Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, festzustellen, ob zwei Gene funktionell redundant für die Spezifikation einer definierten Zelllinie sind. Dies wird erreicht, indem zunächst das Funktionsverlust-Phänotyp jedes einzelnen Gens mithilfe genspezifischer Morpholinos, die in sich entwickelnde Zebrafischembryonen injiziert werden, definiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Assay zur Quantifizierung der Zelllinienspezifikation oder Differenzierung zu entwickeln.

Beispielsweise unter Verwendung einer Reportergen-Fischlinie, wie wir hier zeigen werden. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, zwei morphologische FENOs zu kombinieren, um den Funktionsverlust beider Gene gleichzeitig zu erzielen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Bewertung des Phänotyps, der durch den doppelten Knockdown verursacht wird.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch Untersuchung des Linienreporters oder Analyse der Expression linien-spezifischer Marker einen Funktionsverlust oder eine Funktionsgewinnung für Zellen einer bestimmten Linie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Kombination von Knockouts im Mausmodell besteht darin, dass zwei oder sogar drei Gene im Fischmodell gezielt angesprochen werden können, indem einfach validierte Morpholinos in einem einzigen Experiment kombiniert werden. Über 100 Embryonen können injiziert und Phänotypen innerhalb weniger Tage ausgewertet werden.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen beantworten. In der Entwicklungsbiologie, beispielsweise bei der Bestimmung der transkriptionellen Signalwege, die das Zellschicksal steuern, werden wichtige regulatorische Signalwege häufig durch kleine Familien verwandter Gene repräsentiert, die funktionell redundant sind. Ihre Rolle ist daher aus Knockout-Studien an Mäusen nicht ersichtlich, da sie durch Schwester-Gene kompensiert wird.

Obwohl dieses Modell Einblicke in die Embryogenese des Zebrafisches ermöglicht, können die Ergebnisse auch auf andere Systeme wie die Maus übertragen werden, da die gleichen genetischen Programme im Verlauf der Evolution in der Regel gut konserviert sind. Bereiten Sie Mikroinjektionsplatten vor, bevor Sie Embryonen injizieren. Gießen Sie etwa 12 Milliliter 2 % Agarose in Systemwasser, das sauberes Wasser ist, das direkt aus dem Fischtanksystem stammt, in den umgedrehten Deckel einer 100-Millimeter-Petri-Schale.

Stellen Sie zwei Objektträger in einem Winkel von etwa 45 Grad an den beiden Seiten des Deckels ab. Wenn das Agarose erstarrt ist, ziehen Sie die Objektträger vorsichtig vom Deckel weg, wodurch Rillen entstehen, in denen die Embryonen während der Injektion liegen werden. Morpholinos werden bei Raumtemperatur in einer Konzentration von einem Millimolar in steriler, destillierter, entionisierter Wasser aufbewahrt, bevor sie injiziert werden. Inkubieren Sie die Morpholino-Stammlösungen bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten, um sicherzustellen, dass sie vollständig gelöst sind.

Lassen Sie die Stammlösungen auf Raumtemperatur abkühlen. Jeder neu entworfene Morpholino muss empirisch auf Aktivität und Embryotoleranz überprüft werden. Beginnen Sie in Mikrozentrifugenröhrchen mit einer bis zwei seriellen Verdünnungen der Morpholino-Stammlösung in destilliertem, deionisiertem Wasser, um Arbeitskonzentrationen von 1 Millimolar, 0,5 Millimolar, 0,25 Millimolar und 0,125 Millimolar zu erhalten.

Unter einem Stereomikroskop die Saugkraft verwenden, um eine kalibrierte Injektionsnadel, die an den Mikromanipulator angeschlossen und korrekt positioniert wurde, von vorn zu befüllen. Die Nadel mit etwa einem Mikroliter der verdünntesten Morpholino-Lösung beladen. Mit einer Transferpipette befruchtete Einzelzell-Embryonen in die Rillen der Mikroinjektionsplatte überführen.

Entfernen Sie mit der Pipette überschüssiges Wasser von der Platte, sodass die Embryonen auf den Boden der Rille sinken. Positionieren Sie die Injektionsplatte unter dem Mikroskop, senken Sie die Nadel durch die Korion in das Eiweiß ein. Injizieren Sie jeden Embryo, bevor Sie die Nadel zurückziehen und die Injektionsplatte neu positionieren, um zum nächsten Embryo zu gelangen.

