Die orale Verabreichung von Rotenon mit einem Gavage und Bildanalyse von Alpha-Synuclein Einschlüsse in den enterischen Nervensystem

Die Symptome der Parkinson-Krankheit, einschließlich motorischer und Sprechstörungen, resultieren aus einer verminderten Aktivität dopaminerge Zellen im Gehirn. Das enterische Nervensystem und die Riechbülbe sind die am stärksten exponierten Nervenstrukturen und die ersten, die betroffen sind. Die Parkinson-Krankheit wurde mit einer Exposition gegenüber Pestiziden in Verbindung gebracht.

Um die Wirkungen von Pestiziden auf das enterische Nervensystem zu analysieren, wird die Gabe des Pestizids Roone an Mäuse mittels oraler Gavage durchgeführt. Anschließend erfolgt eine intrakardiale Perfusion der Mäuse mit 4 % Paraform, Aldehyd Gehirn und enterischem Nervensystem. Das Gewebe wird entnommen, aufbereitet und mittels Immunfärbung auf Proteine, die mit der Parkinson-Krankheit (PD) assoziiert sind, untersucht.

Beta-tubulin-3- und Alpha-Synuclein-Bilder, die mittels konfokaler Mikroskopie aufgenommen wurden, zeigen die Anreicherung von Alpha-Synuclein in Neuronen des enterischen Nervensystems bei Tieren, die Pestiziden ausgesetzt waren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der systemischen Verabreichung von Rotenon besteht darin, dass mit dieser Technik sichergestellt wird, dass die Wirkung von Rotenon auf das enterische Nervensystem beschränkt bleibt. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen bei der Parkinson-Krankheit zu beantworten, beispielsweise bezüglich ihrer Ätiologie und der Mechanismen, die ihrer Progression zugrunde liegen.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose der Parkinson-Krankheit, da sie die Entwicklung neuer therapeutischer Zielstrukturen und diagnostischer Methoden ermöglichen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Pathophysiologie der Parkinson-Krankheit liefern kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise zur Untersuchung der Wirkung anderer Umweltgifte auf das enterische, sympathische und parasympathische Nervensystem sowie auf die Darmwand. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es einige Zeit braucht, um die Gavage zu beherrschen.

Die Idee zu diesen Methoden hatte ich erstmals, als ich über den Zusammenhang zwischen Pestiziden und der Parkinson-Krankheit las. Hilfreich war auch die Teilnahme an der hochkarätigen CORAS-Konferenz beim Welt-Parkinson-Kongress in Berlin im Jahr 2005. Eine friedliche Demonstration dieser Methode ist notwendig.

Die Methode zur Verabreichung von ol mittels Magensonde ist schwierig, da Mäuse im Gegensatz zu Menschen eine andere Anatomie aufweisen. Andererseits wurde die Bildanalyse mit angepassten Schritten für diese Bilder durchgeführt. Beginnen Sie das Protokoll mit dem Wiegen des Tieres. Berechnen Sie das geeignete Volumen an Rotenon.

Für jedes Gramm Körpergewicht des Tieres werden 0,01 Milliliter benötigt, was einer Dosis von fünf Milligramm pro Kilogramm Roone entspricht. Befüllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit der Roone-Lösung und anschließend eine zweite Spritze mit der Fahrzeuglösung. Nehmen Sie die Maus auf und halten Sie den Schwanz der Maus mit einer Hand fest.

Dehnen Sie die Haut des Halses, indem Sie sie mit den ersten beiden Fingern der anderen Hand nach unten ziehen. Sobald der Kopf zwischen den beiden Fingern fixiert ist, lehnen Sie ihn gegen die Handfläche und drehen ihn auf den Kopf. Fixieren Sie den Schwanz.

Unter Verwendung des vierten und fünften Fingers, wobei der Kopf nach hinten gerichtet bleibt, das Gaumendach drücken, um den Mund der Maus zu öffnen. Die Sonde vorsichtig in den Mund einführen. Die Sonde langsam in Richtung des Magens bewegen, bis ihre volle Länge eingeführt ist.

Um zu verhindern, dass Material in die Lunge gelangt, die Roone-Lösung oder das Fahrzeugmittel durch sanftes Drücken auf den Kolben verabreichen. Nach Abschluss langsam die Schlundsonde herausziehen und das Tier in einen anderen Käfig zurückbringen, bis alle Tiere aus einem Käfig behandelt sind. Nach der Behandlung werden die Mäuse intrakardial mit 4 % Paraformaldehyd perfundiert.

