Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mono- und Polyribosom-Fraktionen aus Zelllysaten zu trennen und zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zellen der gewünschten Art kultiviert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Herstellung des Zelllysats.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Lysat durch einen Saccharose-Gradienten zu zentrifugieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Fraktionierung des Gradienten und die Visualisierung der verschiedenen ribosomalen Populationen mittels einer UV-Messkurve. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Veränderungen der Translation unter verschiedenen experimentellen Bedingungen durch die Analyse von Polyribosomen-Profilen zeigen.

Hallo, ich bin Anthony Esposito aus dem Labor von Dr. Terry Goss Kinsey in der Abteilung für Molekulargenetik, Mikrobiologie und Immunologie an der UMD und der J Robert Wood Johnson Medical School. Und ich bin Marcus Lewis, ebenfalls aus dem McKinsey-Labor hier an der R-W-J-M-S.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Polyribosomenanalyse. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Veränderungen in der Proteinsynthese zu untersuchen, die durch Mutationen oder Umweltfaktoren entstehen. Beginnen wir. Saccharose.

Gradienten sollten einen Tag vor der Verwendung vorbereitet werden, damit sie kontinuierlich werden können. Mischen Sie die entsprechenden Volumina der 7 %igen und 47 %igen Saccharoselösungen, um jeweils 48 Milliliter der folgenden Saccharosekonzentrationen herzustellen: 7 %, 17 %, 27 %, 37 % und 47 %. Geben Sie Einmolar DTT zu jeder Saccharoselösung, um eine Endkonzentration von einem Millimolar zu erreichen. Um die Gradienten zu gießen, befestigen Sie eine Pastapipette an einer 20-Milliliter-Spritze, indem Sie sie mit Parafilm fixieren und abdichten.

Geben Sie sieben Milliliter 7 %igen Saccharose an den Boden eines ein Zoll mal 3,5 Zoll großen Polyamer-Ultrazentrifugenrohrs. Fügen Sie anschließend sieben Milliliter 17 %ige Saccharoselösung unter die 7 %ige Lösung hinzu, indem Sie die Pipettenspitze nahe am Boden des Rohrs platzieren und langsam pipettieren. Das Einfüllen jeder Schicht sollte mindestens 20 Sekunden dauern.

Wiederholen Sie den Vorgang mit jeweils sieben Milliliter 27 %, 37 % und 47 %iger Saccharoslösungen, sobald das Gradientenbohren abgeschlossen ist. Sie sollten klare Trennlinien zwischen den Schichten beobachten, was darauf hinweist, dass nur minimales Mischen stattgefunden hat. Lagern Sie alle Gradienten zusammen mit den Rotoren, Flaschen und Röhrchen, die zur Probengewinnung verwendet werden, über Nacht bei vier Grad Celsius.

Um Extrakte aus Hefe-Zellen herzustellen, beginnen Sie mit dem Anzüchten von hundert 25-Milliliter-Kulturen bis zu einem OD 600 von 0,8 bis 1. Geben Sie Cyclohecid zur Kultur, um eine Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen, und schütteln Sie weiterhin 15 Minuten bei 30 Grad Celsius. Nach 15 Minuten gießen Sie die Kultur in eine 250-Milliliter-Zentrifugenflasche und füllen diese mit Eis auf.

Ab diesem Zeitpunkt alles auf Eis halten, Zentrifugation bei 8.000 ×g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter eiskaltem Lysepuffer und überführen Sie es in 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen. Zentrifugation bei 5.900 ×g für drei Minuten bei vier Grad Celsius, Resuspendieren.

Suspendieren Sie das Pellet in 0,5 Milliliter Lysepuffer. Überführen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie dann 0,5 Milliliter gekühlte, gebackene, säuregewaschene Glasperlen hinzu. Vortexen Sie die Zellen in vier Intervallen zu je 32 Sekunden, wobei das Röhrchen zwischen den Intervallen 30 Sekunden lang auf Eis gestellt wird.

Fügen Sie anschließend weitere 0,5 Milliliter Puffer zur Zelllyse in die 1,5-Milliliter-Zentrifugenprobe ein und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 5.000 × g und 4 °C. Überführen Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit und 4 °C.

