Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Nanosphären auf Mikrotubuli aufzuladen, die auf einer Oberfläche gleiten, die mit Kinasen in Motoren beschichtet ist. Dies wird erreicht, indem zunächst die Oberfläche einer Glas-Flusszelle mit einer Casein-Lösung beschichtet wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Kinesin-Motorproteine auf der Oberfläche der Flusszelle zu adsorbieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mikrotubuli hinzuzufügen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Hinzufügen der Streptavidin-Moleküle, die an die Mikrotubuli binden, gefolgt vom Hinzufügen der Nanosphären. Die Nanosphären binden an die Oberfläche der Durchflusszelle, wo sie von den Mikrotubuli aufgenommen werden können.

Schließlich kann man beobachten, wie Nanosphären von Mikrotubuli aufgenommen und mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie über die Oberfläche transportiert werden. Hallo, ich bin Elaine Jen Smith aus dem Labor von Dr. Henry Hess am Department für Werkstoffwissenschaft und -technik der University of Florida. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren für den inversen Motilitätsassay.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um das Beladen von Fracht auf Mikrotubuli und die Bewegung molekularer Transportvehikel zu untersuchen. Beginnen wir also. Bereiten Sie vor Beginn dieses Verfahrens alle Stammlösungen frisch gemäß dem schriftlichen Teil dieses Videos vor.

Nachdem die Stammlösungen hergestellt wurden, beginnen Sie mit der Vorbereitung der Mikrotubuli, indem Sie 25 Mikroliter Wachstumslösung in ein 0,65-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Anschließend geben Sie 6,25 Mikroliter der Wachstumslösung zu 20 Mikrogramm lyophilisiertem biotinyliertem Tubulin hinzu. Vortexen Sie die Lösung und geben Sie sie für 30 Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die Polymerisation nach der Inkubation zu ermöglichen. Verdünnen Sie die Lösung danach 100-fach in Taxol-Puffer und vortexen Sie vorsichtig.

Diese Lösung dient der Stabilisierung der Mikrotubuli. Beschriften Sie die Lösung als leere 100 und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Stellen Sie anschließend eine zehnfache Verdünnung von MT 100 in Anti-Fade-Puffer her und beschriften Sie diese Lösung als MT 1000.

Bereiten Sie dann die Kinesin-Motoren vor, indem Sie die Kinesin-Lösung im Verhältnis 1:20 in TP-Puffer verdünnen. Kennzeichnen Sie die Lösung als Kinase in 20 und lagern Sie sie auf Eis. Stellen Sie abschließend die Streptavidin- und Nanosphären-Lösungen her.

Fügen Sie zunächst Alexa Fluor 568-markiertes Streptavidin in einer Konzentration von 100 Nanomolar in Antifa-Puffer hinzu. Bezeichnen Sie die Lösung als STV 100, verdünnen Sie die Nanosphären dann 5.000-fach in Antifa-Puffer und kennzeichnen Sie dieses Gemisch als NS 5.000. Lagern Sie beide Lösungen auf Eis.

Nach der Lösungsherstellung für den Frachtbeladungs-Assay wird eine Flusszelle unter Verwendung einer Deckplatte und eines Deckgläschens, die durch doppelseitiges Klebeband getrennt sind, konstruiert. Zunächst werden zwei Streifen doppelseitigen Klebebands an den Rändern der Deckplatte befestigt, wobei ein Abstand von etwa einem Zentimeter zwischen den Streifen verbleibt. Danach wird das Deckglas über das Klebeband gelegt.

Üben Sie mit der flachen Kante einer Pinzette Druck auf die Deckglasplatte aus, um eine Dichtung zu erzeugen. Die hergestellte Flusszelle ist etwa zwei Zentimeter lang, einen Zentimeter breit und 100 Mikrometer hoch und hat ein Volumen von etwa 20 Mikrolitern. Um die Montage des Invertierten Assays zu beginnen.

Platzieren Sie die Pipettenspitze zwischen Deckglas und Objektträger. Injizieren Sie dann eine Casein-Lösung mit 0,5 Milligramm pro Milliliter in die Flusszelle. Diese Beschichtung der Flusszelle ermöglicht es Kinesin, nach der Adsorption seine Funktionalität beizubehalten.

