitzen und in die aufgetaute Bakterienkultur eintauchen. Das Loop im Zickzackmuster hin und her auf dem oberen Drittel der LB-Platte bewegen. Das Loop erneut abbrennen und die Platte drehen.

Führen Sie die Schleife im Zickzack, um die vorherigen Striche zu überqueren, und verteilen Sie die Bakterien auf dem zweiten Drittel der Platte. Wiederholen Sie dies einmal mehr. Brennen Sie die Schleife erneut ab.

Lassen Sie die Schleife nicht in das Agar eindringen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius, um das Wachstum von Kolonien zu ermöglichen. Bei korrekter Durchführung sollten auf der Salmonellenplatte in mindestens einem Bereich einzelne Kolonien sichtbar sein.

Am nächsten Tag einen Klon von der LB-Platte mit einem sterilen Zahnstocher oder Bakterien-Öse aufnehmen und in sieben Milliliter LB in einem 12-Milliliter-Röhrchen geben. Das Röhrchen etwa fünf Stunden bei 37 °C schütteln.

Verwenden Sie 0,05 Milliliter dieser Kultur, um 50 Milliliter LB in einem Falcon-Röhrchen zu beimpfen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln für etwa 18 Stunden.

Zentrifugieren Sie die 50 Milliliter bakterielle Übernachtkultur bei Raumtemperatur mit 5.000 U/min für 10 Minuten und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter Hank’s Buffered Salt Solution oder HBSS in das Röhrchen, um die Bakterien zu resuspendieren, oder verwenden Sie ein Verhältnis von 100 Teilen LB zu drei Teilen HBSS. Anschließend wird das Gesamtvolumen mit HBSS auf 15 Milliliter aufgefüllt oder ein Verhältnis von ein Teil LB zu zehn Teilen HBSS verwendet.

Jedes Maus benötigt 100 Mikroliter verdünnte Salmonellenkultur, entsprechend einer Konzentration von ein mal 10 hoch sechs bis ein mal 10 hoch acht koloniebildenden Einheiten, sowie Entzug von Wasser und Futter vier Stunden vor Beginn des Gavagierens. Bereiten Sie unmittelbar vor dem Gavagieren eine Streptomycinlösung zu, indem Sie 7,5 Milligramm Streptomycin-Pulver in 100 Mikroliter HBSS verdünnen. Für jede zu behandelnde Maus sollte zusätzlich etwas Volumen vorbereitet werden, um Verluste vor dem Gavagieren auszugleichen.

Bereiten Sie zunächst eine Fütterungssonde mit 100 Mikroliter Streptomycinlösung vor. Entnehmen Sie die erste Maus aus dem Käfig, um die Gavage durchzuführen, und halten Sie die Maus mit dem Gesicht zur Arbeitsfläche hin. Greifen Sie fest mit Daumen und Mittelfinger die Haut über der Schulter der Maus und strecken Sie mit dem Zeigefinger Kopf und Hals, um die Speiseröhre zu begradigen.

Leiten Sie die Kugelspitze der Fütterungsnadel entlang des Gaumens in Richtung der rechten Seite des hinteren Pharynx. Führen Sie sie dann vorsichtig in die Speiseröhre ein und injizieren Sie die 100 µL Streptomycinlösung. Es sollte kein Widerstand spürbar sein.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Versuchs- und Kontrollmäuse, die Experimenten unterzogen werden. Etwa 20 Stunden nach strp de m und Gavage und vier Stunden vor der Gavage mit Salmonellen entziehen Sie den Mäusen, die oral Salmonellen erhalten sollen, Wasser und Futter. Führen Sie bei jeder Maus erneut eine Gavage in der gleichen Weise wie zuvor durch, wobei Sie 100 µL Salmonellenlösung in HBSS verwenden.

Nach der Schlundsonde überführen Sie jede Maus in einen neuen Käfig, um die Sammlung der Fäkalien zu beginnen. Beginnend etwa acht Stunden nach der Schlundsonde, entfernen Sie die Fäkalien unmittelbar nach dem Ausscheiden aus dem Käfig. Sammeln Sie 100 Milligramm Mäusefäkalien als Versuchsprobe.

