Vergleichende In vivo Studium der gp96 Adjuvantizität in the Frog Xenopus laevis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die evolutionäre Erhaltung der Hitzeschockprotein G 96 dahingehend zu untersuchen, antigen-spezifische CD acht T-Zell-Antworten im Frosch Xenopus laevis zu fördern. Dies wird erreicht, indem zunächst peritoneale Leukozyten mittels Peritoneallavage gewonnen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die peritonealen Leukozyten mit tumorabgeleiteter GP 96 zu belasten, die minor und Tumorantigene als Chaperon begleitet, nach Inkubation und Waschschritten.

Die peritonealen Leukozyten werden durch intraperitoneale Injektion adoptiv in naiven Fröschen übertragen, um diese Frösche gegen Tumor- oder minor histokompatible Antigene zu sensibilisieren. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die sensibilisierten Frösche entweder mit einer Hauttransplantation oder einer Tumorchallenge zu behandeln und den Beginn der Abstoßung der Hauttransplantate oder das Auftreten von Tumoren zu überwachen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Gewinnung von peripherem Blut zur Charakterisierung der an der Hautabstoßung und den anti-tumoralen Reaktionen beteiligten T-Zellen.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine signifikante Beschleunigung der Abstoßung von Hauttransplantaten sowie eine Verzögerung des Tumorauftretens bei über GP96 prämierten Fröschen im Rahmen der Hauttransplantations- und Tumorprovokationsassays zeigen. Hallo, ich bin Christina Koska im Labor von Dr. Jacque Robert aus der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie am University of Rochester Medical Center. Ich bin Tanya Cruz, ebenfalls aus dem Labor von Dr. River.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Immunisierung von Klonfröschen durch adoptive Übertragung von peritonealen Leukozyten, gefolgt von Hauttransplantationen und Tumorverpflanzungsassays. Außerdem zeigen wir Ihnen, wie man peripheres Blut von diesen Tieren gewinnt. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Fähigkeit des Hitzeschockproteins GP96 zu untersuchen, antigen-spezifische CDAT-Zellen in Salla zu fördern, sowie um die beteiligten Zelltypen zu analysieren.

Okay, beginnen wir. Die Frösche, die in unseren Experimenten verwendet werden, sind ISO-genetische Klone aus unserer Zuchtstation an der University of Rochester. Um peritoneale Leukozyten oder PLs zur Gewinnung zu stimulieren, injizieren Sie mittels einer 25-Gauge-5/8-Nadel dem anästhesierten Frosch eine hitzeabgetötete E. coli-Präparation intraperitoneal. Drei Tage nach der Injektion werden die PLs durch eine intraperitoneale Lavage gewonnen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, desinfizieren Sie den Bauch der anesthetisierten Frosches mit einer kleinen Menge 70 %igem Ethanol. Anschließend injizieren Sie mit einer 18-Gauge-1,5-Nadel fünf Milliliter sterilem, amphibienhaltigem, phosphatgepuffertem Kochsalzlösung (PBS) oder einer PBS-Lösung, die zuvor auf Raumtemperatur erwärmt wurde, in die Bauchhöhle. Entfernen Sie die Nadel und massieren Sie den Frosch sanft für eine Minute, um sicherzustellen, dass das injizierte Puffermittel sich mit der Flüssigkeit in der Körperhöhle vermischt.

Als Nächstes eine neue 18-Gauge-1,5-Nadel ohne Spritze in den Bauch des Frosches einführen. Dabei die Blutgefäße vermeidend, die Peritonealflüssigkeit auffangen, die aus der Nadelspitze in ein sauberes 50-Milliliter-Konischgefäß tropft. Nachdem die PLs geerntet wurden, sicherstellen, dass so viel wie möglich des ursprünglich injizierten Volumens zurückgewonnen wird.

Stellen Sie den Frosch in einen Behälter mit flachem Wasser, bis er aufwacht, danach kann er in seinen Käfig zurückgebracht werden. Sobald die PLS gewonnen wurden, zentrifugieren Sie bei 1000 U/min für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet. Suspendieren Sie die PLS in kaltem A-PBS.

