Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Die Expression fluoreszierender Reporter in transgenen Tieren ermöglicht es, zelluläre Reaktionen auf experimentelle Manipulationen in lebenden Krankheitsmodellen zu verfolgen. Hier wird ein selektiver Zellverlust pharmakologisch in Zebrafischen induziert, wobei hochauflösende mehrfarbige konfokale Aufnahmen der gezielten Zellen und ihrer unmittelbaren Nachbarn vor, unmittelbar nach und in zeitlichem Abstand nach der Behandlung mit dem Wirkstoff angefertigt werden. Die Bildanalyse zeigt die Aktivierung endogener Stammzellpopulationen und die anschließende Ersetzung der betroffenen Zellen während der Regenerationsphase auf.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Regenerationsbiologie zu beantworten, beispielsweise: Welche zellulären und molekularen Mechanismen werden zur Regeneration spezifischer Zelltypen genutzt? Beginnen Sie damit, transgene Eier, die aus Kreuzungen gewonnen wurden, in eine Petrischale mit 0,3 x Danio-Lösung zu überführen, 16 Stunden nach der Befruchtung. Fügen Sie PTU hinzu, um die Tyrosin-ACE-Aktivität zu hemmen, bevor irgendwelche Anzeichen von Pigmentierung im betreffenden Gewebe sichtbar werden. Falls das Embryo nicht albino ist, inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 Grad Celsius.

Sobald Reporter sichtbar sind, stellen Sie die Petrischale unter ein fluoreszierendes Stereozoommikroskop und sortieren Sie nach gewünschter Transgenexpression. Vor der Bildaufnahme bereiten Sie eine 0,5 %ige Low-Melt-Agarose-Einbettungslösung in Embryomedium vor und lagern Sie diese bei 40 Grad Celsius.

Fügen Sie Trica und PTU gegebenenfalls hinzu. Vorsichtig mischen und auf 40 Grad Celsius zurückbringen. Betäuben Sie die Fische, indem Sie sie in Embryomedium mit Trica geben.

Etwa drei Minuten lang wird der Fisch nicht ansprechbar sein. Berühren Sie den Fisch mit einer Mikropipette und saugen Sie einzelne Fische in eine gekürzte Pipettenspitze mit einem Volumen von etwa 30 Mikrolitern Anästhetikumlösung. Danach drehen Sie die Pipette um und lassen Sie den Fisch auf den Boden absinken.

Berühren Sie die Spitze mit der Montagelösung und lassen Sie die Proben durch Schwerkraft übergehen. Achten Sie darauf, das Agar nicht zu verdünnen, damit es wiederverwendet werden kann. Entsorgen Sie die restliche Anästhetiklösung aus der Mikropipette.

Überführen Sie den Fisch anschließend mit derselben Pipettenspitze in eine Petrischale. Orientieren Sie den Fisch in etwa 30 Mikrolitern Einbettlösung vorsichtig so, dass der interessierende Bereich in der Mitte des Aeros-Tropfens liegt. Achten Sie darauf, dass der Fisch in der gewünschten Orientierung verbleibt, bis das Aeros erstarrt ist.

Mehrere Fische können bei Bedarf in einer einzigen Petrischale montiert werden. Nachdem das Agar erstarrt ist, transportieren Sie die Fische auf die Objektbühne des konfokalen Mikroskops und geben Sie vorsichtig Embryomedium mit Trica mit oder ohne PTU in die Schale, bis die Fische vollständig bedeckt sind. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware und fokussieren Sie den Bereich von Interesse, um eine optimale Abbildung zellulärer und/oder molekularer Details zu erzielen.

Verwenden Sie Objektive mit großer Arbeitsdistanz und hohen numerischen Aperturen in der Software. Wählen Sie die geeigneten Flora-Viersche aus der Wahlliste aus. Klicken Sie auf „Spektraleinstellung“ und nehmen Sie Anpassungen an den Emissionsbereichen vor.

Um eine saubere Trennung der Reporter-Signale zu erzielen und die Signal-Rausch-Verhältnisse zu maximieren, wählen Sie das geeignete Objektiv im Dropdown-Menü aus, um sicherzustellen, dass alle softwaredefinierten Voreinstellungen korrekt angepasst werden. Um die Laser zu fokussieren und die Leistungsstufen einzustellen, wählen Sie eine Ausgabe aus der Nachschlagetabelle, die die Pixel-Sättigung für jeden Kanal anzeigt.

