Primer-Free Aptamer Selection mit einem zufälligen DNA-Bibliothek

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Abers aus einer zufälligen Bibliothek zu identifizieren, die spezifisch an ein Zielprotein – in diesem Fall das S 100 B Protein – binden. Dies wird erreicht, indem die Bibliothek zunächst mit einem Restriktionsendonuklease verdaut wird, um zufällige Sequenzen aus den flankierenden festen Primersequenzen freizusetzen. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die zufälligen Bibliothekssequenzen an gereinigtes S 100 B Protein zu binden und sie anschließend zurückzugewinnen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, gebundene Sequenzen durch Hybridisierung und Ligierung mit festgelegten Primersequenzen wieder zusammenzuführen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Transkription der ligierten Produkte, um eine erneute R-T-P-C-R-Amplifikation des gebundenen Pools von Kandidaten-Abers zu ermöglichen, gefolgt von weiteren Runden dieses Selektionsverfahrens. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine spezifische Bindung der ausgewählten Abers an das S 100 B Protein zeigen.

Beispielsweise werden hier Sandwich-Bindungsassays unter Verwendung von Mikroarrays durchgeführt, und fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper-Assays werden ebenfalls unter Verwendung funktionalisierter Nanodrähte und an 15 Nanometer große Goldnanopartikel gekoppelter Sekundärantikörper durchgeführt. Heute zeigen wir eine Methode zur Auswahl optimaler Bindungen, die an das S-hundert-B-Protein aus einer zufälligen Bibliothek von D-Sequenzen binden. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Entwicklung einer Sensorplattform für die Früherkennung von Krebs.

Beginnen wir also. Um dieses Verfahren zu starten, erzeugen Sie eine primerfreie oder PF-DNA-Bibliothek, wie zuvor beschrieben. Die Spaltung der doppelsträngigen DNA-Bibliothek, gefolgt von der Gelelektrophorese-Reinigung mittels eines 10%igen denaturierenden Polyacrylamidgels, ergibt ein 32 Nukleotide langes Fragment mit Fünf-Phosphat an der 30-cc-Seite und ein 30 Nukleotide langes Fragment mit Fünf-Phosphat an der 30-Seite, die als 32-plus- und 30-plus-Fragment bezeichnet werden.

Das 32-plus-Fragment enthält die 30 Nukleotide lange zufällige Domäne mit der minimalen flankierenden CC-Sequenz am drei-prim-Ende, während das 30-plus-Fragment ausschließlich aus der 30-Nukleotide-langen Sequenz der zufälligen Domäne besteht. Um die DNA-Fragmente der PF-Bibliothek für die APTER-Selektion vorzubereiten, resuspendieren Sie jedes der 32-plus- und 30-plus-Fragmente in 40 Mikroliter 20 Milli-Tris, HCl, pH 7,4. Anschließend erhitzen Sie die Proben drei Minuten lang auf 85 Grad Celsius nach der Inkubation.

Kühlen Sie die Proben drei Minuten lang in einem Wasserbadinkubator bei 37 Grad Celsius ab, anschließend mit 760 Mikrolitern Selektionspuffer versetzen und drei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach drei Minuten die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Nach der Inkubation die Lösung durch eine Säule leiten, die mit Nickel-NTA-Agarosekügelchen vorgewaschen wurde, und zwar mit Selektionspuffer.

Um nichtspezifische DNA zu entfernen, sammeln Sie die DNA-Fragmente der PF-Bibliothek, die nicht an die Säule binden, und stellen Sie diese für einen späteren Zeitpunkt beiseite. Um die an S 100 B gebundenen Kügelchen vorzubereiten, zentrifugieren Sie zunächst 400 Mikroliter Nickel-NDA-Kügelchen für drei Sekunden in einer Mikrozentrifuge und verwerfen Sie den Überstand. Anschließend waschen Sie die Kügelchen mit 400 Mikrolitern Bindungspuffer, indem Sie diesen vorsichtig fünfmal auf- und abpipettieren.

