Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen über eine Reihe von Kultivierungsschritten innerhalb von 30 Tagen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Embryoidkörper aus murinen ES-Zellen generiert werden, um die Differenzierung der Zellen einzuleiten. Im zweiten Schritt werden die Embryoidkörper mit den kleinen Molekülen Retinsäure und Pure Morphine behandelt, welche die gezielte Differenzierung der Zellen in eine liga den induzieren.

Vorläuferzellen. Als dritter Schritt werden Embryoidkörper nach weiteren 22 Tagen in Einzelzellen zerlegt. In der Kultur sind etwa 80 % der Zellen OPCs.

Anschließend werden die aus MESCs gewonnenen OPCs mit bao-Viren, die die NAV-1.2-Untereinheit tragen, transduziert, um spikende OPCs zu erzeugen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die Expression von OPC-Markern und die Spik-Eigenschaften dieser aus MESCs abgeleiteten OBCs, basierend auf immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen und elektrophysiologischen Ableitungen. Hallo, ich bin Pong Chiang aus dem Labor von Dr. Ing in der Abteilung für Zellbiologie und humane Anatomie an der University of California, Davis. Wir sind außerdem mit dem Shriners Hospital for Children im Norden Kaliforniens verbunden.

Hallo, ich bin Vial Raj, ebenfalls aus dem Deng-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Differenzierung von embryonalen Mausstammzellen in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Eigenschaften von aus embryonalen Stammzellen stammenden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zu untersuchen, um Zellen mit einem besseren therapeutischen Potenzial zu erzeugen.

Beginnen wir also. Heute werden Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder OPCs aus der OG-zwei-GFP-Maus-embryonalen Stammzelllinie generiert. Diese embryonalen Stammzellen müssen alle drei Tage weitergeimpft werden, um sie gesund zu halten, eine optimale Dichte aufrechtzuerhalten und eine spontane Differenzierung zu verhindern. Weiterimpfung.

Die ESS-Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 70 % erreicht haben, unter einem laminaren Luftstromgehäuse entnehmen. Das Kulturmedium entfernen. Mit PBS spülen und die Zellen mit zwei Milliliter vorgewärmtem Trypsin versetzen.

Eine mal Trip-Lyse-Extraktion für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie die Reaktion und resuspendieren Sie die Zellen in vier Milliliter MES-Zellmedium. Überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas und pelletieren Sie sie bei 1000 U/min fünf Minuten lang.

In MESL-Mediumplatte resuspendieren, dabei ein Zehntel der Zellen über eine konfluente Schicht bestrahlter Meth-Feeder-Zellen in MES-Zellmedium geben. Nach drei Tagen sind die ES-Zellen etwa zu 70 % konfluent und können zum Passagieren oder zur Embryoidkörperbildung resuspendiert werden, um die Differenzierung einzuleiten. Die Maus-ES-Zellkolonien wie zuvor mit Trypsin ablösen und anschließend die Zellen in Knockout-Serumersatz- oder KSR-Medium resuspendieren. Die Zellen mit einem Hemo TER zählen, die Suspension in KSR verdünnen.

Mittel bis 15.000 Zellen pro Milliliter, jeweils drei Milliliter in jede Vertiefung einer ultraniedrig bindenden 6-Well-Kulturplatte geben. Die suspendierten Zellen vier Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Das Kulturmedium alle zwei Tage vollständig erneuern.

Ab dem vierten Tag täglich das Medium wechseln. Am fünften Tag das KSR mit 0,2 Mikromolar Retinsäure supplementieren. Am sechsten und siebten Tag zusätzlich mit Retinsäure und einem Mikromolar Primor Famine supplementieren. Die Embryoidkörper mit zwei Medien versorgen, die mit 0,2 Mikromolar Retinsäure und einem Mikromolar Primor Famine ergänzt sind. Nach acht Tagen Kultivierung exprimieren die meisten Embryoidkörper GFP und sind bereit, mit Trypsin aufgelöst, disaggregiert und die Zellen wie zuvor gezählt zu werden.

Dann resuspendieren Sie sie in einer Konzentration von 3,5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in OPC-Medium und geben 3 Milliliter der Suspension in OPC-Medium. Unter Verwendung von mit Poly-Ornithin beschichteten 60-Millimeter-Kulturgeschirren werden die Zellen etwa alle Woche konfluent und sehen wie zuvor beschrieben aus. Passagieren Sie die Zellen erneut mit dreiminütiger Trypsinisierung.

30 Tage nach der ursprünglichen Resuspendierung. In KSR-Medium zeigen die Zellen Eigenschaften von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, um spikende OPCs zu erzeugen. Verwenden Sie aus murinen ESL abgeleitete OPCs, die einen Konfluenzgrad zwischen 50 und 70 % aufweisen.

Das Medium durch ein XPBS ersetzen, um die Zellen zu waschen. Um spannungsabhängige Natriumkanal-1.2-Alpha-Untereinheiten einzuführen.

Wir verwenden das Back-MAM-Natriumkanal-Kit. Mischen Sie ein Milliliter Back-MAM-Komponente A mit vier Milliliter 1× PBS. Entfernen Sie die PBS-Spülung und geben Sie die verdünnte Komponente hinzu.

Bei 37 Grad Celsius zwei Stunden inkubieren. Ersetzen Sie das Back-Memory-Medium durch OPC-Medium, das mit den Komponenten B und C wie in der Anleitung beschrieben angereichert ist. Anschließend weitere zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Nach der Inkubation das verbesserte Medium durch frisches OPC-Medium ersetzen. Nach weiteren 24 Stunden Kultur können die aus ESL stammenden OPCs zu diesem Zeitpunkt auf Aktionspotentiale getestet werden. Die EBS zeigen keine GFP-Fluoreszenz.

Die EBS zeigen eine starke GFP-Expression und sind etwa 30 Tage nach der ursprünglichen Resus-Suspension zur Disaggregationskultur bereit. In KSR-Medium sind die meisten Zellen immunpositiv für NG2-Färbung, was mit der GFP-Expression übereinstimmt. Im Gegensatz zu zerebralen OPCs sind diese aus MES-Zellen abgeleiteten OPCs jedoch nicht in der Lage, Aktionspotentiale auszulösen, selbst wenn die Zellen bis auf null Millivolt depolarisiert werden.

Nach der Einführung der NAV 1.2-Untereinheit mittels viraler Transduktion erregen sich diese aus MES-Zellen stammenden OPCs und feuern Aktionspotentiale. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man embryonale Stammzellen der Maus zu OPCs differenziert und mittels viraler Transduktion OPCs mit Aktionspotentialbildung erzeugt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Retinsäure sowie FGF 2 ordnungsgemäß aufzubewahren und stets frische Aliquote zu verwenden; verbleibende Mengen an Retinsäure sollten nach Gebrauch entsorgt werden.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.