Zuletzt das Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Der Extrakt kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, um das Lysat auf die Saccharose-Dichtegradienten aufzutragen. Die Pipettenspitze an die Wand des Röhrchens nahe der Oberfläche des Gradienten anlegen und das Lysat vorsichtig auf den Gradienten aufschichten.

Für einen 35-Milliliter-Gradienten werden typischerweise 500 Mikroliter Lyssat aufgetragen. Mit einer Pinzette den Gradienten vorsichtig in den Rotorbehälter eines Schwenkrotors absenken. Die Gradienten bei 100.000 × g für vier Stunden bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Etwa 30 Minuten vor Abschluss der vierstündigen Zentrifugation. Die Nadel an den Tubenstecher anschließen und den Stift an den Online-Absorptions-Fluoreszenzmonitor anschließen. Die Stromversorgung für den Absorptionsmonitor einschalten, um vor der Analyse der Proben ein stabiles Grundsignal zu erreichen.

Die elektronische Erfassung des PolyZone-Profils kann einfach in Echtzeit durch Anschließen einer DI 1 48 U Datenerfassungseinheit erzielt werden. Füllen Sie die Spritzenpumpe mit 50 Milliliter Florin-Nüssen unter Verwendung der schnellen Rücklauf-Einstellung am Schreibergerät auf. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind.

Verbinden Sie den Schlauch der Spritze mit dem Tubusstecher. Schalten Sie kurzzeitig den Durchfluss von Flo-Inert in Vorwärtsrichtung mit sechs Millilitern pro Minute ein, um den Schlauch von eventuellen Luftblasen zu befreien. Platzieren Sie eine Reihe von Röhrchen unter dem Schlauch am Ende der Durchflusszelle, um das überschüssige Probenmaterial aufzufangen.

Bereiten Sie einen Eiskübel mit einer vorgeformten Vertiefung zur Aufnahme des Zentrifugenröhrchens mit dem Saccharosegradienten vor. Sobald die vierstündige Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Zentrifugenröhrchen vorsichtig aus dem Zentrifugenrotor und stellen Sie sie auf Eis, wobei Sie sicherstellen, dass die Gradienten nicht gestört werden.

Um Zelllysate zu analysieren, setzen Sie die Gradientenröhre auf den Röhrendurchstecher und verbinden das obere Ende der Röhre mit dem Auslass und sichern es. Heben Sie die untere Halterung an die Zentrifugenröhre an, sodass die Nadel die Unterseite der Röhre durchsticht. Starten Sie den Durchfluss von Florin alert in Vorwärtsrichtung mit sechs Milliliter pro Minute.

Sobald die Flüssigkeit beginnt, in das Röhrchen zu fließen, überwachen Sie die Bewegung der Nadel am Online-UV-Absorptionsmonitor. Sobald die Nadel sich zu bewegen beginnt, schalten Sie die Chart-Bewegung auf eine Geschwindigkeitseinstellung von 60 ein. Wenn das Ende des Poly-Ribosomen-Profils erreicht ist, schalten Sie den Durchfluss von Flo inert zum Zentrifugenröhrchen aus und stoppen Sie die Chart-Bewegung am Absorptionsfluoreszenzmonitor.

Ziehen Sie das Flo-Inert mit hoher Geschwindigkeit in umgekehrter Fließrichtung aus dem Zentrifugenröhrchen in die Spritze zurück und achten Sie darauf, dass kein Saccharose aus dem Röhrchen in die Spritze gelangt. Schrauben Sie das Zentrifugenröhrchen von der Röhrchenstechvorrichtung ab, senken Sie die Nadel ab und nehmen Sie das Röhrchen heraus. Hier ist eine repräsentative Aufzeichnung eines Ribosomen-Extrakts dargestellt, der aus Hefe in Gegenwart von Cycloheide hergestellt wurde.

Es sind UV-Absorptionspeaks angegeben, die Polyribosomen sowie A TS 60 S- und 40 S-Ribosomen enthalten. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man eine Polyribosomenanalyse durchführt. Bei dieser Methode ist es wichtig, schnell zu arbeiten, die Proben kalt zu halten und die RNA frei von Kontaminationen zu halten.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.