Warten Sie fünf Minuten, damit die Casein-Lösung beschichten kann. Danach adsorbieren Sie Kinesin auf der Flusszelle, indem Sie die Kinase in 20 Lösungen in die Flusszellen einführen, wobei die Lösungen eingeführt werden, indem die Pipettenspitze zwischen Deckglas und Objektträger platziert wird. Dann wird die Lösung von einer Seite in die Flusszelle injiziert, während sie gleichzeitig von der anderen Seite abgezogen wird.

Mit Filterpapier fünf Minuten warten, damit das Kinase-In-Markierungsmittel absorbiert werden kann. Danach die Mikrotubuli mittels Pipettieren der MT-1000-Lösung in die Flusszelle einführen. Fünf Minuten warten, damit sich die Mikrotubuli absetzen und an die Kinase-In-Motoren binden können, nachdem die Mikrotubuli an die Kinase-In-Motoren angeheftet wurden.

Beschichten Sie die Mikrotubuli mit fluoreszierendem Strep-TTR, indem Sie die STV-100-Lösung in die Durchflusszelle einbringen. Lassen Sie die Strep-TTR-Moleküle fünf Minuten lang an die Mikrotubuli binden. Spülen Sie das überschüssige Strep-TTR aus, indem Sie dreimal je 30 Mikroliter Antifa-Lösung in die Durchflusszelle einbringen.

Schließlich werden die biotinylierten Polystyrol-Fluorescein-Nanosphären eingeführt, indem die NS 5.000-Lösung in die Durchflusszelle pipettiert wird. Die Oberfläche absorbiert stationär. Die Nanosphären kollidieren mit den sich bewegenden Mikrotubuli und lagern sich an diese an.

In diesem Experiment wird ein Eclipse-TE-2000-U-Fluoreszenzmikroskop mit einem 100×-Ölimmersionsobjektiv, X-Site, einer 20-Lampe und einer Exon-E-M-C-C-D-Kamera verwendet. Tragen Sie zunächst einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv auf. Bringen Sie dann die Durchflusszelle mit Hilfe des Trixy-Filterwürfels auf dem Mikroskoptisch an.

Bringen Sie die Mikrotubuli in den Fokus, dann wechseln Sie zum Fitzy-Filterwürfel, um die Nanosphären zu betrachten. Öffnen Sie anschließend das And-or-I-Exon-Programm und stellen Sie den Aufnahmemodus auf kinetisch ein. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von 0,5 Sekunden, eine Länge der kinetischen Serie von 20 und eine kinetische Zykluszeit von sechs Sekunden.

Schalten Sie das Mikroskop vom Okular auf die Kamera um und beginnen Sie mit der Bildaufnahme. Verwenden Sie für die ersten vier Bilder den Trixi-Filterwürfel, um die Mikrotubuli abzubilden. Wechseln Sie für die nächsten 12 Bilder zum Fitz-Filterwürfel, um Aufnahmen der Nanosphären anzufertigen.

Danach wieder zum Trixi-Filterwürfel wechseln. Für die letzten vier Bilder zur Abbildung der Mikrotubuli werden die Mikrotubuli mithilfe des Trissy-Filterwürfels beobachtet, der Filterwürfel wird gewechselt zu Fite, um hier die Nanosphären sichtbar zu machen. Mit Pfeilen sind Nanosphären markiert, die von Mikrotubuli transportiert werden. Nicht alle Nanosphären wurden von Mikrotubuli aufgenommen.

Nun wird die Position der Nanosphären 36 Sekunden später gezeigt, wobei sich herausstellt, dass sich die Nanosphären verschoben haben. Wenn die Mikrotubuli erneut abgebildet werden, wird deutlich, dass sich auch die Mikrotubuli über das Sichtfeld hinweg bewegt haben. Diese Bilder zeigen, dass die Nanosphären aufgrund des Mikrotubuli-Transports versetzt wurden.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man den invertierten Motilitätstest durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Filterwürfel während der Bildaufnahme zu wechseln, damit sowohl die Mikrotubuli als auch die Nanokügelchen sichtbar sind. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.