Überführen Sie die RESUSPENDIERTEN pls in ein 1,5-Milliliter-Mikro-Rückstandsröhrchen. Um die PLS mit GP 96 zu pulsieren, geben Sie die entsprechende Menge GP 96 zu den pls hinzu, mischen Sie durch Pipettieren und inkubieren Sie eine Stunde auf Eis; nach einer Stunde.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 14.000 U/min für eine Minute. Um nicht gebundenes GP 96 zu entfernen, entfernen Sie den Überstand. Geben Sie kaltes A PBS hinzu und resuspendieren Sie.

Zentrifugieren Sie das PLS erneut. Waschen Sie das S insgesamt dreimal mit kaltem A-P-B-S-A, um sicherzustellen, dass nach dem letzten Waschschritt kein restliches G 96 mehr vorhanden ist. Resuspendieren Sie das gepulste PLS in einer Konzentration von fünf mal 10 hoch fünf PLS pro 300 Mikroliter PBS, um die PLS adoptiv in naive LG sechs Empfänger zu übertragen.

Injizieren Sie 300 µL gepulste pls pro Tier intraperitoneal. Die Frösche müssen mindestens drei Tage vor den Hauttransplantations- oder Tumorchallenge-Experimenten, die im Folgenden gezeigt werden, vorbehandelt werden. Die Haut für die Transplantation wird von einem anästhesierten LG-15-Donor-Frosch entnommen.

Verwenden Sie eine Schere, um ein kleines Stück der Bauchhaut, die silbrig erscheint, abzuschneiden und zu entfernen. Aufgrund des Vorhandenseins von ARI vier pigmentierten Zellen ist beim Umgang mit dem Transplantat Vorsicht geboten. Es ist entscheidend, die Manipulation des Gewebes so gering wie möglich zu halten, da dies zu Schäden am Transplantat führen kann.

Halten Sie die Haut mit der Pinzette sehr vorsichtig und legen Sie sie in eine Petrischale mit kaltem A-PBS. Stellen Sie die Petrischale weiterhin darauf. Legen Sie die Haut auf einen frischen Objektträger und schneiden Sie einzelne Transplantate mit einem Rasiermesser in Stücke von fünf Millimeter mal fünf Millimeter.

Halten Sie die Fragmente in PBS auf Eis, um die Haut auf sechs Empfängerfrösche zu transplantieren. Erstellen Sie zunächst einen kleinen Einschnitt in der dorsalen Haut des anesthetisierten Empfängers. Anschließend wird das fünf Millimeter mal fünf Millimeter große Transplantat mit der silbrigen Seite nach oben unter die Haut eingesetzt.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Markierungen der Schere und der Pinzette an den Transplantaten vermerken, da diese nicht als Transplantatabstoßung gezählt werden. Sobald die Bewertung 24 Stunden später beginnt, muss ein Teil der überlagernden Haut des Wirts vom Transplantat entfernt werden. Verwenden Sie eine Schere, um ein Fenster rund um das Transplantat auszuschneiden, sodass das Transplantat frei einsehbar ist.

Vermeiden Sie es sorgfältig, die Spenderhaut zu berühren oder Blutungen zu verursachen. Beginnen Sie sofort mit der Beurteilung des Transplantats, indem Sie eine Skizze anfertigen. Hauttransplantat.

Die Abstoßung wird anhand des Prozentsatzes der Zerstörung des Aridols auf der transplantierten Haut bestimmt. Das Transplantat sollte alle zwei bis drei Tage unter dem Stereomikroskop überprüft werden. Bereiten Sie Tumorzellen für die Transplantation vor, indem Sie sie resuspendieren und in Tumorzellkulturmedium mit einer Dichte von fünf mal 10 hoch fünf Zellen pro 300 Mikroliter suspendieren.

