Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Die Inseltransplantation wurde als mögliche Behandlung für Diabetes vom Typ 1 vorgeschlagen. Zwei wesentliche Einschränkungen verhindern jedoch ihre breite klinische Anwendung. Erstens ist pro Empfänger eine große Anzahl von Inseln erforderlich.

Da Augäpfel von Organspendern stammen, ist die Anzahl möglicher Empfänger stark begrenzt. Eine zweite Transplantation erfordert eine lebenslange Behandlung mit starken Immunsuppressiva, wodurch insbesondere die pädiatrische Bevölkerung einem erhöhten Risiko für Malignome, Infektionen und Nierenversagen ausgesetzt ist. Die Transplantation von Augäpfeln unter die Nierenkapsel der Maus wird durchgeführt, um Strategien zur Verbesserung der klinischen Transplantationsergebnisse zu untersuchen.

Augenbläschen, die von gesunden Spendernäusen isoliert wurden, werden in Gruppen sortiert und für die Transplantation vorbereitet. Anschließend werden die Augenbläschen in den subkapsulären Raum der Niere transplantiert. Bei diabetischen Empfängermäusen wird die Funktion des Augenbläschen-Transplantats durch die Überwachung des Blutzuckerspiegels beurteilt, wobei sich zeigt, dass etwa 250 bis 350 Augenbläschen die normale Glykämie bei einer 20 Gramm schweren Empfängernaus innerhalb von 24 Stunden nach der Transplantation wiederherstellen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend für die Schritte zur Kanülierung. Die Kanülierung des Ductus choledochus und die Übertragung der Ösen in den subkapsulären Raum der Niere sind schwer zu erlernen. Diese Schritte erfordern die Identifizierung von Gewebestrukturen, ruhige Hände und die Anwendung einer Technik, die Gewebeschäden minimiert.

Platzieren Sie eine euthanasierte Maus in Rückenlage auf einem Papiertuch am Dissektionsmikroskop und besprühen Sie den Bauchbereich mit 70 % Ethanol. Öffnen Sie den Bauch mit einer V-förmigen Schnittführung von der Schamgegend zu beiden Vorderbeinen mithilfe einer Schere. Die Maus befindet sich unter dem Dissektionsmikroskop.

Platzieren Sie es mit dem Kopfende in Richtung des Beobachters. Lokalisieren Sie mit einer Hämoclip-Zange den duodenalen Eintritt des Ductus choledochus, also die duodenale Öffnung des Ductus choledochus. Die Hämoclip-Zange sollte so positioniert sein, dass sie bei Zusammendrückung exakt entlang der Grenze zwischen Pankreas und Darm verläuft.

Hier werden zwei Methoden zur Kanülierung des Gallengangs gezeigt: die Methode mit freier Hand und die Methode mit Pinzettenunterstützung. Bei Verwendung der Methode mit freier Hand ziehen Sie die am Duodenum befestigte Hämostaseklemme vom Kopf der Maus in Richtung Schwanz, sodass der Ductus choledochus straff gespannt wird.

Es gibt eine Mündung im Gallengang nahe der Leber, wo die aus der Gallenblase abfließende Galle und Enzyme aus der Leber zusammenkommen. Ziehen Sie vor dem Eintritt in den Darm den Gallengang straff, um das Innere der V-förmigen Stelle freizulegen. Befestigen Sie eine gebogene Nadel mit 27 Gauge an einer Fünf-Milliliter-Spritze, sodass die Nadel direkt durch die Spitze des „V“ gleitet und den unteren Abschnitt des Gangs katheterisiert. Führen Sie die Nadel mehrere Millimeter über das Ende der Schräge hinaus, um einen Rückfluss in Leber und Gallenblase zu verhindern.

Nach erfolgreicher Kanülierung die Bauchspeicheldrüse durch Injektion von zwei Millilitern Liase aus der Spritze perfundieren. Ein Hinweis auf eine optimale Kanülierung ist die Ausdehnung der Bauchspeicheldrüse über den Magen hinweg. Alternativ kann der Ductus choledochus kanüliert werden.

Mithilfe der Pinzetten-Zysten-Methode. Ziehen Sie den mit dem Hämostatikum C am Duodenum geklemmten Teil vom Kopf der Maus in Richtung Schwanz, sodass der Ductus choledochus gespannt wird. Danach perforieren Sie mit einer gebogenen 27-Gauge-Nadel, die an eine 5-Milliliter-Spritze angeschlossen ist, die Faszie unterhalb des Ductus choledochus nahe der Leber.

