Single Cell Transfektion in Hühnerembryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Zellen von Hühner-Somit oder Neuralrohren mit einem Plasmid, das das grün fluoreszierende Protein kodiert, zu injizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Mikroinjektionspipetten mit einem geeigneten Öffnungsdurchmesser der Spitze gezogen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Plasmid-Vorrat für die Injektionen vorzubereiten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Embryonen für die Injektion vorzubereiten. Der vierte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Mikropipetten mit Plasmid-DNA zu beladen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Injektion der gewünschten Gewebe.

Schließlich können Ergebnisse erhalten werden, die mithilfe der immunfluoreszenzmikroskopischen Analyse den Bereich der Derivate in der Anzahl von Zellen zeigen, die von einzelnen markierten Vorläuferzellen in ausgewählten Teilbereichen des Somiten und des Neuralrohrs erzeugt wurden. Hallo, ich bin Rael aus dem Labor von Professor Heim am Department für Medizinische Neurobiologie der Hebräischen Universität Jerusalem. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Injektion einzelner Zellen in Hühnersomite und Neuralrohre.

Wir verwenden dieses Verfahren im Labor, um die Linientrennung von somitischen und Neuralrohrzellen zu untersuchen. Beginnen wir also damit, einzelne transfizierte Zellen in Hühnerembryonen zu erzeugen, indem zunächst Mikropipetten gezogen werden. Wir ziehen unsere Pipetten auf einem standardmäßigen Naga PP 83-Pipettenzieher mit einer Heizeinstellung von 13,5.

Die genaue Einstellung muss kalibriert werden, um einen Pipettenspitzen-Durchmesser zwischen acht und 10 Mikrometern zu erreichen. Wir verwenden Filament mit Boris-Silikatglasröhrchen mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter und einem Innendurchmesser von 0,75 bis 0,78 Millimetern. Sie können auch kommerziell erhältliche Mikropipetten verwenden, die kein Filament besitzen und einen Außendurchmesser von einem Millimeter sowie einen Innendurchmesser von 0,75 Millimetern aufweisen.

Die vorbereiteten Pipetten werden in einer Plastikschale aufbewahrt, wobei die Spitzen vor Kontakt mit dem Rand der Schale geschützt sind. Um die DNA für die Mikroinjektion vorzubereiten, wird das gewünschte Plasmid in DH fünf alpha e coli transfiziert. Am folgenden Tag wird das Plasmid mithilfe standardisierter Verfahren unter Verwendung eines Maxi-Präp-Kit gereinigt. Für nicht-klonale Injektionen verwenden wir eine DNA-Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter.

Für Experimente, bei denen einzelne Klone gewünscht sind, muss die Plasmidkonzentration deutlich niedriger sein und angepasst werden. Für P-C-A-G-G-F-P-A eignet sich eine Konzentration von 0,05 bis 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter. Sobald die optimale Konzentration bestimmt wurde, empfehlen wir, den gesamten gereinigten Plasmidbestand auf eine vorab festgelegte Konzentration zu verdünnen, anstatt einzelne Präparationen separat anzupassen.

Letzteres könnte aufgrund von Unterschieden in der Reinheit und anderen Parametern, wie dem Anteil an Supercoiled-Plasmid, zu einer gewissen Varianz der Erfolgsraten führen, um Eizellen für die Mikroinjektion vorzubereiten. Hühnereier, die bis zum gewünschten Entwicklungsstadium inkubiert wurden, während sie auf ihrer langen Achse lagen, werden mit 70 %igem Ethanol abgewischt und zum Trocknen abgestellt. Danach wird die spitze Eiende mit einer chirurgischen Schere angebohrt. Mit einer 10-Milliliter-Spritze und einer 19-Gauge-Nadel werden zwei Milliliter Albumin aus dem Ei abgesaugt und die Löcher vor der Injektion mit heißem Paraffin verschlossen.

Verwenden Sie chirurgische Scheren, um am oberen Ende der Eierschale ein Fenster zu öffnen, um zu verhindern, dass Schmutzpartikel in das Loch gelangen. Legen Sie ein Stück Klebeband über das Fenster und schneiden Sie ein Loch hindurch. Um das Embryo besser sichtbar zu machen, verwenden Sie eine am Aspirator befestigte, über der Flamme ausgezogene Kapillare, um eine ungiftige Tinte wie Pelican 17 unter das Blastoderm einzuspritzen.

Als Nächstes gelangen Sie zum Embryo, indem Sie die vitale und/oder amniotische Membran mit 0,14 Millimeter dicken Insektennadeln, die auf einem Nadelhalter befestigt sind, durchtrennen und beiseiteschieben, um die DNA in die gezogene Pipette Eloqua zu laden, und geben mithilfe des Kapillarrohrs eine kleine Menge Fast-Green-Pulver hinzu. Ziehen Sie eine geringe Menge des Plasmids mittels einer Kapillare geeigneten Durchmessers an einem Aspirator auf. Führen Sie diese dann in das Ende der Pipette ein, das dem geschliffenen Ende gegenüberliegt, und laden Sie die DNA so nah wie möglich an das geschliffene Ende heran.