Beim Erlernen der Injektion kann es hilfreich sein, einen vitalen Farbstoff zu verwenden, um die Injektion in die Zelle wie hier gezeigt sichtbar zu machen, übertragen Sie die Embryonen zurück in eine 100 Millimeter Petrischale mit Systemwasser und kultivieren Sie sie bei 28,5 Grad Celsius. Drücken Sie die restliche Morpho-Lösung aus der Nadel heraus und füllen Sie sie mit der nächsthöheren Konzentration an Morpho, um die nächste Charge Embryonen in einem geeigneten Entwicklungsstadium zu injizieren. Untersuchen Sie die Embryonen auf Phänotypen bei jeder injizierten Morpho-Konzentration.

Die Schwellendosis für jeden Morpho ist die niedrigste Dosis, bei der ein definiertes, zuverlässiges Phänotyp beobachtet wird. Es können mehrere Titrationsschritte erforderlich sein, um die ungenaue Schwelle zu bestimmen. Um nach einer genetischen Interaktion zwischen zwei unterschiedlichen Genen zu suchen.

Bereiten Sie eine Mischung aus zwei Morphos von Interesse vor, jeweils in ihrer jeweiligen Schwellenkonzentration. Es ist wichtig zu beachten, dass die Embryonen möglicherweise nicht mehr als 20 Nanogramm gesamtes Morpho pro Injektion vertragen. Injizieren Sie die Embryonen auf die gleiche Weise wie zuvor.

Halten Sie die Injektionsvolumina zwischen experimentellen und Kontrollgruppen konstant, zu denen auch Gruppen gehören sollten, die jeweils mit jedem einzelnen Morpho unter dem Stereomikroskop injiziert wurden. Überwachen Sie die injizierten Embryonen unmittelbar nach der Injektion und mehrmals während des Tages und entfernen Sie mithilfe einer Transferpipette alle toten oder sterbenden Embryonen. Da diese die Lebensfähigkeit der verbleibenden Morphine beeinträchtigen können, bewegen Sie sedierte oder euthanasierte Embryonen jederzeit mit einer Transferpipette.

Zeigen Sie auf eine Vertiefungsrutsche zur Beobachtung. Zum Fotografieren. Entfernen Sie gegebenenfalls mit einer scharfen Pinzette die Korion.

Stabilisieren Sie das Embryo in einem Tropfen mit 3 % Methylcellulose und untersuchen Sie die Embryonen auf ein ausgeprägtes Phänotyp, der spezifisch für die Kombination der Morpholinos ist, im Gegensatz zu einer stärkeren Penetranz des Phänotyps einzelner Morpholinos. Hier sind mehrere Wildtyp-Embryonen, die mit Morpholinos an der Schwelle injiziert wurden. Bei gata5 ist der typische Phänotyp Cardio bifida oder zwei Herzen, da die Vorläuferzellen an der Mittellinie nicht fusioniert sind.

Beachten Sie die durch die Pfeile markierten GFP-positiven Kardiomyozyten. Das Phänotyp für sechs Morphine umfasst fehlgebildete Herzen, die nicht korrekt geschlossen werden. Diese Embryonen entwickeln ebenfalls GFP-positive Kardiomyozyten.

Jedoch zeigen die hier dargestellten Embryonen, die mit einer Kombination aus beiden gata five- und gata six-Morpholinos injiziert wurden, einen vollständigen Verlust der Kardiomyozytenentwicklung, was darauf hinweist, dass entweder gata five oder gata six exprimiert werden muss, damit Kardiomyozyten sich entwickeln können. Die beiden Gene sind funktionell redundant für die Spezifikation der Kardiomyozyten.

Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, zunächst Ihre Morphos vollständig zu validieren und so sicher wie möglich zu stellen, dass sie eine echte Herunterregulation eines einzelnen Genziels darstellen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Kombination konditionaler Maus-Nullallele durchgeführt werden, um zu zeigen, dass dieselben Gene auch bei Säugetieren dieselbe Funktion besitzen.

Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man feststellen kann, ob zwei Gene während der Embryogenese funktionell redundant sind.