Dann zentrifugieren Sie die Kügelchen und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie dies. Waschen Sie zweimal.

Im Anschluss das zuvor gereinigte, histidinmarkierte Protein über die Kügelchen geben. Hier wird menschliches S100-Calcium-Bindungsprotein B verwendet; die Lösung vorsichtig fünfmal auf- und abpipettieren, alle drei Minuten, insgesamt 15 Minuten lang.

Nach 15 Minuten die Perlen zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Zum Schluss die an die Perlen gebundene S 100 B mit 400 Mikrolitern Selektionspuffer waschen, indem man sanft dreimal auf- und abpipettiert. Erneut die Perlen abzentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, sodass insgesamt drei endgültige Waschungen erfolgen, um für an S 100 B gebundene Antikörper zu selektieren. Geben Sie die zuvor beiseitegelegten 32-plus- und 30-plus-Fragmente zurück. Fügen Sie die Fragmente den an die Perlen gebundenen S 100 B hinzu. Inkubieren Sie dann die Probe 15 Minuten lang.

Mischen Sie alle drei Minuten, indem Sie nach 15 Minuten vorsichtig auf- und abpipettieren, drehen Sie die Perlen kurz ab, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie den S 100 BDNA-Komplex anschließend mit 800 µL Selektionspuffer durch vorsichtiges Pipettieren. Zentrifugieren Sie dann die Perlen und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.

Um das S 100 zu gewinnen, werden 200 Mikroliter einer 20 Millimolar Tris, HCl pH 7,4-Lösung zu den Kügelchen gegeben. Anschließend wird die Suspension drei Minuten bei 85 Grad Celsius erhitzt. Danach erfolgt die Inkubation.

Vortexen Sie die Kügelchen eine Minute lang und zentrifugieren Sie sie anschließend. Überführen Sie dann den Überstand in ein frisches Gefäß. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal und vereinigen Sie die Überstände.

Reinigen Sie abschließend die ausgewählten DNA-Fragmente. Extrahieren Sie die PCR-Produkte zweimal mit einem äquivalenten Volumen Phenol-Chloroform, Isopropanol. Fällen Sie sie mit 250 Millimolar Natriumchlorid und dem 2,5-fachen Volumen von 100 % Ethanol bei minus 70 Grad Celsius für 15 Minuten.

Zentrifugieren bei 21.000 ×g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Anschließend den Überstand verwerfen. Den Pellet effizient mit 75 % Ethanol spülen.

Zentrifugieren bei 21.000 × g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten und den Überstand verwerfen. Den Pellet drei Minuten im Schnelldampfer trocknen. Nach 10 Selektionsrunden die resultierenden PCR-amplifizierten DNA-Fragmente in den PCR 2.1-TOPO-Vektor, der von einem Virogen-Kern stammt, klonen.

Sequenzieren Sie anschließend zwischen 40 und 50 einzelne Kolonien für jedes der ausgewählten N 30 cc- und N 30-Fragmente mit dem M 13-Vorwärtsprimer. Alignieren Sie die ausgewählten Sequenzen mithilfe der Infomax-Vector-NTI-Software. Bestimmen Sie anschließend die Konsenssequenzen basierend auf den Alignments.

Nachdem Konsenssequenzen identifiziert wurden, erwerben Sie die entsprechenden Konsens-Aptamere gemäß der schriftlichen Anleitung. Suspendieren Sie das erste Aptamer, das mit einer Amin-C-sechs-Modifikation am 5'-Ende synthetisiert wurde, in Druckpuffer, um eine Endkonzentration von 15 Mikromolar zu erreichen. Geben Sie anschließend die Aptamerlösung mittels eines Microgrid-Arrays von Apogen Discoveries auf CodeLink-aktivierten Objektträgern auf.