Sammlen Sie die Proben je nach Studiendauer täglich oder wöchentlich für die Analyse von Salmonellen im Fäzes. Überführen Sie die Fäkalprobe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter PBS und mischen Sie gründlich durch Vortexen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 800 U/min. Überführen Sie den Überstand in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 6.000 U/min.

Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 200 Mikroliter PBS zu den Pellets, um sie durch Vortexen erneut in Suspension zu bringen. Danach weisen Sie Salmonellen mit einer BB-l-Roag-Platte nach. Verwenden Sie 10 bis 100 Mikroliter der Fäkalienlösung pro Platte, die wie in Abschnitt zwei gezeigt auf der Platte verteilt werden.

Die Salmonellen-Arten erscheinen aufgrund metabolischer Unterschiede in Gegenwart ausgewählter Chromogene mar gefärbt. Zählen Sie die Kolonien von Salmonellen auf der Platte, um das Infektionsniveau zwischen einzelnen Mäusen zu vergleichen. In diesem experimentellen Verfahren verwendeten wir weibliche, spezifisch pathogenfreie C57BL/6-Mäuse im Alter von sechs bis sieben Wochen.

Mäuse wurden mit Salmonella sowie Streptomycin und HBSS infiziert. Die Mäuse erhielten kontrolliert über eine Magensonde Streptomycin allein. Verwendete Salmonella-Stämme umfassten den Salmonella typhimurium Wildtyp-Stamm, ATCC 1 4 0 2 8 S FP C, einen nicht-pathogenen Salmonella-Mutantenstamm sowie drei FPC-Stämme aus dem Labor von Dr. James Madera, die das mit Virulenz assoziierte AAV R age-Gen auf dem Plasmid PSKW 29, einem Plasmid mit geringer Kopienzahl, tragen. Mit diesem Protokoll kann die Kolonisation durch Salmonella tyrian im Darm der Maus nachgewiesen werden.

Chronische Salmonelleninfektion wurde durch Analyse von Fäkalien sowie Gewichtsmessung und Sammlung von Darmgewebeproben zur immunfluoreszenten Färbung erfasst. Typischerweise treten Gewichtsverlust und Tod innerhalb von vier Wochen nach der Infektion auf. Die Überlebensanteile vier Wochen nach der Infektion sind hier dargestellt.

Sobald die Mäuse vier Wochen nach der Infektion überlebt haben, nehmen sie an Körpergewicht zu und die Todesfälle nehmen in den verbleibenden 23 Wochen ab. Insgesamt überleben mehr als 65 % der mit den Salmonella-Stämmen FSY, fsy, A VRA null oder fsy, A VRA heterozygot infizierten Mäuse länger als sechs Monate bei persistierender Salmonella-Infektion im Darm.

Nach der akuten Infektion trugen die Überlebenden weiterhin Salmonellen, die sechs Monate nach der Infektion mit der in diesem Protokoll beschriebenen Methode nachgewiesen werden konnten. Die Immunfluoreszenzanalyse von Gewebeproben aus dem Darm von Mäusen zeigt das Eindringen von Salmonellen in die Darmschleimhaut 27 Wochen nach der Infektion. In diesem Bild sind die Kerne blau angefärbt und die mit Salmonellen infizierten Zellen grün dargestellt.

Wie in der Kontrollgruppe gezeigt, gibt es keine leuchtend grüne Färbung, was auf keine Kolonisation mit Salmonellen hinweist. Hingegen ist bei den mit Salmonellen infizierten Mäusen 27 Wochen nach der Infektion eine leuchtend grüne Färbung in der Darmschleimhaut zu beobachten. Dies zeigt die anhaltende Salmonelleninfektion in der mit Streptomycin vorbehandelten Maus.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine chronische Infektion in einem Mausmodell auslöst. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, eine frische Kultur für die Garage vorzubereiten, die korrekten Garage-Techniken anzuwenden und das Vorhandensein von ANA nachzuweisen, um sicherzustellen, dass Ihr Versuchsmodell funktioniert. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.