Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro

Die Migration von T-Lymphozyten erfolgt während des Homings zu lymphatischen Organen, des Austritts aus dem Gefäßsystem und des Eintritts in periphere Gewebe. Dieser Prozess beinhaltet die adhesive Wechselwirkung der T-Zelloberfläche mit anderen Zellen. Um dieses Phänomen in vitro zu untersuchen, werden humane T-Lymphozyten isoliert, kultiviert und auf mit dem adhäsiven Protein beschichtete Zellkulturplatten gegeben.

ICAM-1 und Chemokin SDF-1. Anschließend können Bilder der T-Lymphozyten-Migration aufgenommen und analysiert werden. Hallo, ich bin Craig LeFort aus dem Labor von Minsu Kim am Zentrum für Impfstoffbiologie und Immunologie der Universität von Rochester.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung und Kultur menschlicher jugendlicher Lymphozyten sowie eine Analyse ihrer Migration in vitro. Wir verwenden diesen Test in unserem Labor, um die Rolle von Integrinen und der T-Zell-Migration zu untersuchen. Das wichtigste Integrin in T-Zellen ist das mit der Lymphozytenfunktion assoziierte Antigen 1 oder LFA-1.

Die spezifischen Liganden für LFA-1 sind die ICAMs, beispielsweise ICAM-1. Zusätzlich ist ein Chemokin-Signal für die T-Zell-Migration erforderlich, um sowohl ein Richtungssignal bereitzustellen als auch Integrine zu aktivieren. In unserem Assay verwenden wir menschliches ICAM-1 sowie CXCL12 oder SDF-1 als Substrate für die T-Zell-Migration.

Beginnen wir also. Nachdem menschliches Blut von einem gesunden Spender gewonnen wurde, lassen Sie es auf Raumtemperatur abkühlen. Dies dauert etwa 30 Minuten.

Nachdem das Blut abgekühlt ist, pipettieren Sie vorsichtig drei Milliliter polymorphe Dichtegradientenmedien mit Raumtemperatur in ein acht Milliliter fassendes Rundbodentestgefäß aus Polystyrol. Geben Sie dann vorsichtig drei Milliliter Vollblut darauf. Es ist wichtig, jegliche Vermischung zu vermeiden.

Die Röhrchen in eine Zentrifuge geben und 45 Minuten bei 500 ×g zentrifugieren. Nach der Zentrifugation bei Raumtemperatur sind die peripheren mononukleären Blutzellen oder PBMCs von den anderen Blutbestandteilen getrennt. Die PBMC-Schicht erscheint als erstes trübes Band von oben.

Unter sterilen Bedingungen vorsichtig die klare, gelb gefärbte obere Phase entfernen und verwerfen. Anschließend mit einer P-1000-Mikropipette die PBMC-Schicht in ein neues kegelförmiges Reagenzglas überführen. Die PBMC zweimal mit PBS waschen, wobei die Zellen bei 500 ×g fünf Minuten lang zentrifugiert werden.

Jedes Mal wird das Überstandmedium nach jeder Wäsche etwas trüb sein. Resuspendieren Sie die Zellen in 20 Milliliter RPMI 1640-Medium, das 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und ein Mikrogramm pro Milliliter Phytohämaggglutinin oder PHA enthält. Die Inkubation in Gegenwart von PHA induziert die Aktivierung und Expansion von T-Lymphozyten.

Überführen Sie die PBMCs mit einer Pipette in einen T-75-Kulturkolben. Inkubieren Sie anschließend bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für eine bis 24 Stunden. Bei diesem Schritt können Monocyten, die an der Kolbenoberfläche adhärieren, von den in Suspension verbleibenden Lymphocyten getrennt werden.

Nach der Inkubation vorsichtig das gesamte Medium, das hauptsächlich Lymphozyten enthält, entfernen und in ein 15-Milliliter-Konischglas überführen. Zentrifugieren bei 500 ×g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in RPMI 1640 und überführen Sie die Zellen in eine neue T-75-Flasche, die 25 Milliliter RPMI 1640 mit FBS, Penicillin, Streptomycin und PHA enthält, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius.

Nach 24 Stunden Wachstum kann es notwendig sein, 15 bis 20 Milliliter frisches Medium hinzuzufügen und in einen größeren T-175-Flasche zu überführen. Fahren Sie mit der Inkubation für drei oder zwei Tage fort. Wenn die anfängliche Inkubation der PBMC nach drei Tagen über Nacht erfolgte, entfernen Sie mit einer Pipette das Medium, das suspendierte Lymphozyten enthält, und überführen Sie es in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das bei 500 ×g fünf Minuten lang zentrifugiert wird.