In PBS werden die Därme anschließend durch Dissektion gewonnen und über Nacht in 15% Sucrose gelegt. Am nächsten Tag wird das Gewebe in 30% Sucrose überführt und erneut über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Danach wird das Gewebe in einem Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank aufbewahrt, bis es verwendet wird. Mit einem Kryostat werden 20 µm dünne Darfschnitte angefertigt.

Querschnitte werden auf Objektträger übertragen, blockiert und immunhistochemisch gefärbt. Anschließend erfolgen die Immunfärbungen mit Antikörpern gegen Beta-3-Tubulin und Antikörpern gegen Synuclein. Es wird empfohlen, dass eine externe Person eine verblindete Analyse der Daten durchführt.

Um die Analyse zu beginnen, öffnen Sie die Fiji-Software. Öffnen Sie die konfokale Bilddatei. Anschließend trennen Sie die Kanäle, sodass jeder Kanal unabhängig bearbeitet werden kann.

Schließen Sie die Kanäle, die nicht verwendet werden sollen, und wählen, analysieren, setzen, skalieren Sie und stellen Sie die Pixelgröße auf eins ein. Stellen Sie die bekannte Distanz auf 0,13 ein und klicken Sie auf „global“. Die Größe des Bildes wird nun in Mikrometern angezeigt.

Wählen Sie den Alpha-Synuclein-Kanal und das Ganglion aus. Stellen Sie sicher, dass die Auswahl das Ganglion in allen Schichten umschließt. Duplizieren Sie das Bild mit dem ausgewählten Ganglion – nur ein Bild im Format des Ganglions wird dupliziert.

Drücken Sie Bearbeiten, damit der Bereich außerhalb der ausgewählten Region schwarz wird. Duplizieren Sie das Bild erneut, um die Qualität des Verfahrens zu überprüfen. Bilder mit einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis sollten nicht für die Bildanalyse verwendet werden.

Bild auswählen, Schwellenwert anpassen. Dann Maximum der Entropie auswählen. Anschließend die Schnitte im zugeschnittenen Bild und im Originalbild durchgehen, um sicherzustellen, dass der Vorgang erfolgreich war.

Die tropische Schwelle wählt einen Intensitätssignalpegel basierend auf dem Bildhistogramm aus, und nur jene Pixel mit einer Intensität oberhalb dieser Schwelle werden im Auswahlprozess in einem weiß-auf-schwarz-Bild dargestellt. Klicken Sie anschließend auf „smooth“. Dieser Schritt verwandelt die pixeligen Kanten der Bilder in glatte Kanten im Auswahlprozess.

Klicken Sie anschließend auf „Binary“ und wählen Sie „Make Binary“. Das Bild wird als schwarz-weiß-Bild angezeigt. Um den nächsten Schritt am duplizierten Bild durchzuführen, klicken Sie auf „Analyze“, „Analyze Particles“. Wählen Sie dann „Show Outlines“ aus und klicken Sie auf „Summarize“.

Der Rest der Einstellungen sollte auf den Standardeinstellungen belassen werden. Diese Funktion erkennt die Gesamtanzahl der Pixel mit Signal sowie die zusammengefasste Oberfläche der Pixel mit Signal. Zusätzlich werden die Anzahl der Pixelgruppen und die mittlere Größe gemeldet.

Vergleichen und wählen Sie die Schnittfläche mit der größten Gesamtfläche aus, die sich gut anpasst. Die Schnittfläche wird markiert. Kopieren Sie die Datentabelle mit der gesamten α-Synuclein-Oberfläche, der Anzahl der Inklusionen und der mittleren Partikelgröße.

Kopieren Sie die Daten in eine Excel-Tabelle oder dokumentieren Sie sie an anderer Stelle. Kehren Sie zu Fiji zurück. Suchen Sie die zuvor ausgewählte Schicht im Beta-Tubulin-Kanal und wählen Sie diese aus.

Wählen Sie den Ganglienbereich aus und klicken Sie auf „Analysieren“. Dann wählen Sie „Messen“. Es erscheint eine weitere Tabelle, die die Gesamtoberfläche des Ganglions anzeigt.

