Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie
1. Juli 2010
In diesem Video zeigen wir effiziente Elektrofusion von Zellen In-vitro- Durch modifizierte Einhaltung Methode mittels Elektroporation und der anschließenden Detektion der fusionierten Zellen Visualisierung mit Fluoreszenzmikroskopie.
Die Elektrofusion beinhaltet die Anwendung kurzer elektrischer Hochspannungsimpulse auf eng beieinander liegende Zellen. In diesem Video demonstrieren wir die Elektrofusion von Zellen in vitro mithilfe der modifizierten Adhärenz-Methode. Die Experimente wurden an Maus-Melanomzellen, BF eins, durchgeführt.
Führen Sie für das Experiment die folgenden Schritte durch. Kultivieren Sie Zellen in zwei separaten Zellkulturkolben bis zu 80 % Konfluenz. Geben Sie separat jeweils 2,1 µL der Stammlösungen hinzu.
10 Millimolar C-M-F-D-A bzw. CMRA zu drei Millilitern Krebs-Hess-Puffer in einem Zentrifugenröhrchen geben. Die Zellen zweimal mit Krebs-Hess-Puffer spülen und anschließend die Beladelösungen in die Kolben geben. Die Beladelösungen enthalten jeweils etwa sieben Mikromolar C-M-F-D-A bzw. CMRA.
Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in einer kontrollierten Atmosphäre. Während dieser ersten Inkubation gelangen die Reagenzien frei durch die Zellmembranen in das Zytoplasma, wo sie in membraneinpermeable Reaktionsprodukte umgewandelt werden. Nach dieser ersten Inkubation spülen Sie die Zellen und inkubieren sie anschließend zwei weitere Stunden mit Kulturmedium.
Die Zellen werden mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer gekühlten CCD-Kamera in der Aufnahmesoftware ausgestattet ist, beobachtet. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 548 Nanometer ein und wählen Sie einen geeigneten Bandpassfilter, um das Fluoreszenzbild der mit CMRA beladenen Zellen aufzunehmen. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 492 Nanometer ein und wählen Sie einen Bandpassfilter für das grüne Fluoreszenzbild, um die Trypsin-Augen zu zählen, und zählen Sie die Zellen in beiden Kolben. Mischen Sie rote und grüne Zellen im Verhältnis eins zu eins zusammen und stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 Millionen Zellen pro Milliliter ein.
Geben Sie einen Tropfen mit 20 µL Zellsuspension in die Mitte jedes Wells. Inkubieren Sie die Zellen in einer 24er-Mehrfachplatte unter kontrollierter Atmosphäre für 20 Minuten, damit sich die Zellen leicht in einer einfachen Schicht an der Oberfläche des Wells anheften und untereinander Zellkontakte ausbilden können. Stellen Sie die Mehrfachplatte mit den Zellen auf den Mikroskoptisch.
Platzieren Sie die Elektroden am Boden der Vertiefung und verbinden Sie sie mit dem Impulsgeber. Um eine optimale Elektrofusion zu erreichen und die Zellviabilität aufrechtzuerhalten, sollten geeignete Parameter für die elektrischen Impulse verwendet werden. Diese Parameter hängen von der Zelllinie ab und müssen in Vorversuchen bestimmt werden. Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter ISO omu Kaliumphosphatpuffer bei 350 Mikrolitern hypos Miller Kaliumphosphatpuffer, um eine Zellschwellung zu induzieren.
Lassen Sie die Zellen zwei Minuten lang im hyperosmotischen Puffer, bevor elektrische Impulse appliziert werden. Elektrische Impulse sollten angewendet werden, wenn sich die Zellen nahe ihrem maximalen Volumen befinden, also bevor sie die regulierende Volumenanpassung einleiten.
Abnahme in unserem Experiment. Es wurde ein Impulszug aus acht rechteckigen Impulsen mit einer Dauer von 100 Mikrosekunden bei einem Hertz angelegt. Nach der Impulsabgabe.
Lassen Sie die Zellen nach 10 Minuten für 10 Minuten ungestört. Bestimmen Sie die Diffusionsausbeute mittels Hellfeldkontrast und Fluoreszenzmikroskopie. Erstellen Sie drei Bilder, Hellfeldkontrast sowie rote und grüne Fluoreszenz, in fünf zufällig ausgewählten Sichtfeldern.
In jedem Fall erstellen wir aus jedem Bildtriplett mit der Image-J-Software Dreikanalbilder, um die Bildqualität visuell zu verbessern, sodass Vorverarbeitungsschritte wie Hintergrundsubtraktion und Kontrastverbesserung mit Standard-Parametersätzen auf die ursprünglichen Bilder angewendet werden können. Abschließend werden die Dreikanalbilder mithilfe des RGB-zu-Graustufen-Plugins von Image J zusammengesetzt. In einem solchen Bild sind das ruhende Zytoplasma sowie die Zellmembranen sichtbar.
Daher können in der Dreikanal-Bildzählung leicht nur wenige Zellen erfasst werden, die alle drei Zelltypen – rote, grüne und doppelt fluoreszierende Zellen – enthalten. Ermitteln Sie den Prozentsatz doppelt fluoreszierender Zellen, indem Sie die Anzahl der doppelt fluoreszierenden Zellen durch die Gesamtanzahl aller Zellen in jedem Bild dividieren. Die Fusionseffizienz wird dann als der doppelte Prozentsatz der doppelt fluoreszierenden Zellen definiert.
Da die Hälfte der Ansichtszellen nicht erfasst wird, wenn Zellen derselben Farbe angezeigt werden.
