Visualisierung der mitochondrialen DNA-Replikation in einzelnen Zellen von Edu Signalverstärkung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die M-T-D-N-A-Replikation in kultivierten Neuronen zu markieren und sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem die Neuronen zunächst zwei bis 24 Stunden mit dem Thymidin-Analogon EDU inkubiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das EDU, das ein Alkin enthält, durch eine kupferkatalysierte kovalente Reaktion mit dem fluoreszierenden Orgon Green 488-Azid zu markieren.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Orgon-Grün-Signal mit einem Aramid-Signalverstärkungsschritt zu verstärken, um die in die neu synthetisierte mtDNA eingebaute EDU sichtbar zu machen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die mtDNA-Replikation in spezifischen subzellulären Kompartimenten von Neuronen durch die Kombination der Click-EDU-Chemie und der anschließenden Signalverstärkung zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der BRDU-Markierung liegt darin, dass die EDU-Markierung einfacher und schonender ist und dadurch zusätzliche immunfluoreszenzbasierende Färbungen neuronaler Marker ermöglicht.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen zur Regulation der Anzahl von Mitochondrien beantworten, beispielsweise wie Neuronen wechselnden Energiebedarf in ihren subzellulären Kompartimenten decken, einschließlich Zellkörpern, Axonen, Dendriten und synaptischen Endigungen. Somit kann diese Methode Einblicke in die Mechanismen gewähren, die der Pathogenese mehrerer mitochondrienerkrankungsbedingter neurologischer Erkrankungen zugrunde liegen, darunter Neuropathie und Neurodegeneration. Doch wichtig ist, dass sie auch auf andere Systeme angewendet werden kann, bei denen Veränderungen der Kopienzahl der mitochondrialen DNA wahrscheinlich der Pathogenese des Krankheitszustands zugrunde liegen, einschließlich Arzneimittelt oxizität, Krebs und Alterung.

Dieses Video zeigt, wie neu synthetisierte mitochondriale DNA, abgekürzt mtDNA, in Wurzelhautganglien-Neuronen markiert wird, die auf sterilen 12-Millimeter-Glas-Deckgläsern kultiviert wurden. In einer 24-Loch-Kulturplatte wird der 10-Millimolar-Stammlösung von 5-Ethynyl-2′-desoxyuridin, abgekürzt EdU, aus dem Click-iT EdU-Mikroplatten-Assaykit im Verhältnis 1:100 in Kulturmedium verdünnt, um eine 10× EdU-Stammlösung herzustellen. Die 10× EdU-Stammlösung wird anschließend direkt in das Medium jedes Wells gegeben. Die behandelten Neuronen werden dann zwei bis 24 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid in einem Abzug inkubiert.

Fixieren Sie die Neuronen für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur in 2 % Paraformaldehyd. Waschen Sie zweimal in 1× PBS, wobei jeder Waschschritt zwei bis fünf Minuten dauert. Die fixierten Neuronen können bis zu einem Monat lang in frischem 1× PBS bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden.

Bereiten Sie eine feuchte Kammer wie im begleitenden Text beschrieben vor. Verwenden Sie feine Pinzette, um 28 fixierte Deckgläser, einschließlich positiver und negativer EDU-Kontrollen, auf Blätter aus hydrophober Paraform M in der feuchten Kammer zu übertragen. Geben Sie erneut 200 bis 300 Mikroliter einer XPBS-Lösung auf, um die Oberfläche jedes Deckglases zu bedecken.

Bereiten Sie das Click-it-Assay-Kit gemäß der Beschreibung im Text und den Herstelleranweisungen vor, um mitochondriale DNA in 75 bis 80 Mikroliter einer permeabilisierenden Lösung, die 0,1 % Tritton X in 1× PBS enthält, pro Deckglas zu markieren. Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Pipettenspritzbirne mit einer 200-Mikroliter-Spitze am Ende, um die Flüssigkeit vorsichtig zu entfernen, ohne die Zellen zu verlieren.

Benutzen Sie eine Pipettenspitze, um die Decke vorsichtig zu überfluten. Spülen Sie mit 200 bis 300 Mikrolitern einer XPBS-Lösung, um die vorherige Lösung gründlich zu entfernen. Spülen Sie jede Decke zweimal.

Pipettieren Sie 75 bis 80 Mikroliter frisches 1 % Wasserstoffperoxid in 1× PBS auf jedes Deckglas. Inkubieren Sie abgedeckt 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu hemmen. Waschen Sie zweimal mit 1× PBS wie zuvor beschrieben und bereiten Sie frisch das Click-Reaktionscocktail gemäß dem begleitenden Text vor.