Extrahieren Sie die Daten aus der Tabelle in eine Excel-Tabelle in der Nähe der Alpha-Synuclein-Messung oder übertragen Sie sie an anderer Stelle mithilfe von Excel. Teilen Sie die verschiedenen Parameter, die bei der Alpha-Synuclein-Messung erhalten wurden, durch die Ganglienoberfläche, um die Gesamt-Oberfläche von Alpha-Synuclein und die Anzahl der Einschlüsse bezogen auf die Gangliengröße zu erhalten, um die lokalen Wirkungen von Rotenon am enterischen Nervensystem analysieren zu können. Fünf Milligramm pro Kilogramm des Pestizids Rotenon wurden mittels oraler Gavage an einjährige C57BL/6-Mäuse verabreicht. Das hier gezeigte Chromatogramm zeigt das Vorhandensein eines Rotenon-Peaks eine Stunde nach der Verabreichung; Kontrollmäuse wurden mit 20 Milligramm pro Kilogramm Rotenon sowie mit 5 Milligramm pro Kilogramm Rotenon behandelt.

Rotenonkonzentrationen wurden für Blut- sowie Gehirn- und Hirnstammextrakte mittels HPLC wie hier gezeigt bestimmt. Die Gabe von fünf Milligramm pro Kilogramm Rotenon über orale Gavage führt nicht zu messbaren Konzentrationen im Blut eine, zwei oder drei Stunden nach der Behandlung, wie durch HPLC ermittelt. Diese Grafik zeigt die Rotenonkonzentrationen im Gehirn und im Hirnstamm behandelte Mäuse.

Eine Stunde nach der Verabreichung von 10 Milligramm pro Kilogramm oder weniger Rotenon zeigt sich kein Rotenon in Gehirn- oder Hirnstammproben. Eine Stunde nach der Verabreichung wurde die mitochondriale Komplex-I-Aktivität in Muskel- und Gehirnproben von 1,5 Monate lang behandelten Mäusen bestimmt. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen, was auf keine Hemmung des mitochondrialen Komplex I hinweist und somit bestätigt, dass in diesen Regionen kein Rotenon vorhanden war.

Die Analyse des bei Morbus Parkinson vorkommenden, in Lewy-Körperchen enthaltenen alpha-Synucleins nach Gabe von Rone ermöglicht eine zuverlässige Bestimmung der gesamten Oberflächenmenge an alpha-Synuclein, des Vorhandenseins von alpha-Synuclein-Inklusionen sowie des alpha-Synuclein-Musters in der Zelle. Diese Abbildung zeigt Färbungen mit Anti-Beta-3-Tubulin, alpha-Synuclein und DAPI in Duodenum- und Ileum-Schnitten, wie hier zu sehen ist. Eine 1,5-monatige Behandlung mit Roach-Known induzierte ein verstärktes punktförmiges alpha-Synuclein-Muster innerhalb der Ganglien des enterischen Nervensystems, selbst im Vergleich zu dreimonatigen Kontrollen.

Dieses Muster ist sowohl im Ileum als auch im Duodenum zu beobachten. Nach einer dreimonatigen Behandlung kann mittels immunfluoreszenzchemischer Färbung unter Verwendung von Anti-Alpha-Synuclein, Theoflavin, Flavin und DPI die Bildung größerer Alpha-Synuclein-Inklusionen nachgewiesen werden, wobei sich Aggregationen größerer Alpha-Synuclein-Ablagerungen ausschließlich nach drei Monaten zeigen. Das Experiment wurde mithilfe automatischer Segmentierungs- und entropiebasierter Schwellenwertmethoden analysiert.

In dem Diagramm auf der linken Seite repräsentiert jede Säule das Gesamtverhältnis von alpha-Synuclein-Oberfläche zu Ganglienoberfläche. In dem Diagramm auf der rechten Seite steht jede Säule für die Gesamtanzahl der alpha-Synuclein-Inklusionen pro erfasster Ganglienoberfläche. Zusammen legen diese Daten nahe, dass die lokale Verabreichung von Rotenon in enterischen Ganglien die Phosphorylierung, Anreicherung und Aggregation von alpha-Synuclein sowie eine Gliose induziert. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung pro Tier innerhalb einer Minute durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Sonde vorsichtig einzuführen, und falls Hindernisse auftreten, sollte sie besser wieder entfernt und erneut unter Beachtung dieser Anleitung eingeführt werden. Andere Methoden wie HPLC, Immunfärbung und Bildanalyse können durchgeführt werden. Dies ermöglicht die Analyse weiterer Regionen, der Wirkungen der Substanz oder sogar des Vorhandenseins der Substanz im Blut nach ihrer Entwicklung.

Diese Technik ebnete den Weg für Neurowissenschaftler, die Auswirkungen von umweltbedingten Neurotoxinen auf das enterische Nervensystem zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, die Messvorrichtung korrekt anzuwenden und die Bilder aus der Immunchemie zu analysieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Verwesung äußerst gefährlich sein kann.

Daher empfehlen wir die Verwendung von Handschuhen und Masken während der Durchführung dieses Verfahrens.