Übersicht
Dieses Video zeigt die effiziente Elektrofusion von Zellen in vitro unter Verwendung einer modifizierten Adhärenzmethode in Kombination mit Elektroporation. Der Prozess umfasst die Detektion fusionierter Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellfusionsmethoden
- Elektroporationsmethoden
- Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie
Hintergrund
- Die Elektrofusion ist eine Technik, bei der elektrische Impulse zur Förderung der Zellfusion angewendet werden.
- Mit dieser Methode lässt sich die Effizienz bei der Erzeugung von Hybridzellen verbessern.
- Mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie können fusionierte Zellen sichtbar gemacht werden.
- Das Verständnis der Zellfusion ist für zahlreiche biologische Anwendungen von entscheidender Bedeutung.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Elektrofusion von Zellen demonstrieren.
- Die Effizienz der Zellfusion sichtbar machen und quantifizieren.
- Ein Protokoll bereitstellen, das in anderen Laboren reproduziert werden kann.
Verwendete Methoden
- Maus-Melanomzellen wurden kultiviert und zur Fusion vorbereitet.
- Fluoreszenzfarbstoffe wurden verwendet, um die Zellen vor der Fusion zu markieren.
- Elektrische Impulse wurden zur Induktion der Zellfusion angewendet.
- Die Fluoreszenzmikroskopie wurde eingesetzt, um die Fusionsergebnisse zu analysieren.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Fusion von Zellen wurde durch Fluoreszenz angezeigt.
- Der Anteil doppelt fluoreszierender Zellen wurde berechnet, um die Fusionsausbeute zu bestimmen.
- Optimale Parameter für den elektrischen Puls wurden hinsichtlich der Zellviabilität ermittelt.
- Die visuelle Bildqualität wurde durch Bildverarbeitungstechniken verbessert.
Schlussfolgerungen
- Die modifizierte Adhärenzmethode ist wirksam für die Zellelektrofusion.
- Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein wertvolles Hilfsmittel zur Beurteilung der Fusionsrate.
- Dieses Protokoll kann für verschiedene Zelltypen in der Forschung angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Visualisierung der Zellelektrofusion mittels Fluoreszenzmikroskopie bietet eine nicht-virale, nicht-chemische Plattform zur Erzeugung von Hybridzellen und unterstützt die frühe Entwicklungsphase der Biopharmaforschung. Die quantitative Darstellung von Fusionereignissen ermöglicht eine robuste Bewertung von Zellmanipulationstechniken, was direkten Einfluss auf die Zielvalidierung und die Assayentwicklung hat. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in zellbasierten Arbeitsabläufen und unterstützt risikoadjustierte Portfolioentscheidungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung von Zellfusionsmechanismen, die für die Überprüfung therapeutischer Hypothesen relevant sind.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Strategien zur Zellmanipulation für die Erzeugung hybrider Zellen.
- Erleichtert die biologische Risikominimierung durch Quantifizierung der Fusions-Effizienz und -Spezifität.
- Liefert messbare Ergebnisse für die Portfolio-Priorisierung und die Zuversicht in Zielstrukturen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte Zellsysteme für die nachgeschaltete Untersuchung fusionabhängiger Phänotypen.
- Ermöglicht eine standardisierte, reproduzierbare Quantifizierung der Fusionsausbeute mittels Doppelmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen.
- Ermöglicht die Skalierbarkeit des Assays und die Wiederverwendung der Plattform zur Evaluierung von Substanzen, die auf Zellfusionsprozesse abzielen.
- Unterstützt ein zuverlässiges Benchmarking von Fusionsprotokollen über verschiedene Zelltypen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht durch die Generierung hybrider Zellen für die präklinische Modellierung die Anbindung an translationale Arbeitsabläufe.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung zellbasierter Therapien.
- Verringert mechanistische Unschärfen bei Strategien zur Zellmanipulation für die therapeutische Entwicklung.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von therapeutischen Konzepten auf Basis der Zellfusion.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Forschung, indem sie eine robuste Quantifizierung und Visualisierung der Zellfusion ermöglicht und sowohl die frühe Validierung als auch translationsmedizinische Forschung unterstützt.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Die quantitative Messung der Fusionsausbeute unterstützt die Hypothesenprüfung und die Klärung von Signalwegen.
- Screening: Duale Fluoreszenzsignale ermöglichen die Entwicklung reproduzierbarer Assays und deren Benchmarking.
- Analytik: Bildbasierte Quantifizierung liefert objektive, vergleichbare Ergebnisse zur Beurteilung von Bedingungen.
- Translationale Forschung: Die Erzeugung hybrider Zellen unterstützt die präklinische Modellierung und die Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Der Arbeitsablauf ist über verschiedene Zelltypen und Forschungsprogramme hinweg anpassbar und erhöht so den Plattformnutzen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei Zellfusionsabläufen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Quantifizierung der Fusion und unterstützt die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Teams.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz in frühen Programmphasen.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung zellbasierter therapeutischer Strategien.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse.
- Benötigt Zugang zu Impulsgebern, Fluoreszenzmikroskopen und Bildverarbeitungssoftware.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Markierung, Bildgebung und Quantifizierungsprotokollen voraus.
- Die Übertragung auf verschiedene Zelllinien kann eine Optimierung der Pulsparameter und Markierungsbedingungen erfordern.
- Die Fusionseffizienz und Vitalität sind abhängig von der Zelllinie und müssen empirisch bestimmt werden.
