Visualisierung und Quantifizierung der intrazellulären Wechselwirkungen von Neisseria meningitidis And Human α-Actinin durch konfokale Imaging

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Ausmaß der Kolokalisation internalisierter Bakterien, RIA Meningitidis, mit dem zytoskelettalen Protein Alpha-Aktinin zu bewerten. Dies wird erreicht, indem kultivierte humane mikrovaskuläre Hirnzellen mit einer Übernachtkultur von Bakterien für drei bis acht Stunden infiziert werden, um den Bakterien den Eintritt in die Zielzellen zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt werden Zellen mit intrazellulären Bakterien gewaschen, fixiert und anschließend permeabilisiert, um die infizierte Kultur für die Immunfärbung der internalisierten Bakterien und des intrazellulären Alpha-Aktinins vorzubereiten.

Nach der konfokalen Bildgebung und Anwendung von Kollokalisations-Software können Bilder der intrazellulären Kollokalisation beobachtet werden, und es werden quantifizierte Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass Meninga Croci exprimierende OPCs sowie Membranproteine spezifisch mit intrazellulärem Alpha-Aktinin interagieren können, basierend auf der visuellen Beurteilung mittels konfokaler Mikroskopie und quantitativer Kollokalisationsanalyse. Hallo, ich bin Isel Maria aus dem Labor von Professor Mata TI am Department für Zelluläre und Molekulare Medizin der University of Bri. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Abschätzung des Kollokalisationsverhältnisses von intrazellulären Bakterien mit zytoskelettalen Proteinen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um eine Interaktion von Myzelmeningitis, die das automembranäre Protein OPC exprimiert, mit dem zytoskelettalen Protein Alpha-Aktin zu untersuchen. Beginnen wir also. Diese Arbeit muss in einem geeigneten Sicherheitslabor durchgeführt werden.

Zwei Tage vor dem Immunfärbungsverfahren impfen Sie den gewünschten Bakterienstamm auf Brain-Heart-Infusion-Agarplatten, die mit 10 % erhitztem Pferdeblut ergänzt sind. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid am Tag vor der Immunfärbung. Verwenden Sie eine 10-µL-Kulturöse, um eine Suspension der über Nacht gezüchteten Bakterienkultur herzustellen.

In zwei Millilitern PBSB die Suspension fünf Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, damit sich große bakterielle Aggregate absetzen können. Danach den oberen Milliliter der Suspension in ein steriles Gefäß überführen, ohne den Pellet zu stören, um die Bakterien zu lösen, indem man einem Milliliter 1 % SDS und 0,1 molare Natriumhydroxidlösung zu zwei Gefäßen mit jeweils 20 Mikrolitern bakterieller Suspension hinzufügt und das Gefäß umstülpt, um zu mischen. Zur Schätzung der Bakterienanzahl.

Messen Sie den Nukleinsäuregehalt, indem Sie die Absorption der Lösung bestimmen. Stellen Sie bei 216 Anters die bakterielle Suspension auf die erforderliche Dichte im Infektionsmedium ein, um humane mikrovaskuläre endotheliale Hirnzellen zu infizieren. Humane mikrovaskuläre endotheliale Hirnzellen oder H-B-M-E-C-A, zwei Tage vor der Immunfärbung ausgesät, wurden auf 16 Millimeter großen Glasdeckgläsern platziert, die in die Vertiefungen einer 12-Loch-Platte gegeben wurden, und die HBME-Zellen mit 50 % Konfluenz auf den Deckgläsern ausgesät; über Nacht bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Am folgenden Tag.

Infizieren Sie die Zellen mit der frisch hergestellten bakteriellen Suspension in unserem Labor. Üblicherweise wird ein Infektionsverhältnis von 200 bis 300 koloniebildenden Einheiten pro Zielzelle verwendet. Inkubieren Sie drei bis acht Stunden bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid am Ende der Infektionsphase.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und fixieren Sie sie mit 500 µL 2 % Paraformaldehyd für 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abwaschen des Paraformaldehyds permeabilisieren Sie die paraformaldehyd-fixierten Zellen durch Inkubation in 0,1 % Triton X-100, verdünnt in PBS, für 10 Minuten. Waschen Sie die Proben abschließend dreimal mit PBS und fahren Sie wie gezeigt mit der Immunfärbung fort. Die anschließende Färbung für intrazelluläre Bakterien und Dfor-Aktinin kann gleichzeitig durchgeführt werden.