Verwenden Sie die Nadel, um die Fascia von dem Gang freizulegen, wobei die Nadel weiterhin an Ort und Stelle bleibt. Legen Sie die Hämostaseklemme beiseite und nehmen Sie eine Pinzette zur Hand. Stützen Sie mit einem Arm der geöffneten Pinzette den Gallengang an der Stelle, an der die Nadel die Fascia freigelegt hat, während Sie den Gang und die Pinzette nach vorne ziehen.

Schieben Sie die Nadel unter Verwendung der Pinzette als Anschlag in den Ductus. Ein erfolgreicher Katheterismus zeigt sich durch eine gleichmäßige Ausdehnung des Pankreasbereichs oberhalb des Magens. Sobald die Pankreas perfundiert wurde, entfernen Sie den Hämostat vom Duodenum.

Heben Sie dann mit der Pinzette das Zwölffingerdarm beiseite und verwenden Sie ein zweites Paar Pinzetten, um die Bauchspeicheldrüse vom Darm zu trennen. Ziehen Sie anschließend die Bauchspeicheldrüse von der Oberseite des Magens und der Milz ab. Heben Sie abschließend die Bauchspeicheldrüse aus der Bauchhöhle heraus und durchtrennen Sie sie von den verbleibenden Fasziaverbindungen zum Darm, Magen und Milz.

Geben Sie die Bauchspeicheldrüse in ein 50-Milliliter-Konischgefäß und stellen Sie es auf Eis. Inkubieren Sie die Bauchspeicheldrüse gemäß den Anweisungen im beiliegenden schriftlichen Protokoll bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation fügen Sie 20 Milliliter Medium zu den Röhrchen hinzu und dissoziieren das Gewebe, indem Sie die Röhrchen innerhalb von 10 Sekunden kräftig 40-mal schütteln.

Dieser Schritt ist entscheidend für eine optimale Gewinnung der Violettzellen. Zellen bei 800 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 15 Milliliter Medium und konzentrieren Sie die Proben.

Geben Sie die resuspendierte Suspension durch ein Drahtsieb mit 0,419 Millimeter Maschenweite und leiten Sie sie in ein frisches kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie das erste Röhrchen mit weiteren 10 Millilitern Medium, das 10 % fetalen Rinderserum enthält, und geben Sie es durch das Drahtsieb. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern his-opaque 10 77 bei Raumtemperatur. Vortexen Sie vorsichtig für mehrere Sekunden, geben Sie weitere fünf Milliliter his-opaque entlang der Innenwand des Röhrchens hinzu, um die Zellen von der Wand abzuwaschen, und pipettieren Sie langsam 10 Milliliter serumfreies RPMI an der Röhrchenwand entlang mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro 10 Sekunden darüber.

Eine scharfe Grenzfläche sollte erkennbar sein. Anschließend die Proben in einem Schwenkköpfe-Zentrifugen bei 20 Grad Celsius und 900 × g für 20 Minuten zentrifugieren, wobei eine sehr langsame Beschleunigung und kein Bremsen nach der Zentrifugation erfolgen darf. Die Inseln werden dann mithilfe einer Einweg-Pipette mit 10 Milliliter Volumen von den exokrinen Zellen getrennt. Überführen Sie die Inseln von der Grenzfläche des Histo-Paque-Mediums in ein frisches 50-Milliliter-Konischgefäß.

Mehrere Röhrchen können an dieser Stelle gepoolt werden, um den Rest der Augenlöcher zu entfernen. Füllen Sie die trüben Röhrchen mit Serum enthaltendem Medium auf und pelletieren Sie die Inseln durch Zentrifugation der Röhrchen zwei Minuten bei 800 Umdrehungen pro Minute. Suspendieren Sie die Inseln anschließend erneut in frischem Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens zwei Mal.

Suspendieren Sie das Pallet in fünf Millilitern Medium. Legen Sie einen 0,1-Millimeter-Nylon-Zellfilter umgedreht auf ein 15-Milliliter-Konischglas. Pipettieren Sie die resuspendierte Zellsuspension hindurch, um die Ösen zu sammeln.

Anschließend spülen Sie den 50-Milliliter-Probengefäß mit zusätzlichen sechs Millilitern Medium und lassen es durch das Sieb laufen. Geben Sie einen Tropfen Medium von drei Millilitern in eine 10-Zentimeter-Petri-Schale. Drehen Sie das Zellfilter um und tauchen Sie es in den Tropfen Medium, um die Ösen aufzunehmen; pipettieren Sie zusätzliche fünf bis sieben Milliliter Kulturmedium durch das Sieb in die Petri-Schale.

