Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Kulturen menschlichen fetalen Retinapigments, Epithels oder RPE zu erzeugen, die als Modell verwendet werden können. Bei Untersuchungen von Erkrankungen des menschlichen Auges werden Gewebe von Spendern als intakte Augäpfel erhalten. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, überschüssige Muskulatur und Bindegewebe zu entfernen und das Auge anschließend zu öffnen, indem die Hornhaut und die Linse entfernt werden.

Das Auge wird mit Dispa behandelt und abgeflacht, anschließend wird die RPE-Einzelschicht vom Choroidea-Disseziert abgelöst. RPE-Zellen werden in Kolben ausgesät und mehrere Wochen lang kultiviert, bis sie konfluente Monolagen bilden und Pigment entwickeln. Die Zellkulturen werden in funktionellen In-vitro-Experimenten verwendet.

Erfolgreiche In-vitro-Experimente werden an präklinischen Tierversuchsmodellen wiederholt, bei denen RPE-Antworten in komplexeren Signalumgebungen besser bewertet werden können. Das hier vorgestellte Modell wird zu einem besseren Verständnis der RPE-Physiologie und neuen therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Augenerkrankungen führen. Hallo, mein Name ist Sheldon Miller.

Mein Labor befindet sich im National Eye Institute, das Teil der National Institutes of Health auf dem Bethesda-Maryland-Campus ist. Hallo, ich bin Arki vom Miller-Labor. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung primärer Kulturen menschlicher fetaler retinaler Pigmentepithelzellen.

Diese Zellen werden als konfluente Monolagen vorbereitet, die in modifizierten Ussing-Kammern montiert werden können. Wir verwenden diese isolierten humanen Pigmentepithelzellen außerdem für biochemische und genetische Untersuchungen. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Primärkulturen von Epithelzellen anzulegen, um die Funktion und Regulation physiologischer und pathophysiologischer Prozesse zu untersuchen und klinische Tiermodelle von Krankheiten zu entwickeln.

Wir konzentrieren uns auf das retinale Pigmentepithel (RPE), das sich im hinteren Teil des Auges befindet und Netzhaut und choroidale Blutversorgung voneinander trennt. Diese schematische Darstellung des Auges zeigt die Lage des RPE-Blättchens im hinteren Augenabschnitt direkt neben den Photorezeptoren. Die Einlage zeigt die Zellen der Netzhaut mit den Photorezeptoren rechts und den Ganglienzellen links.

Dieses Epithel ist metabolisch äußerst aktiv. Es phagozytiert kontinuierlich auf tageszeitlichem Rhythmus die Photorezeptoren und speichert, verarbeitet sowie transportiert das Sehpigment Vitamin A zu den Photorezeptoren. Im visuellen Zyklus wirkt es homöostatisch, um die chemische Zusammensetzung und das Volumen der umgebenden extrazellulären Räume aufrechtzuerhalten.

Eine entscheidende Eigenschaft von Epithelien ist ihre Polarität. Die kontinuierliche asymmetrische Verteilung von Proteinen zu den apikalen und basolateralen Membranen ist ein regulierter Prozess, der es dem Epithel ermöglicht, den gerichteten Transport von Metaboliten, Ionen und Flüssigkeit von einem extrazellulären Raum zum anderen durchzuführen. Diese Aktivität hilft dem Epithel, die Gesundheit und Integrität der neuralen Netzhaut aufrechtzuerhalten.

Die hier beschriebene In-vitro-Präparation ermöglicht die Analyse von Transportproteinen, Rezeptoren und Signalwegen, die die epitheliale Polarität und Funktion bestimmen, bevor mit der Dissektion begonnen wird. Bereiten Sie eine 12-Loch-Platte in einer laminarer Luftstromwerkbank mit Lösungen bei Raumtemperatur vor. Jedes Auge benötigt ein Loch mit 10× Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung, zwei Löcher mit 1× PBS und ein Loch mit zwei Einheiten pro Milliliter Disc-Raum, verdünnt in 5 % RPE-Medium mit Serum. Füllen Sie eine silikonbeschichtete Dissektionschale mit 1× H-B-S-S, lassen Sie die Flüssigkeit ab und überführen Sie jedes Auge in ein Loch mit Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung.

Je nach Raumtemperatur drei bis fünf Minuten inkubieren. Vermeiden Sie jeglichen übermäßigen Druck auf den Augapfel. Spülen Sie das Auge in zwei aufeinanderfolgenden Mulden mit jeweils 1 × PBS, um überschüssiges Antibiotikum zu entfernen.

Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Präparat unter einem Stereomikroskop in eine Petrischale mit 1× H-B-S-S zu überführen. Entfernen Sie mit Iris-Scheren überschüssige Muskulatur und Bindegewebe um das Auge herum. Richten Sie das Auge so aus, dass die Hornhaut nach oben zeigt.

Verwenden Sie zwei sterile 27-Gauge-Nadeln, um das Auge durch das Bindegewebe, ohne die Sklera zu beschädigen, auf der Silikonunterlage zu fixieren. Verwenden Sie in dieser Position ein Seitenportmesser, um einen Schnitt durch die Sklera durchzuführen. Der Schnitt sollte ein Drittel der Distanz vom Augenäquator zur vorderen Augenfläche entfernt liegen.

Verwenden Sie Iris-Scheren, um den Schnitt kreisförmig um das Auge herum fortzusetzen, um Schäden am retinalen Pigmentepithel (RPE) durch die Anziehung des Glaskörpers auf die Retina zu vermeiden. Verwenden Sie dieselbe Schere, um durch den Glaskörper zu schneiden und die vordere Augenklappe vom Augenbecher zu trennen.

Heben Sie den vorderen Teil des IOA an und entsorgen Sie ihn. Verwenden Sie eine Pinzette, um das geöffnete Auge in die Vertiefung der Dys. zu überführen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Auge befinden.Cup.

30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Übertragen Sie das Auge aus der Petrischale zurück in die Präparierschale, die mit frischer Raumtemperatur einge X-H-B-S-S gefüllt wurde. Positionieren Sie das Auge mit der Mulde nach oben und fixieren Sie es mit zwei Nadeln der Größe 27.

Verwenden Sie unter dem Stereomikroskop feine Pinzetten, um die teilweise gelöste Netzhaut vorsichtig mit Netzhautschere anzuheben. Schneiden Sie die Netzhaut vom Sehnerv ab. Entsorgen Sie die Netzhaut mit der Irischere.

Schneiden Sie vom Augenrand bis zum Sehnerv einen Einschnitt. Fixieren Sie das Auge mit fünf Nadeln der Größe 27 Gauge. Um die Pigmentepithelschicht zu dehnen, führen Sie mit einer retinalen Schere einen kreisförmigen Schnitt um den Sehnerv herum durch.

Trennen Sie die RPE-Schicht, indem Sie auf eine Vergrößerung von 250x oder mehr umstellen. Suchen Sie die Kante des RPE-Blattes entlang des Schnitts, der mit der Iris-Schere nahe am Sehnerv gemacht wurde. Verwenden Sie zwei Paar Pinzetten, um die RPE- und Bruch-Membran von der choroidalen Gewebeschicht zu lösen.

Probieren Sie mehrere Stellen entlang der Schnittkante aus, um die Stelle zu finden, an der die Verbindung zwischen dem retinalen Pigmentepithel (RPE) und der Aderhaut am schwächsten ist. Lösen Sie die Membran vorsichtig ab, um sie vollständig zu entfernen. Geben Sie die RPE-Blätter in ein 15-Milliliter-Konischglas, das mit Raumtemperatur-Trips in EDTA gefüllt ist.

Wenn alle Scheiben gesammelt sind, verschließen Sie das Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig, um das retinale Pigmentepithel in kleine Zellhaufen zu zerlegen. Keine dunklen Zellklumpen bedeuten, dass die Trennung abgeschlossen ist.

Bringen Sie das Röhrchen für weitere fünf Minuten in das Wasserbad zurück. Entfernen Sie mithilfe eines Pasteurspipetten und sanften Saugens alle unverdauten Gewebestücke. Zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 280 ×g.

Entfernen Sie den Überstand. Füllen Sie das Endvolumen mit 15 % RPE-Medium auf neun Milliliter auf und pipettieren Sie, um den Pellet aufzususpenderen. Pipettieren Sie drei Milliliter der Zellsuspension in einen 25 cm²-Flaschenkolben.

Geben Sie zwei Milliliter frisches, auf Raumtemperatur abgekühltes Kulturmedium mit 15 % RPE hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Während die Kulturen reifen, nimmt ihre Pigmentierung nach drei bis vier Wochen zu.

Erfolgreiche Kulturen sind konfluent und gleichmäßig intensiv pigmentiert. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man humane primäre Netzhautepithel-Kulturen aus fetalem Gewebe herstellt. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.