Transplantieren Sie die Zellen durch subkutane Injektion auf einer Seite der dorsalen Fläche des Tieres. Fünf mal 10 hoch fünf Zellen in einem Volumen von 300 µL werden pro Frosch injiziert. Das Tumorwachstum setzt innerhalb von zwei bis drei Wochen nach der Tumorbehandlung ein.

Notieren Sie das ursprüngliche Erscheinungsbild des Tumors. Messen Sie mit einem Messschieber die Abmessungen des Tumors und notieren Sie dessen Volumen alle zwei bis drei Tage vor der Gewinnung von Leukozyten aus dem Blut des Frosches. Bereiten Sie Glasnadeln vor, indem Sie Pasta-Peppes über einer Flamme ziehen.

Nachdem die feine Spitze der Pipette unter dem Stereomikroskop geschärft wurde, verbinden Sie die Pipette mit einem Plastikabsaugrohr. Um die Blutentnahme zu beginnen, schneiden Sie die Haut über dem hinteren Fuß des anästhesierten Frosches auf, um die dorsale Tarsusvene freizulegen. Füllen Sie die Glasnadel mit ein bis zwei Milliliter eiskalter PBS-Lösung plus Heparin.

Danach die Glasnadel in die Vene einführen und die Blutentnahme beginnen, indem langsam mit dem Mund aspiriert wird. Aus einem Frosch durchschnittlicher Größe können ein bis zwei Milliliter Blut gewonnen werden. Der kleine Einschnitt am Froschbein muss nicht genäht werden.

Die Wunde heilt innerhalb einer Woche. Hier werden die Ergebnisse einer stereo-mikroskopischen Analyse der Abstoßung einer Hauttransplantation 12 Tage nach der Transplantation gezeigt. Ein geklonter LG-sechs-Frosch, der eine Hauttransplantation von einem MHC-identischen LG-sechs-Spender erhielt, zeigte keine Abstoßung.

Das Sternchen kennzeichnet die Markierung der Pinzette, die nicht auf eine Abstoßung zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu zeigt ein LG-sechs-klonierter Frosch, der eine Hauttransplantation von einem MHC-unterschiedlichen, nicht-inzüchteten Spender erhalten hat, eine Abstoßungsrate von 80 %. In beiden Bildern deuten Pfeile auf silbrig schimmernde, vierpigmentierte Zellen, die gesundes, nicht abgestoßenes transplantiertes Gewebe markieren.

In diesem nächsten Experiment erhielten LG 15 Tiere entweder eine Pulsbehandlung mit PBS als negativen Kontrollstamm, rekombinantem GP 96, das aus einer E. coli-Kultur gereinigt wurde, oder GP 96, das aus 15-Zero-Tumorgewebeszellen gewonnen wurde. Anschließend wurden diese Zellen adoptiv in LG 15 erwachsene Empfänger übertragen, und drei Tage später wurden lebende 15-Zero-Tumorzellen durch subkutane Injektion transplantiert. Die ersten nach der Herausforderung auftretenden Tumore wurden überwacht, und die Tumorgröße wurde regelmäßig gemessen. In diesen Diagrammen stellt jede Kurve die Kinetik des Tumorwachstums bei einem Frosch dar. Die Ergebnisse zeigen, dass Tiere, die mit entweder 0,5 oder einem Mikrogramm GP 96 vorbehandelt wurden, im Vergleich zu den Kontrollgruppen ein signifikant verzögertes Tumorauftreten aufwiesen. Daher ermöglicht GP 96 die Kreuzpräsentation von Tumorantigenen in Xenopus.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Fähigkeit von GP96 untersucht, sowohl minor als auch Tumorantigene im Frosch Xenopus laevis durch Hauttransplantation und Tumorverpflanzungsassays darzustellen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die peritoneale Lavage nicht zu sammeln, wenn ein Blutgefäß beschädigt wurde, da der Großteil der Zellen Erythrozyten und nicht Makrophagen sind. Ebenso wichtig ist es, das Gewebe mit der Pinzette nicht zu quetschen, wenn man die Hauttransplantat manipuliert, um Schäden zu vermeiden.

Das war's also. Vielen Dank fürs Mitwirken und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.