Um alle verbleibenden Augenlöcher aus dem Sieb unter einem Vierfach-Objektiv zu sammeln, heben Sie die Augenlöcher einzeln mit einer P-200-Pipette auf und überführen sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Bilder zeigen Augenlöcher, die aus zwölf Wochen alten C57BL/6-Mäusen isoliert wurden. Die Reinheit und Qualität der Augenlöcher kann mikroskopisch nach Abschluss des Isolationsverfahrens beurteilt werden.

Beispielsweise zeigen die hier dargestellten beiden Bilder ein repräsentatives Feld, auf dem Verunreinigungen durch Zelltrümmer und exokrine Zellen vorhanden sind. Vermeiden Sie beim Auswählen von Inseln für ein Experiment, kontaminierte exokrine Zellen oder Inseln mit krankhaften Erscheinungsbildern zu wählen. Inseln mit nekrotischen Zentren sind krankhaft, wie in dieser Abbildung 24 Stunden nach der Isolierung gezeigt; nekrotische Zentren sind unmittelbar nach der Isolierung nicht sichtbar.

Ösen, die abgestoßene Zellen enthalten, sind unvermeidlich und können in dieser 24-Stunden-Zeitrafferaufnahme von Ösen für die Transplantation von Ösen verwendet werden. Unmittelbar nach der Isolierung bilden sich in vielen der Ösen nekrotische Zentren aus. Diese nekrotischen Zentren scheinen am Ende der Aufnahme während des Auswählens der Ösen aus der Ose ausgestoßen zu werden.

Gruppieren Sie sie so, dass jede Probe eine gleichmäßige Verteilung hinsichtlich der Qualität und Größe der Augenlets aufweist. Jede Gruppe von 15 Augenlets könnte beispielsweise vier großformatige, sechs mittelgroße und fünf kleine Augenlets enthalten. Stellen Sie die Probe auf Eis; die Augenlets können sofort für die Transplantation verwendet oder weiter bearbeitet werden.

Vor Gebrauch. Setzen Sie eine sterile Gelauftragspipettenspitze in die Öffnung eines 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens ein, sodass eine sanfte Biegung entsteht, die das schmale Ende der Spitze zu einer U-Form formt. Beide Öffnungen der Spitze sollten direkt nach oben aus dem Mikrozentrifugenröhrchen herauszeigen.

Entnehmen Sie vorsichtig ein Gefäß mit Ösen vom Eis. Stellen Sie sicher, dass sich alle Ösen am Boden des Gefäßes abgesetzt haben. Sammeln Sie mit einer P-200-Pipette vorsichtig die Ösen in einem minimalen Volumen vom Boden des Gefäßes auf und überführen Sie sie auf die vorbereitete gebogenen Spitze.

Nachdem die Augenlets sedimentiert sind, entfernen Sie so viel wie möglich vom Medium an der Spitze, indem Sie das Medium durch die große Öffnung der Augenlets tragenden Gel-Ladepipettenspitze mit einer frischen Gel-Ladepipettenspitze, die an eine P-200-Pipette angebracht ist, abpipettieren. Befestigen Sie das nicht abgeschrägte Ende des Schlauchs an der schmalen Öffnung der Inselzellen tragenden Gel-Ladepipettenspitze. Bringen Sie dann die Spitze an einer P-200-Pipette an und drücken Sie die Inselzellen vorsichtig in den Schlauch.

Als Nächstes verbinden Sie die nicht abgeschrägte Kante des PE 50-Schlauchs mit der Nadel einer 25-Mikroliter-Hamilton-Spritze. Ziehen Sie den Kolben zurück, bis die Augen etwa 0,5 Zentimeter von der abgeschrägten Öffnung entfernt sind. Stellen Sie die Spritze beiseite, damit sich die Augen nahe der abgeschrägten Öffnung des Schlauchs zu einer einzigen Masse sammeln können, während die Niere auf die Aufnahme der Augen vorbereitet wird.

Bereiten Sie die chirurgische Operationsstelle vor, indem Sie das Haar abschneiden und die Haut dreimal abwechselnd mit Betadine und 70 % Isopropylalkohol reinigen. Beginnen Sie die Eyelet-Transplantationsprozedur, indem Sie eine Zehenquetschung durchführen, um die Anästhesie bei der Empfängermaus zu überprüfen. Legen Sie den Schaft eines Glasstabes direkt unter die Maus und unterhalb der Niere senkrecht zum Rückenmark.