Pipettieren Sie die Probe mehrmals auf und ab, um sie zu mischen. Vortexen Sie die Neuronen nicht. Fixieren Sie die Neuronen mit 75 bis 80 Mikrolitern Click-iT EDU-Fixiermittel pro Deckglas und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Während der Nachfixierung verdünnen Sie die Reaktionsmischung mit einem gleichen Volumen Click-iT EDU-Fixiermittel.

Fügen Sie das Reaktionsgemisch zu jedem Deckglas hinzu, um es vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie es 25 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Reaktionsgemisch vorsichtig und waschen Sie zweimal mit verdünntem 1×-Blockierpuffer unter einem epifluoreszierenden Mikroskop. Überprüfen Sie nach Abschluss der EDU-Färbung die Orgon-Grün-Färbung in den Kernen.

Beginnen Sie die Signalverstärkung für Termiten oder TSA, indem Sie 1 % TSA-Blockierungslösung zu jedem Deckglas geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie kurz die Antikörper-Stammlösung gegen grünes Horsenradish-Peroxidase-Konjugat, die zwei bis 24 Stunden im Voraus vorbereitet wurde; verdünnen Sie den primären Antikörper im Verhältnis 1:300 in TSA-Blockierungslösung und mischen Sie durch Vorsichtiges Invertieren oder Pipettieren; vermeiden Sie Wirbelbildung. Geben Sie 75 Mikroliter auf jedes Deckglas, inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag dreimal mit jeweils einem XPBS bei Raumtemperatur spülen. Die Deckgläser zur zusätzlichen Entfernung nicht gebundener primärer Antikörper in der letzten Waschung weitere 30 bis 60 Minuten inkubieren. Die IDE-Reaktion unmittelbar vor der Anwendung gemäß dem Textteil dieses Protokolls vorbereiten.

Die Deckgläser 15 Minuten bei Raumtemperatur mit der IDE-Reaktion inkubieren. Dreimal mit jeweils einem XPBS waschen und bei der letzten Wäsche 30 bis 60 Minuten inkubieren, wie zuvor unter dem Mikroskop. Auf MT-DNA-Färbung prüfen; erfolgreich gefärbte Neuronen auf Objektträgern mit einem ANTIFA-Einbettmedium, das DPI enthält, wurden hier abgebildet. Dargestellt sind repräsentative Differentialinterferenzkontrast-Aufnahmen von embryonalen und adulten Neuronen des dorsalen Wurzelganglions, die typischerweise für die Analyse verwendet werden.

Diese schematischen Diagramme veranschaulichen das Verfahren zur Markierung von EDU in mtDNA mit einem grünen fluoreszierenden Signal. Mitotisch aktive F11-Neuroblastomzellen dienen als positive Kontrolle und zeigen das Markierungsmuster von EDU, das in nukleäre und mitochondriale DNA eingebaut wurde, in diesen repräsentativen Fluoreszenzbildern, die über Hellfeldaufnahmen gelegt sind. Die grünen punktförmigen Signale zeigen das verstärkte EDU-Signal, das in die neu synthetisierte mtDNA sowohl embryonaler als auch adulter Neuronen des dorsalen Wurzelganglions eingebaut wurde.

Das EDU-Markierungsverfahren ermöglicht anschließende immunfluoreszenzfarbliche Färbungen neuronaler Marker wie Neurofilament in Rot. Diese schematischen Abbildungen veranschaulichen das Verfahren zur Markierung von EDU und mtDNA mit einem roten fluoreszierenden Signal. Mitotisch aktive F11-Neuroblastomzellen dienen als positive Kontrolle und zeigen das Markierungsmuster von EDU, das in nukleäre und mitochondriale DNA eingebaut wurde.

Dieses schematische Diagramm zeigt das Verfahren zur Markierung von BRDU in neu synthetisierter M-T-D-N-A mit einem grünen oder roten fluoreszierenden Signal. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Kontrollen mit mitotisch aktiven Zellen durchzuführen, um eine erfolgreiche EDU-Markierung und Zellkerne zu überprüfen, bevor mit den Amplifikationsschritten zur Visualisierung der MT-DNA-Markierung fortgefahren wird. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Standard-Immunfluoreszenz angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die mitochondriale DNA-Synthese in spezifischen Subpopulationen von Neuronen oder neuronalen Kompartimenten reguliert wird. Aufgrund ihrer Entwicklung wird diese Technik es Forschern im Bereich der Neurobiologie ermöglichen, die Regulation der Mitochondrienanzahl in Kulturmodellen sowohl der normalen Physiologie als auch von Kulturmodellen, die eine beeinträchtigte Erkrankung simulieren, zu untersuchen.

Neurologische Zustände.