In 12-Loch-Platten blocken Sie die Deckgläser mit den permeabilisierten Zellen mit 500 µL 3 % BSA in PBS-T für 30 bis 60 Minuten. Nach dem Waschen mit PBS übertragen Sie jedes Deckglas bei Raumtemperatur in ein neues trockenes Loch der 12-Loch-Platte und geben gleichzeitig die primären Antikörper gegen Bakterien und Alpha-Aktinin hinzu; 80 bis 100 µL Antikörper pro Deckglas sind ausreichend, wenn sie vorsichtig so hinzugefügt werden, dass die Oberfläche des Deckglases bedeckt ist. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation fügen Sie 200 µL PBS zum Loch hinzu, heben das Deckglas an und legen es in ein neues Loch mit 500 µL PBS. Nach fünf Minuten entfernen Sie das PBS mittels Pipette und fügen frisches PBS hinzu. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal und übertragen Sie die Deckgläser anschließend in ein neues trockenes Loch.

Fügen Sie anschließend die geeigneten sekundären Antikörper, die mit verschiedenen Fluorochromen konjugiert sind und in 1 % B-S-A-P-B-S-T verdünnt wurden, hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Am Ende der Inkubation waschen Sie, wie zuvor gezeigt. Danach färben Sie die DNA mit DPI fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln nach. Am Ende dieser Inkubation waschen Sie die Deckgläser einmal in PBS und montieren sie mit einem Tropfen Eindeckmedium. Die eingebetteten Deckgläser sollten im Dunkeln aufbewahrt werden, bis sie zur Beobachtung bereitstehen. Unter dem Mikroskop beobachten und erfassen wir die Bilder unserer immunmarkierten Proben mithilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, das an ein invertiertes Epi-Fluoreszenzmikroskop angeschlossen ist.

Um das CLSM-Verfahren zu beginnen, geben Sie einen Tropfen Immersionsmedium auf das Objektiv und platzieren Sie die Objektträgerabdeckung. Setzen Sie sie vorsichtig auf den Mikroskoptisch auf, stellen Sie das Mikroskop auf den visuellen Modus ein und suchen Sie mithilfe der Mikroskopokulare den interessierenden Bereich. Nun sind wir bereit, die Leica-Software zu verwenden. Wählen Sie den XY-Z-Aufnahmemodus. Wählen Sie das Format 5 × 12 durch 5 × 12 für Kolokalisationsstudien.

Je höher die Auflösung, desto genauer ist das Bild. Wählen Sie anschließend den bidirektionalen X-Modus aus, wodurch die Abtastgeschwindigkeit erhöht und die Photobleiche reduziert wird. Richten Sie die sequenziellen Abtasteinstellungen ein.

Klicken Sie in die SEC-Funktion und wählen Sie dann zwischen den Linien. Wählen Sie Laserstrahlen entsprechend den mit den sekundären Antikörpern konjugierten Fluorochromen aus: 405 Nanometer für DAPI, 488 Nanometer für Alexa Fluor 488 und 561 Nanometer.

Aktivieren Sie für Trixy nacheinander die Photomultiplierröhre eins, zwei und drei. Richten Sie die obere und untere Grenze des Z-Stapels oder der Serie ein. Stellen Sie anschließend die Z-Schrittweite auf 0,2 Mikrometer ein.

RIA Mencius ist ein Diplokokkus, und da jeder Kaukus einen ungefähren Durchmesser von 0,5 Mikrometern aufweist, erhöht eine Z-Schrittgröße von 0,2 Mikrometern die Wahrscheinlichkeit, dass jeder Kaukus mindestens zweimal abgetastet wird. Legen Sie die endgültigen Scan-Parameter fest, indem Sie eine Liniendurchschnittsbildung von drei auswählen, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, und klicken Sie auf „Start“. Doppelt oder dreifach gefärbte Bilder werden durch sequenzielles Scannen bei verschiedenen Wellenlängen und durch Verwendung des „zwischen den Linien“-Modus für jeden Kanal gewonnen, um Übersprechen zwischen den verschiedenen Chromophoren zu vermeiden.

Um eine Hinweise auf die Kolokalisation zweier Fluorochrome zu erhalten, wählen Sie die Überlagerungsfunktion aus, um ausgewählte Kanäle zu einem einzigen Bild zusammenzuführen. Wenn beispielsweise Alexa 4 88 und Trissy Fluor Chromes kolokalisiert sind, erscheint im überlagerten Bild eine gelbe Farbe. Für eine 2D-Rekonstruktion, die zur Visualisierung möglicher Kolokalisation erforderlich ist, stellen Sie einen Z-Stack oder eine Serie mithilfe der Maximum-Projektionsfunktion zusammen. Nachdem Sie den Z-Stack oder die Serie aufgenommen haben, verarbeiten Sie Ihre Daten, um ein orthogonales Bild zur Visualisierung der intrazellulären Lokalisation verschiedener Elemente zu erhalten.