Danach die Niere durch die Haut lokalisieren und ein steriles chirurgisches Tuch platzieren. Sobald die Niere lokalisiert ist, mit einer McFerson-Banis-Schere einen zwei Zentimeter langen Schnitt durch die Dermis direkt darüber senkrecht zum Rückenmark vornehmen. Dieser Schnitt legt die Bauchfellwand mit der Schere frei.

Führen Sie einen einen Zentimeter langen Schnitt durch die Peritonealwand in dieselbe Richtung wie den Schnitt durch die Dermis durch, wobei Sie den Schaft des Glasstabes als Anschlag verwenden. Drücken Sie die Niere durch die Peritonealöffnung, indem Sie auf die angrenzende Oberfläche nach unten drücken. Benetzen Sie die Oberfläche der freigelegten Niere mit eiskaltem, sterilen PBS unter Verwendung eines mit Flüssigkeit getränkten Wattestäbchens. Wiederholen Sie diesen Schritt nach Bedarf alle paar Minuten, um ein Austrocknen der Nierenkapsel zu verhindern.

Erstellen Sie mit einer 27-Gauge-Nadel einen 0,2 cm langen Schnitt durch die Nierenkapsel an der vorderen Oberfläche der Niere. Führen Sie ein flammgezogenes Glas-Kapillarrohr von der linken seitlichen Seite zur rechten seitlichen Seite ein. Führen Sie es durch den zuvor angelegten Schnitt und bewegen Sie es entlang der dorsolateralen Oberfläche der Niere in posteriorer Richtung.

Um eine Tasche zwischen Nierenkapsel und Nierenparenchym zu bilden, bewegen Sie die Ösen in der vorbereiteten 25-Milliliter-Hamilton-Spritze an den äußersten Rand der abgeschrägten Öffnung des flexiblen Schlauchs. Führen Sie dann die abgeschrägte Kante mit der nach oben weisenden Seite in die subkapsuläre Tasche ein. Die lange Kante steht dabei in Kontakt mit dem Nierenparenchym.

Bewegen Sie das Röhrchen an das hinterste Ende der Kapsel. Überführen Sie dann langsam die Ösen von dem PE-50-Röhrchen in die subkapsuläre Tasche, indem Sie den Kolben der Spritze niedertippen. Während die Ösen die Tasche füllen, ziehen Sie das flexible Röhrchen langsam zurück, um mehr Platz zu schaffen.

Nachdem das Röhrchen aus der Tasche entfernt wurde, schieben Sie die Glassonde entlang der äußeren Oberfläche der Niere von anterior nach posterior, um die Ösen vorsichtig in das proximale Ende der Tasche einzubringen. Heben Sie mit einer Pinzette mit gebogenen Armen das Peritonealepithel an, das an der für die Niere angefertigten Öffnung angrenzt. Anschließend verwenden Sie einen mit PBS getränkten Wattestäbchen, um die Niere vorsichtig zurück in die Peritonealhöhle zu schieben.

Schließen Sie die Maus, indem Sie die Bauchdecke mit Nähten und die Hautschicht mit Wundclips versorgen. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück und überwachen Sie sie. Zur Erholung sollte der Darm der Maus mit Acetominophen-Wasser versorgt werden.

C-Maus-Augen isoliert. Mit den in diesem Video beschriebenen Methoden wurde eine heilende Dosis in allogene C57BL/6-Mäuse transplantiert. Die Blutglukosespiegel ohne vorherige Nüchternphase wurden ab dem ersten Tag nach der Operation überwacht.

Die Abstoßung ist bei 20 Gramm schweren Empfängermäusen, die 300 Augen von einem allogenen Spender erhalten haben, etwa am Tag 17 zu beobachten. Die Erholung wurde bei Mäusen überwacht, die entweder 150 oder 300 Augen von syngenen Spendermäusen erhalten hatten. Bei diesen Transplantaten tritt keine Abstoßung auf, da die Augen von syngenen Spendern stammen.

Die verabreichte Augscheidungsdosis misst die primäre Funktion der Augscheidungen unmittelbar nach der Transplantation. Während bei 150 Augscheidungen eine marginale Erholung beobachtet wurde, zeigte sich eine vollständige Erholung, wenn 300 Augscheidungen transplantiert wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die kritischen Schritte zur Isolierung von Maus-Augscheidungen und deren Transplantation in den subkapsulären Raum der Niere durchgeführt werden.

Mit der Übung werden Sie die Fähigkeit entwickeln, den Ductus choledochus schnell zu kanülieren, was der schwierigste Schritt dieses Protokolls ist.