Befestigen Sie als Nächstes die Pipette an einem manuellen Luftdruckinjektor, der auf einem Mikromanipulator montiert ist. Geben Sie gegebenenfalls eine minimale Menge an Druck ab, damit die Plasmidlösung die Pipettenspitze erreicht. Führen Sie die Pipette unter Anwendung etwas Luftdrucks, um ein Verstopfen der Pipettenspitze zu verhindern, in das flüssige Medium des Eies ein.

Nachdem die relevante Gewebedomäne durchstoßen wurde, reicht die Druckänderung oft aus, um das Plasmid mit sichtbarem Fast Green freizusetzen. Falls dies nicht eintritt, üben Sie leichten Druck auf die Spritze aus, bis die Plasmid-Fast-Green-Mischung ausgestoßen wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang entlang der Achse des Embryos; gegebenenfalls kann injiziertes PBS hinzugefügt werden.

Schließlich das Fenster mit Klebeband verschließen und die Eier zurück in den Inkubator stellen. Eine Belüftung vermeiden und kleine Wasserbehälter in den Inkubator stellen, um die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten und die Ausbeute zu erhöhen. Wenn die Zielstelle der Injektion oberflächlich genug war, um leicht erkennbar zu sein, beispielsweise in den dorsalen Somiten, dem Neuralrohr oder dem Ektoderm, kann die Erfolgsrate des Experiments durch eine Ganzpräparatbeobachtung mit einem fluoreszierenden Binokularmikroskop bestimmt werden.

Dieser Schritt ist besonders hilfreich, um zu beurteilen, ob zu viele oder zu wenige Zellen markiert wurden. Falls eine weitere Inkubation gewünscht ist, nach der Betrachtung antibiotikahaltige PBS-Lösung zum Ei geben und das Deckband ersetzen. Außerdem kann die Erfolgsrate der Injektion beurteilt werden, indem die Embryonen seriell geschnitten und eine Immunhistochemie durchgeführt wird.

Nach vier Stunden oder mehr werden die Embryonen nach der Injektion fixiert und für die Paraffinschnitttechnik aufgearbeitet. Die auf Glasobjektträgern montierten Schnitte werden anschließend entparaffiniert und für die Immunfärbung vorbereitet; Verfahren zur Signalverstärkung wie das Biotin-Streptavidin-System können zweckmäßig sein. Schließlich werden die Serienschnitte untersucht, um markierte Zellen in den injizierten Segmenten nachzuweisen.

Wenn bei den ersten Versuchen mehrere statt einzelner Zellen erhalten werden, muss die Plasmid-Lösung verdünnt und der Vorgang so lange wiederholt werden, bis adäquate Ergebnisse erzielt werden. Üblicherweise führen wir eine einzelne Injektion von P-C-A-G-G-F-P pro Milbe durch, wobei wir sechs bis zwölf Segmente pro Embryo anvisieren. Unter diesen Bedingungen kann acht Stunden nach der Injektion bei mindestens einem Segment in einem von zehn Embryos ein deutliches Signal mittels Ganzpräparat-Beobachtung detektiert werden.

In diesem Beispiel wurde ein Somit mit einem Plasmid, das GFP kodiert, injiziert, und fünf Stunden später ist in der hier gezeigten Ganzpräparataufnahme des Embryos eine einzelne fluoreszierende Zelle zu beobachten. Wird 24 Stunden nach der Injektion in den zentralen Somit betrachtet, ist in einem zwei Tage nach der klonalen Injektion präparierten Embryo ein Klon fluoreszierender Zellen zu sehen. Die Schnittaufnahme dieses Segments zeigt das Vorhandensein klonaler Nachkommen sowohl in der Dermis als auch im Muskelgewebe, was belegt, dass einzelne Vorläuferzellen beide Ableitungen hervorbringen.

Wie bei Somiten können auch einzelne neuroepitheliale Vorläuferzellen im dorsalen Neuralrohr impaliert werden, wie in diesem Querschnitt veranschaulicht, der fünf Stunden nach der Injektion aufgenommen wurde. Eine serielle Schnittanalyse ergab, dass klonale Transfektionen erreicht wurden, wenn die Erfolgsrate etwa 10 % betrug. Dies bedeutet, dass die Technik per Definition sehr ineffizient ist, um Klonalität zu erzielen. Unter diesen Bedingungen stellte sich jedoch heraus, dass mehr als 93 % der positiven Markierungsereignisse klonal waren.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Einzelzellen von Hühnerembryonen injiziert, wenn man dieses Verfahren durchführt. Es ist wichtig, eine große Menge an Plasmidstammlösung auf eine ideale Konzentration für Einzelzellinfektionen zu verdünnen und diese dann während Ihrer Experimente zu verwenden. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.