Befolgen Sie den Code-Link mit empfohlenen Protokollen. Drucken Sie jeden Objektträger mit 12 Arrays. Verwenden Sie ein Zwei-mal-acht-Format.

Hybridisierungs-Kassette für Microarray-Hybridisierung. Verdünnen Sie das S100B-Protein auf die geeignete Konzentration in 70 Mikroliter PBS. Anschließend die Lösung auf die Vertiefungen der Microarray-Kassette auftragen.

Versiegeln Sie die Microarray-Kassette mit nukleasefreier Klebefolie, um Verdunstung zu verhindern. Lassen Sie das Protein an die auf dem Code-Link aufgebrachten Abers binden. Schwenken Sie eine Stunde bei Raumtemperatur nach individueller Inkubation.

Waschen Sie die Vertiefungen der Kassette dreimal mit PBS, fünf Millimolar Magnesiumchlorid oder PBSM. Verdünnen Sie danach den fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper auf 0,125 Mikromolar in 70 Mikrolitern PBSM. Erhitzen Sie das Gemisch drei Minuten lang auf 85 Grad Celsius.

Anschießend lassen Sie die markierten ABERS auf Eis abkühlen. Tragen Sie die ABERS drei Minuten lang auf die Vertiefungen der Microarray-Kassette auf. Versiegeln Sie die Kassette erneut mit der Klebefolie und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur.

Erneut einzeln. Waschen Sie die Vertiefungen nach dem Waschschritt dreimal mit PBSM. Demontieren Sie die Kassette und spülen Sie den gesamten Objektträger mit PBSM ab.

Anschließend die Probe vollständig durch Zentrifugation trocknen. Abschließend den Objektträger mit einem Packard Biosciences ScanArray 4000 XL scannen. Die Bindung wurde für γ-P³²-A-TP-fünf-Ende-markierte Aptamere an das S100B-Protein bestimmt und zur Ermittlung der KD gegen die Konzentration aufgetragen.

Repräsentative K_D-Werte nach etwa sieben Selektionsrunden liegen typischerweise im Bereich von 10⁻⁷ mol/L. Fünf Fühler-DNA-Aptamere wurden an CodeLink-Microarrays gekoppelt; gereinigtes S100B-Protein wurde an das erste Optimer gebunden, und ein mit LOR5 46 markiertes zweites Optimer wurde an die S100B-Komplexe gebunden.

Die Fluoreszenz wurde mithilfe eines Scan-Array-Scanners quantifiziert. Die mittlere Reihe zeigt Sandwich-Bindung mit charakteristischer additiver Bindung in KD-Assays in den darüber- und darunterliegenden Reihen. Es liegt keine Sandwich-Bindung für abers fünf-Prime-Thiol-derivatisiertes erstes abers vor, das unter Verwendung der Standard-Thiol-Chemie an Goldnanodrähte gekoppelt wurde.

Die zweiten APTAMERE wurden auf dieselbe Weise an 50 NMO oder Gold-NPs gekoppelt. Anschließend wurde das gereinigte S-100-B-Protein zuerst an die derivatisierten Nanodrähte gebunden, woraufhin zweite APTAMERE mit 50 Nanomolar Gold-MPs an die ersten APTAMER-Nanodraht-S-100-B-Komplexe gebunden wurden. Die gebundenen Sandwich-Komplexe wurden mittels F-FE-REM hier visualisiert.

Als Negativkontrolle kann ein Bindungsassay mit dem HTRA1-Protein anstelle des S100B-Proteins dienen. Eines der wichtigsten Merkmale des Verfahrens ist der primerfreie Ansatz, bei dem keine festen Sequenzen verwendet werden, die aufgrund der Sequenzen selbst – durch Überragung der zufälligen Region – falsch positive und falsch negative Ergebnisse verursachen könnten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass die DNA-Vorlage vor jeder reversen Transkription zerstört wird, und darauf zu achten, das spezifische RT-PCR-Produkt nach jeder erneuten Amplifikation zu isolieren.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.