Reese hat das Zellpellet aufgenommen und die Zellen in eine neue T-75-Flasche mit 25 Milliliter RPMI 1640 überführt. Mit FBS, Penicillin, Streptomycin und humanem IL-2 oder IL-15 werden die Zellen in den Inkubator gestellt. Falls eine T-75-Flasche als Startkultur verwendet wird, muss die Kultur vergrößert und in eine T-175-Flasche überführt werden.

Nach ein bis zwei Tagen die Lymphozyten insgesamt vier bis sieben Tage lang kultivieren. Einen Tag vor dem Migrationsassay eine Glasbodenkultur-Schale mit einer Dicke von 0,17 Millimeter mit 20 Mikrogramm pro Milliliter Protein A oder G in PBS beschichten und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Die Schale am nächsten Tag gründlich mit PBS waschen und anschließend ICAM-1-Fc und humanes SD F1 in PBS-Lösung zur Schale hinzufügen.

Die Moleküle vier Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um sie zu immobilisieren. Die Dichte der kultivierten Zellen mithilfe eines Hämozytometers bestimmen. Anschließend die Lymphozyten zweimal mit PBS waschen und nach der Inkubation in einem Milliliter L-15-Medium, das D-Glukose enthält, resuspendieren. Die beschichtete Schale umfassend mit ICAM-1-Fc und SDF-1 mit PBS waschen. Die T-Lymphozyten in einem Milliliter Medium auf die Schale übertragen; pro Schale sollten ungefähr zwei bis fünf mal 10 hoch fünf Zellen verwendet werden, um eine für die Migrationsanalyse geeignete Zelldichte zu erreichen.

Um Bilder der Zellmigration zu erhalten, stellen Sie die Petrischale auf die Mikroskopbühne in einer temperaturgeregelten Umgebung, beispielsweise einer beheizten Kammer bei 37 Grad Celsius. Öffnen Sie die NIS-Elements-Software im Menü für die Bildereinstellungen. Wählen Sie zwei-mal-zwei-Binning als Modus sowohl für die Live-Bildgebung als auch für die Bildaufnahme.

Gehen Sie zum Anwendungs-Menü und wählen Sie Experiment definieren und ausführen. Wählen Sie die Zeitspanne zwischen den Bildern und die Gesamtzeit. Drücken Sie für die Bildaufnahmesequenz die Schaltfläche „Ausführen“, um die Bildaufnahme nach der Erfassung zu starten.

Migrationsparameter wie Geschwindigkeit, Weglänge und Verschiebung können mit einem Softwarepaket wie Image J Auto Quant oder veloc quantifiziert werden. Um ein Spinnennetzdiagramm zu erstellen, sammeln Sie die XY-Koordinaten für jede Zelle und jeden Zeitpunkt und projizieren Sie diese auf einen Graphen mit einem gemeinsamen Ausgangspunkt für jede Zelle im Ursprung. Die hier gezeigten T-Lymphozyten wurden auf ICAM und SDF1 kultiviert und alle 10 Sekunden über einen Zeitraum von 30 Minuten abgebildet.

Dieses Video zeigt die zufällige Migration von T-Lymphozyten mit einer Geschwindigkeit von etwa 15 Mikrometern pro Minute unter Verwendung der XYT-Koordinaten für jede Zelle. 15 Zellen wurden zufällig ausgewählt und mit einem gemeinsamen Startpunkt im Ursprung dargestellt. Der Vergleich von Spinnennetzdiagrammen liefert eine schnelle visuelle Darstellung der Unterschiede in der Migration unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.

Die Plots zur T-Lymphozyten-Migration unter Kontrollbedingungen sind links dargestellt, während die Plots zur T-Lymphozyten-Migration in Gegenwart eines anti-LFA-1-Liganden-blockierenden Antikörpers rechts gezeigt werden. Diese Daten zeigen, dass T-Lymphozyten das Integrin LFA-1 nutzen, um auf einem ICAM-1-Substrat zu migrieren. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man einen Migrationsassay unter Verwendung kultivierter humaner T-Lymphozyten während des Verfahrens durchführt.

Es ist wichtig, daran zu denken, eine geeignete Anzahl von Zellen in die ICAM-1-beschichtete Schale zu geben, damit die Zellverfolgung und die Analyse der Migration vereinfacht werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.