Als Nächstes stellen Sie die Detektor­empfindlichkeit ein, um die gewünschte Bildqualität zu erzielen, und erhöhen schrittweise die Laserleistung, bis die Bildintensität akzeptabel ist. Vermeiden Sie eine Sättigung der Pixel im interessierenden Bereich und halten Sie die Laserintensität so niedrig wie möglich, um Probleme durch Photobleichen und Phototoxizität zu verringern.

Stellen Sie sicher, dass jede Laserlinie nur im entsprechenden Kanal ein nachweisbares Signal erzeugt, indem Sie die Laser manuell ein- und ausschalten und dabei alle Bildgebungskanäle überwachen. Falls keine Übersprecher erkennbar sind, können alle Kanäle gleichzeitig aufgenommen werden. Schließen Sie als Nächstes den interessierenden Bereich mit Hilfe der Zoom- und Drehfunktionen ein.

Danach die Abtastgeschwindigkeit und Bildgröße einstellen; schnellere Abtastgeschwindigkeiten minimieren die Laser-Belichtungszeit und erhöhen die zeitliche Auflösung. Die Schrittweite in Z-Richtung gemäß den experimentellen Anforderungen festlegen. Hier wird eine Schrittweite von 10 Mikrometern verwendet, um sieben optische Schnitte von Netzhautgewebe abzubilden.

Nachdem die geeigneten Einstellungen festgelegt wurden, erfassen Sie die Zack-Bilder und speichern Sie sie. Danach wechseln Sie zum nächsten Fisch. Eine serielle Schnapp-und-Freilass-Aufnahme kann durchgeführt werden, um zelluläre Veränderungen an aufeinanderfolgenden Tagen gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Dokument zu verfolgen.

Bei der Durchführung eines Multireporter-Imaging-Experiments ist es am besten, Fluorophore zu verwenden, deren Spektren gut getrennt sind. Dies ist jedoch nicht immer praktikabel. Hier zeigen wir eine einfache Bild-Subtraktionsmethode unter Verwendung der Open-Source-Software ImageJ, um Fluorophore mit überlappenden Anregungs- und Emissionsprofilen zu trennen. In unserem Fall GFP und YFP.

Die in diesem Video beschriebenen Zeitrafferaufnahmetechniken wurden verwendet, um GFP-markierte retinale Stammzellen während der Ablation und Regeneration retinaler bipolaren Neuronen zu verfolgen. Führen Sie zur spektralen Trennung die Bildaufnahme mithilfe sequenzieller Aufnahmemodi und variabler Sperrfiltereinstellungen durch, wodurch überlappende Fluoreszenzsignale unabhängig und teilweise getrennt erfasst werden können. Sobald die Bilder aufgenommen wurden, verwenden Sie den ImageJ-Loci-Bio-Formas-Import, um die Bilddateien zu öffnen und das Import-Tool zu starten. Ziehen Sie die gewünschte Datei in das ImageJ-Fenster.

Teilen Sie die Kanäle mithilfe des Kontrollkästchens „Kanäle aufteilen“ im Importfenster in einzelne Stapel auf, um das Plugin „Drei TP ausrichten“ zu starten. Klicken Sie auf „Plugins“, dann auf „Stapel ausrichten“. Danach „Drei TP ausrichten“.

Die Stapel müssen ausgerichtet werden, um eine korrekte Subtraktion sicherzustellen. Wählen Sie den Referenzstapel im ersten Dropdown-Feld und den nicht ausgerichteten Stapel im zweiten aus. Aktivieren Sie die Optionen „Verwende XY-relativen Ursprung“ und „Verwende Z-relativen Ursprung“ und klicken Sie auf „OK“.

Um den Ausrichtungsprozess zu starten, klicken Sie auf die Schaltfläche „Volumenregistrierung“. Ein neues Fenster mit den Ausrichtungsparametern wird angezeigt. Klicken Sie auf „Okay“.

Dieser Abschnitt wurde vom Anbieter des Plugins optimiert, sodass keine Änderungen erforderlich sind. Nach Abschluss erscheint ein Fenster mit ausgerichteten Stapeln. Wählen Sie die Ausgabe aus dem ausgerichteten Fenster, um das Ausgabefenster zu öffnen.