Die Quantifizierung der Kolokalisation erfolgt mithilfe der Vol City-Software von IMP provision. Erstellen Sie zunächst eine Bibliothek mit CLSM-Bildern und wählen Sie im oberen Menüband „Extended Focus“ im Bild aus. Dieses Werkzeug kombiniert Z-Achsen-Schnitte in einem 2D-Bild zur Analyse.

Wählen Sie nun das KOLokALISIERUNGS-Werkzeug aus. Die beiden zu analysierenden Kanäle sollten dieselbe Farbtiefe aufweisen. Wählen Sie den Bereich aus, der quantifiziert werden soll.

Stellen Sie die Schwelle so ein, dass jeglicher Hintergrund entfernt wird. Erstellen Sie die Kolokalisationsergebnisse, indem Sie „Kolokalisation generieren“ auswählen. Es werden Kolokalisationsstatistiken für die zuvor ausgewählten Regionen von Interesse generiert.

Als Nächstes wählen Sie die Mander-Koeffizienten R und Ny aus. Schließlich exportieren Sie die statistischen Werte in ein Excel-Dokument zur Datenpräsentation, wie hier anhand repräsentativer konfokaler Abbildungsergebnisse menschlicher Hirnendothelzellen gezeigt, die acht Stunden lang mit Meningokokken infiziert wurden. Der Ort der Bakterien ist rot dargestellt.

Während die Lokalisation von Alpha-Aktinin in grünen Pfeilen dargestellt ist, deuten diese darauf hin, dass in bestimmten Bereichen eine starke Anreicherung von Alpha-Aktinin um Bakterien herum auftritt. In diesem Überlagerungsbild sind mehrere Regionen sichtbar, in denen eine gelb-orange Färbung auftritt, was auf eine Kolokalisation zwischen Meningokokken und Alpha-Aktinin hindeutet. In diesem nächsten Bild zeigt die optische Zerlegung einer infizierten H-B-M-E-C-Monolayer-Kultur eine Kolokalisation um intrazelluläre Bakterien, die sich an der Basis einer Zelle befinden.

Wenn dreidimensionale Bilder infizierter H-B-M-E-C-Monolagen verarbeitet wurden, zeigt eine schräge Ansicht der apikalen Oberfläche ein Durant-Bakterium, das rot angefärbt ist und durch den roten Pfeil markiert ist, wobei mehrere Bakterien in Richtung der basalen Oberflächen der Endothelzellen lokalisiert sind, was durch den gelben Pfeil angezeigt wird. Eine deutlich orange, gelb gefärbte basale Position ist in diesem endon XZ-Querschnitt klarer erkennbar. Im Gegensatz zu Ferne-Aktinin-Experimenten, bei denen die Markierung internalisierter Bakterien sowie von Menton oder Aktin durchgeführt wurde, zeigen sich gelegentliche Kolokalisationen mit Aktin, jedoch seltene Kolokalisationen mit fermentierenden Bakterien in H-B-M-E-C-Zellen.

Wie in den vorherigen Experimenten beobachtet, war Retin um mehrere internalisierte Bakterien herum angereichert, die durch die weißen Pfeile markiert sind. Die Daten wurden außerdem analysiert, um den relativen Überlappungsgrad zu ermitteln. Der Koeffizient R, der gemäß Manda das tatsächliche Ausmaß der Kolokalisation angibt, also die Anzahl der Pixel, die gemeinsam lokalisiert sind, im Vergleich zur Gesamtanzahl der Pixel, ergab NY-Werte für Alpha-Aktinin, Menting und Aktin insgesamt in H-B-M-E-C, die mit OPC-exprimierenden Meningokokken infiziert waren; dabei wurde ein Überlapp von mehr als 25 % von Retin mit Meningokokken festgestellt.

Der Koeffizient und Y ist ein Maß für die Häufigkeit einer Währung des häufigeren Reinsignals, jedes Mal, wenn das seltener vorkommende Meninga-Cocoa-Signal auftritt. Dieses Maß zeigt ein auffälliges Vorkommen von Alpha-Aktinin in der Nähe internalisierter Meninga-Cockeye-Signale an. Wir zeigen Ihnen lediglich, wie man die Einführung internalisierter Bakterien mit Zytoskelettelementen innerhalb dieses Experiments sichtbar macht und quantifiziert.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Fixier- und Immunfärbungsprotokolle streng einzuhalten, um die Integrität der Strukturen zu bewahren und einen hohen Hintergrund zu vermeiden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.