Dieses Fenster ist ebenfalls optimiert und benötigt keine Änderungen. Klicken Sie auf „Okay“. Ein neuer Stapel erscheint im Arbeitsbereich, wobei an den Dateititel „aligned“ angehängt wird.

Um Übersprechen mit dem Bildrechner zu entfernen, klicken Sie auf „Prozess“ und dann auf „Bildrechner“. Wählen Sie im Dropdown-Feld „Bild 1“ den Stapel aus, der subtrahiert werden soll, und den Stapel, der für die Subtraktion verwendet wird. Im Dropdown-Feld „Bild 2“ wählen Sie im Dropdown-Feld „Operation“ die Option „Subtrahieren“ und klicken Sie auf „OK“.

Image J fragt, ob der Stack verarbeitet werden soll. Wählen Sie Ja. Ein neuer Stack sollte erscheinen, der die Crosstalk-Effekte zwischen überlappenden Kanälen entfernt hat.

Die Stapel zusammenführen, um die gleiche Bildstruktur vor der Ausrichtung und Subtraktion wiederherzustellen. Durch die Auswahl der zusammengeführten Kanäle im Kanalwerkzeugfenster ermöglicht das Werkzeug die Fusion von bis zu vier Stapeln zu einem Hyperstapel. Abschließend werden die Kanäle eingefärbt, Helligkeit und Kontrast angepasst und die Dateien als TIFFs gespeichert, um den gezielten Verlust und die Regeneration der Nitroreduktase zu untersuchen.

M-Cherry-exprimierende retinale Bipolarzellen. Eine Zeitreihe von konfokalen Bildern wurde an einzelnen Zebrafischen vor der Behandlung aufgenommen. Es zeigt sich eine mosaikartige Expression des membrangebundenen YFP-Reporters in kontrollierten Bipolarzellen, dargestellt in Gelb, und des Nitroreduktase-Cherry-Fusionsproteins in gezielten Bipolarzellen, dargestellt in Rot.

Das membrangebundene CFP-Transgen, dargestellt in Cyan, liefert zusätzliche Kontextinformationen über die meisten anderen Netzhautzellen zur besseren Veranschaulichung. Das gleiche Bild ohne das CFP-Signal ist nach Behandlung mit Metronidazol dargestellt. Die roten, Nitroreduktase-exprimierenden Bipolarzellen gehen verloren, während die gelben, kontrollierten Bipolarzellen erhalten bleiben.

Dies verdeutlicht die äußerst spezifische Natur dieser Ablationsmethodik. Erneut wird das gleiche Bild ohne CFP zur Verdeutlichung gezeigt. Wenn metro NIAZ entfernt wird, kehren die NTR-exprimierenden Zellen an diese Stelle zurück.

Ein Beispiel für die G-F-P-Y-F-P-Subtraktionsmethode ist in dieser Abbildung dargestellt: GFP-markierte Mueller-GL-Zellen sind in Grün dargestellt und YFP-markierte bipolare Zellen in Lila. Die Überlagerung beider ergibt Weiß, um die Subtraktion durchzuführen.

Die GFP- und YFP-Bilder müssen zunächst ausgerichtet werden. Mithilfe des Subtraktionsverfahrens können anschließend die mit YFP markierten bipolaren Zellen aus dem GFP-Bild entfernt werden, wodurch die mit GFP markierten Müller-ggl klar dargestellt und schwächer leuchtende Müller-Zellen detektiert werden können. Die Überlappung zwischen schwach leuchtenden Müller-Zellen, ggl und mit M-cherry markierten bipolaren Zellen, die in Rot dargestellt sind, kann nun überprüft werden.

Die hier gezeigten Daten legen nahe, dass die Ablation bipolarer Zellen mullare Ggl auslöst, um die verlorenen Zellen zu ersetzen. Diese Interpretation steht im Einklang mit jüngsten Studien zur Netzhautregeneration, die Mueller-Ggl als verletzungsinduzierte Vorläuferzellen sowohl bei Säugetieren als auch bei Fischen identifizieren. Mit dieser Technik können Forscher die Mechanismen untersuchen, die die Regeneration spezifischer Zelltypen regulieren, indem sie Stammzellen im Zebrafisch visualisieren.